אנו אסירי תודה על התמיכה מעוזרי תואר ראשון במהלך הגידול לעבודה זו, במיוחד רג'ינה קורנדינה, ריאה סמיקלסקי. קרולין קלינובסקי סייעה לחבר ספרות על רעילות מתכות בלפידופטרות אחרות. עבודה זו התאפשרה הודות למענק מחקר קיץ של המחלקה לאקולוגיה, אבולוציה והתנהגות באוניברסיטת מינסוטה.

גידול מלאכותי ועמידות למתכות כבדות בפרפרים לבנים מכרוב

למחברים אין ניגודי עניינים להצהיר.

במחקר זה, פרפרים לבנים מכרוב (Pieris rapae) גודלו על תזונה מלאכותית כדי לבחון הבדלים ברעילות מתכות כבדות. בעשותו כן, מחקר זה מספק שיטות כלליות לגידול ומחקרי מעבדה של מערכת פרפרים קלה למניפולציה זו. דיון זה בוחן תחילה שאלות כלליות יותר על השיטות שנסקרו כאן, ולאחר מכן סוקר את הממצאים המדעיים שלנו לפני שהוא מסיים בהרהורים על מרכיבי התזונה המלאכותית.
הפרוטוקול הנסקר כאן נותן שלבים של שיטת גידול כללית לפרפרים לבנים כרוב, אך ישנן נקודות רבות בתוך פרוטוקול זה שניתן לשנות. לדוגמה, בעוד שמקרה המבחן המוצג כאן משתמש בספוגים להאכלה, לחוקרים אחרים היה מזל עם פתיליות שיניים ופרחי משי מלאים במי דבש5. בעוד המחקר הנוכחי משתמש במי דבש כמזון, חוקרים אחרים השתמשו בתמיסות סוכר ואפילו Gatorade. אם יש צורך לשקול גלמים, או להעביר אותם לתנאים אחרים להופעתם (למשל, גרימת דיאפאוזה וצורך לאחסן קר במשך חודש אחד), החוקר יכול בקלות להסיר אותם מהכוסות על ידי התזת אותם במים כדי להרטיב את אביזרי המשי שלהם ולתפוס אותם עם מלקחיים נוצות, ואז לתלות אותם מחדש באמצעות סרט דו-צדדי. אם החוקרים זקוקים לגמישות רבה יותר במונחים של העברת פרפרים בוגרים לכלובים לצורך התנהגות בוגרת, ניתן להחזיק אותם במקרר במשך מספר שבועות, אך יש להאכיל אותם. כל כמה ימים יש להוציא את הפרפרים כדי להאכיל אותם בתמיסת מי דבש מדוללים. תחת תאורה פנימית, זה יכול להיעשות על ידי שימוש בסיכה כדי לפתוח את החוטם שלהם לתוך האוכל. בצד הביצועים של המבוגרים, ניתן לנקוט במגוון רחב של אמצעי כושר על פרפרים לבנים כרוב. ניתן למדוד את גודל הגוף כמסה הרטובה או היבשה של הזחלים בשלבים מסוימים, הגלמים או הבוגרים (שהוקרבו או הוחזקו במעטפות זכוכית), או באמצעות מדידת אורך הכנפיים בתוכנית ImageJ (ראו 12,24,25,28). ניתן למדוד את אורך החיים של נקבות באמצעות איסוף ביצים יומי על צמחים פונדקאים 25,69,70, וניתן למדוד את גודלן של תכונות ספציפיות כמדד לביצועים; לדוגמה, המסה או הנפח של המוח או אזורי מוח בודדים 62,71,72, או המסה או תכולת החלבון של בית החזה או שריר התעופה 62,70. לבסוף, ניתן להשתמש במבוגרים במחקרים התנהגותיים כדי לבחון מספר רב של שאלות הבוחנות את ההשפעה של מניפולציה תזונתית על ליקוט מזון או בחירת אוביפוזיציה27,73.
אם פרוטוקול הגידול אינו פועל כצפוי, יש לפתור כמה היבטים. ראשית, ניתן לשאול האם רמות האור גבוהות מספיק כדי לעורר התנהגות נורמלית של מבוגרים. בעוד שקווים מותאמים למעבדה של פייריס יטילו ביצים תחת אור פלואורסצנטי, האור המלאכותי היחיד שעובד עבור קווים מסוג בר הוא אורות חממה חזקים בעלי ספקטרום רחב. אור טבעי בחממות, אדן החלון או בחוץ פועל בצורה הטובה ביותר כדי לעורר התנהגות הזדווגות והטלת ביצים. שנית, אם ביצים אינן בוקעות או אם הזחלים מתים בשלב מוקדם בהתפתחות, יש כמה דברים שיש לקחת בחשבון. החומר הצמחי המארח חייב להיות אורגני, וציין כי צמחים "אורגניים" מחנויות מטופלים לפעמים בכימיקלים שיכולים להרוג זחלים, כך שגידול צמחים פונדקאים הוא לעתים קרובות הטוב ביותר. אם שיעור הקבלה של הפונדקאי נמוך יותר, ניתן לנסות עלים צעירים יותר עם תכולת חנקן גבוהה יותר, להציג עציצים במקום עלים בודדים ולהבטיח הזדווגות של נקבות. הנקבות יקבלו זריעת ברסיסיקה, אפילו נבטים קטנים בני שבועיים. שיטת הפרפין פועלת היטב להעברת ביצים לתנאים שונים, אך יש לציין כי שיעור הקבלה נוטה להיות נמוך יותר מאשר צמחים שלמים. שלישית, כל מרכיבי הדיאטה חייבים להיות באיכות גבוהה ולא פג תוקפם. שמן זרעי פשתן יש להחליף מדי שנה ולאחסן במקרר24,25. נבט חיטה, תערובת ויטמינים, אנטיביוטיקה צריך גם להישמר מגניב. רביעית, אפשר לשקול לשנות את מערך כוסות הדיאטה. ניתן להשתמש בכל סוגי כוסות הפלסטיק החד-פעמיות לגידול, החל מאונקיה אחת ועד 15 אונקיות. מצאנו כי 4 אונקיות הוא גודל טוב כדי לאפשר הופעה בוגרת ונארז יפה לתוך תאי האקלים שלנו. חורים שננעצים בעפעפיים מאפשרים זרימת אוויר, אבל יותר מדי חורים יכולים לייבש את התזונה בתנאי לחות נמוכה, ולכן ייתכן שיהיה צורך להתאים את המספר הזה. חמישית, ייתכן שיהיה צורך להתאים את התנאים בתא האקלים בשילוב עם תנאי הגביע. אם התנאים יבשים מדי, צמחים פונדקאים עם ביצים עשויים להתייבש לפני שניתן להעביר את הזחלים, וכוסות עם תזונה עשויות להתייבש לפני הופעת הפרפרים. מצד שני, אם התנאים רטובים מדי, הכוסות יכולות להכיל עובש ומחלות. ייתכן שהחוקרים יצטרכו להתאים את זרימת האוויר בכוסות באמצעות מכסי רשת, או פחות או יותר חורים בעפעפיים. בעיה נפוצה נוספת היא אורות התא הבהירים מספיק כדי לגרום לתנודות טמפרטורה בכוסות ולהצטברות של עיבוי; שימוש בנורות עמעם הוא אפשרות קלה לגידול זחלים.
באשר לשאלות המחקר במאמר זה, מחקר זה מצא כי לבנים כרוב היו רגישים יותר לנחושת מאשר לניקל או אבץ. לנחושת היו השפעות שליליות משמעותיות על זמן הפיתוח בריכוזים נמוכים של עד 50 ppm (איור 3 וטבלה 3) ועל הישרדות ב-500 ppm (איור 4, טבלה 4). לעומת זאת, לא היו השפעות שליליות של ניקל על הישרדות (עד 500 ppm; איור 3) או השפעות שליליות על זמן הפיתוח של 100 ppm (איור 4). חלבוני כרוב היו די סובלניים לאבץ, עם השפעות הישרדות שנצפו רק ב-1,000 ppm (איור 3) והשפעות שליליות על זמן ההתפתחות החל מ-100 ppm (איור 4). בהתבסס על ריכוזים גבוהים יחסית של אבץ ברקמת הפרפר ובחרדל (הצמח המארח שלהם; איור 1), היה צפוי לראות סבילות גדולה יחסית לאבץ. אולם הרגישות לנחושת והסבילות לניקל היו מעט בלתי צפויות בהתחשב ברמות הנמוכות מאוד של ניקל ברקמת הפרפר (איור 1) והצורך בנחושת כמיקרו-נוטריאנטים. ממצאים בלתי צפויים אלה יידונו להלן לאחר בחינת הסבילות של מתכות אלה בפרפרים ועשים אחרים.
כדי להשוות את הנתונים הנוכחיים עם רגישות המתכות שנמדדו בלפידופטרות אחרות, נאספו נתונים ממחקרים קיימים על הריכוז המינימלי, שבו מתכות כבדות השפיעו לרעה על הישרדות 49,50,51,56,63,64,65,66,67,68; מחקרים אלה התמקדו בעשים, במיוחד מיני מזיקים (Galleria mellonella, Lymantria dispar, Plutella xylostella, Spodoptera sp). כל ערכי הרגישות שנמדדו במחקר הזה קרובים לטווח שנמדד עבור המינים האחרים האלה (איור 5). עם זאת, נראה כי מדד הסבילות לניקל במחקר זה גבוה מהצפוי – בעוד שלא הייתה השפעה משמעותית של הישרדות ב-500 ppm, המחקר הקודם על Pieris rapae מצא גם סבילות גבוהה מאוד לניקל (השפעות משמעותיות החל מ-1,000 ppm56), למרות רמות נמוכות ברקמה שלהם באופן טבעי (איור 1). נראה כי מדד הרגישות לנחושת במחקר זה נמצא גם בקצה הנמוך ביותר עבור מחקרים על לפידופטרה. בעוד ששימוש בתזונה מלאכותית מאפשר השוואה נוחה ומבוקרת של רגישות יחסית למתכות, חשוב לציין כי רכיבי התזונה עלולים לשנות את מדידת הרגישות האבסולוטית למתכות. לדוגמה, ויטמין C בתזונה יכול לקזז עקה חמצונית הנגרמת על ידי מתכות74, או אנטיביוטיקה בתזונה יכולה לשנות את כל ההשפעות של חיידקים על עיבוד של מתכות75. קו מעניין של מחקר עתידי יהיה לבצע מניפולציה שיטתית של רכיבי תזונה כאלה כדי לבחון השפעות על רעילות מתכות, במיוחד בהתחשב בשאלות על התפקיד התפקודי של חיידקי המעי לפידופטרן 76,77 ורכיבי צוף שעשויים להיות בעלי תכונות נוגדות חמצון78. בנוסף, שונות בדרישות התזונתיות בין מינים שונים יכולה להפוך את ההשוואות הבין-ספציפיות למאתגרות, ויש להשלים שיטות מבוססות תזונה מלאכותית עם מניפולציות של צמחים מארחים.
פרפרים אלה סובלניים במיוחד לניקל ורגישים לנחושת. מחקרים קודמים ציינו כי צמחים רבים ממשפחת החרדל, הכוללת צמחים המועדפים על ידי Pieridae, צוברים ניקל יתר על המידה כמנגנון הגנה מפני אוכלי עשב 55,56,63,79,80,81. הצטברות היתר הזו היא יותר מ-1,000 ppm ברקמת הצמח, שהיא בסדר גודל גדול יותר ממה שנראה ברוב הצמחים (איור 1). ייתכן כי לפיריס יש סיבולת גבוהה במיוחד לניקל בשל ברירה בעבר על ידי מצברי ניקל כאלה, כפי ששיערו בעבר26. בעוד נחושת נחקרה לעתים רחוקות יותר כמיקרו-נוטריאנטים בתזונת חרקים, יש כמה ראיות לכך שהיא ממלאת תפקיד קטן ברבייה ובחסינות, אם כי בעיקר בחרקים הניזונים מדם (למשל, 82,83). ייתכן שנחושת ממלאת תפקיד פיזיולוגי פחות חשוב בפרפרים מאשר אצל בעלי חיים אחרים 84,85,86, דבר העולה בקנה אחד עם עבודות עדכניות המדגישות כיצד נחושת עשויה להיות מזהמת חרקים כמו עופרת, קדמיום וכספית (למשל, 87,88,89). בעוד שפיריס הוכח כמונע זיהום נחושת ברמות נמוכות90, הניידות של נחושת בצמחים (למשל, מעבר לעלים ופרחים) סימנה אותה גם כמזהם מתכתי מדאיג91.
בעוד שתוצאות אלה מספקות נתונים מעניינים על הרעילות היחסית של מתכות אלה לפרפרים לבנים כרוב, מאמר זה שואף גם להיות בשימוש כללי כהמחשה חזותית מפורטת של שיטות לגידול מערכת רבת עוצמה זו. לבני כרוב קלים לגידול ולתמרון בניסויי מעבדה מבוקרים 4,5 המאפשרים מחקרים של חיפוש פונדקאי 6,7,8, ליקוט מזון 9,10,11 וברירה מינית12,13,14. היכולת לגדל פרפרים אלה על תזונה מלאכותית היא המפתח ליצירת תנאי גינה נפוצים להשוואות ולתפעל חומרים מזינים, רעלים ואפילו צמחים פונדקאים חדשים. עם זאת, חשוב לציין כי תזונה מלאכותית זו אינה בהכרח התזונה המלאכותית האופטימלית עבור מין זה, וסביר להניח שניתן לשפר אותה באמצעות מניפולציות עתידיות. לדוגמה, תערובת המלח בתזונה זו (ובדיאטות לפידופטרניות אחרות) פותחה במקור עבור בעלי חוליות ויש לה רמות סידן גבוהות יותר ממה שרוב החרקים זקוקים לו92,93. לכן, חלק ממאמצי הגידול שלנו יצרו תערובות מלח מותאמות אישית עם רמות סידן נמוכות יותר (למשל, 62), ואחרים עושים שימוש ב"תערובת המלח של בק", שעשויה להתאים יותר למיני חרקים רבים94. במניפולציות שלנו, מצאנו גם שהפרפרים הפגינו ביצועים טובים יותר עם פחות נבט חיטה יחסית ויחסית יותר תאית בהשוואה לריכוזים המקוריים4. תחום אחד הזקוק לתשומת לב נוספת הוא מקור השומנים והריכוז בתזונה. לדוגמה, עבודות קודמות הראו כי המעבר משמן פשתן (המשמש במחקר זה) לפוספוליפידים הגביר את שיעורי ההזדווגות ואת שיעורי הצמיחה של Pieris על דיאטות מלאכותיות95. תוספת של חומצות שומן ספציפיות בתזונה מלאכותית עשויה להיות בעלת השפעות חיוביות נוספות96,97. אופטימיזציה של התזונה המלאכותית של Pieris98,99 יוצרת הזדמנויות לענות על שאלות מעניינות על אקולוגיה תזונתית 100,101,102, אקולוגיה אבולוציונית ואקוטוקסיקולוגיה. גישות תזונה מלאכותית אלה מאפשרות לחוקרים לענות על שאלות לגבי תפקידם של שומנים ספציפיים באבולוציה קוגניטיבית 103, טרום הסתגלות לרעלים28, רכיבים תזונתיים המפחיתים את רעילות המזהמים 104, או אינטראקציות סטויכיומטריות בין חומרים מזינים105.

פרפר לבן כרוב קטן (שם מדעי: Pieris rapae, להלן "כרוב לבן") הוא מין מזיק קוסמופוליטי של גידולי חרדל, כגון כרוב, ברוקולי וקנולה 1,2,3. יחד עם זאת, לבן הכרוב הוא מערכת רבת עוצמה למחקר בביולוגיה ומודל פרפרים נפוץ, שכן ניתן לגדל ולתפעל אותם בקלות בניסויי מעבדה מבוקרים 4,5. מחקר על פרפרים לבנים מכרוב סיפק תובנות קריטיות ביחס לחיפוש פונדקאי 6,7,8, שימוש במשאבי צוף9,10,11, בחירת בני זוג וברירה מינית 12,13,14, התפתחות ואבולוציה של תבניות כנפיים15,16,17, ותגובות לחידושים ולשינויים סביבות18,19. רבות מהתובנות הללו מסתמכות על העובדה שניתן לגדל לבנים מכרוב על תזונה מלאכותית 4,20,21, אשר ניתן לתמרן במדויק כדי לשקף תנאים תזונתיים ירודים 22,23, רמות זיהום רלוונטיות לסביבה 24,25,26,27, או מעברים לצמחים מארחים חדשים 28,29. המחקר הנוכחי משתמש בניסוי על חשיפה למתכות כבדות כדי להדגים שיטות בסיסיות לגידול פרפרים לבנים כרוב על תזונה מלאכותית במעבדה ומדדי ביצועים מרכזיים של זחלים ובוגרים. היבטים רבים של שיטות אלה חלים על פרפרים אחרים30,31 ועש32,33,34 שניתן לגדל על תזונה מלאכותית.
במאמר זה, ניסוי על סובלנות מתכות משמש כדי להמחיש את השיטות הכלליות של גידול פרפרים לבנים כרוב. מתכות כבדות הן מזהם אנתרופוגני נפוץ הנובע מהתפרקות של מוצרים אנושיים, תהליכים תעשייתיים וזיהום ישן משימוש היסטורי בחומרי הדברה, צבעים ומוצרים אחרים35,36,37,38. מתכות כבדות רבות, כולל עופרת, נחושת, אבץ וניקל, יכולות לעבור מאדמה ומים לרקמת צמח 39,40,41,42, ומתכות באבק יכולות לשקוע על עלי צמח 43,44,45, וכתוצאה מכך נתיבי חשיפה מרובים לזחלי חרקים פיטופגיים. חשיפה למתכות כבדות בשלב מוקדם בחיים יכולה להיות בעלת השפעות שליליות על התפתחות בעלי חיים, במיוחד על רקמות עצביות, ורמות גבוהות יכולות להיות קטלניות 35,36,46,47,48. מספר מחקרים הראו את ההשפעות השליליות של חשיפה למתכות על חרקים מתפתחים, כולל מזיקים וחרקים מועילים 49,50,51. מספרם הרב של מזהמי המתכות הכבדות, והעובדה שלעתים קרובות הם מופיעים יחד בסביבות אנושיות52, פירושם שיש צורך בשיטות מעבדה מדויקות שבהן חוקרים יכולים לחשוף חרקים מתפתחים לרמות שונות ולשילובים שונים של מתכות מגוונות כדי להבין ולמתן את ההשפעות הסביבתיות שלהם.
העבודה הנוכחית מנגידה את ההשפעות של מתכות נפוצות על הישרדות והתפתחות של כרוב לבן, תוך התמקדות בנחושת (Cu), אבץ (Zn) וניקל (Ni), שלושה מזהמים נפוצים בסביבות אנושיות. לדוגמה, מזלגות מצידי הדרכים הכפריים של מינסוטה מכילים עד 71 עמודים לדקה Zn, 28 ppm Cu ו- 5 ppm Ni53. ניסוי זה מתפעל את רמות המתכות הללו בתזונה מלאכותית של פרפרים לבנים מכרוב ברמות התואמות לרמות הנראות בסביבה ואף עולות עליהן. משתמשים בתזונה מלאכותית כדי להשוות את הרעילות היחסית של מתכות אלה, ולחזות כי לבנים מכרוב יהיו רגישים יותר למזהמי מתכות שאינם חלק אינטגרלי מהפיזיולוגיה שלהם (ניקל) ביחס לאלה המתרחשים, אם כי ברמות קטנות, באנזימים וברקמות (נחושת ואבץ; איור 1). לכל אורכו, טקסט זה מספק פרטים מתודולוגיים והדמיות וידאו נלוות כדי להמחיש את שיטות הגידול והמחקר של מערכת מודל פרפרים חשובה זו.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1-L Pyrex beaker</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-250-059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 mL graduated cylinder</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>03-007-43</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60-mm plastic petri dish lid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-757-100B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbic Acid</td>
			<td>Frontier</td>
			<td>6015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blender</td>
			<td>Amazon - Ninja Store</td>
			<td>BL610 Professional</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cabbage Flour</td>
			<td>Frontier</td>
			<td>1086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Casein</td>
			<td>Frontier</td>
			<td>1100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Celluose</td>
			<td>Frontier</td>
			<td>3425</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholsterol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C3045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cups for rearing (4 oz)</td>
			<td>Wasserstrom</td>
			<td>6094583</td>
			<td>purchase with matching lids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Mesh Agar</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flaxseed Oil</td>
			<td>amazon</td>
			<td>B004R63VI6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Floral water tubes, 2.8 x 0.8inch</td>
			<td>Amazon - Yimaa Direct</td>
			<td>B08BZ969DK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glassine envelopes (1 3/4 x 2 7/8 INCHES)</td>
			<td>Amazon - Wizard Coin Supply</td>
			<td>B0045FG90G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mesh Cages (15.7 x 15.7 x 23.6&#34;)</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B07SK6P94S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl Paraben</td>
			<td>Frontier</td>
			<td>7685</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ohaus Portable Scale</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-112-228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Organic Honey</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B07DHQQFGM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photo studio portable lightbox</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B07T6TNYJ1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic bin, shoebox size</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B09L3B3V1R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic disposable transfer pipets</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-680-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorbic Acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S1626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spatulas</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-357Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptomycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9137</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Target</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Torula Yeast</td>
			<td>Frontier</td>
			<td>1720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vanderzant vitamin mix</td>
			<td>Frontier</td>
			<td>F8045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weigh boats</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>01-549-750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wesson Salt Mix</td>
			<td>Frontier</td>
			<td>F8680</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wheat Germ</td>
			<td>Frontier</td>
			<td>G1659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wooden handled butterfly net, 12&#34; hoop</td>
			<td>Amazon - Educational Science</td>
			<td>B00O5JDLVC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yellow sponges</td>
			<td>Amazon-Celox</td>
			<td>B0B8HTHY5B</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rearing the cabbage white butterfly (pieris rapae) in controlled conditions: a case study with heavy metal tolerance

פרפר לבן הכרוב (Pieris rapae) הוא מערכת חשובה למחקר הדברה יישומי ולמחקר בסיסי באקולוגיה התנהגותית ותזונתית. ניתן לגדל את הלבנים בקלות בתנאים מבוקרים על תזונה מלאכותית, מה שהופך אותם לאורגניזם מודל של עולם הפרפרים. במאמר זה, מניפולציה של חשיפה למתכות כבדות משמשת להמחשת שיטות בסיסיות לגידול מין זה. הפרוטוקול הכללי ממחיש כיצד ניתן לתפוס פרפרים בשטח, לגרום להם להטיל ביצים בכלובי חממה ולהעבירם כזחלים לתזונה מלאכותית. השיטות מראות כיצד ניתן לסמן, למדוד ולחקור פרפרים במגוון שאלות מחקר. התוצאות המייצגות נותנות מושג כיצד ניתן להשתמש בדיאטות מלאכותיות המשתנות ברכיביהן כדי להעריך את ביצועי הפרפרים ביחס לדיאטת ביקורת. באופן ספציפי יותר, פרפרים היו הכי סובלניים לניקל והכי פחות סובלניים לנחושת, עם סבילות לאבץ איפשהו באמצע. הסברים אפשריים לתוצאות אלה נדונים, כולל הצטברות יתר של ניקל בכמה צמחים פונדקאים של חרדל וראיות עדכניות בחרקים לכך שנחושת עשויה להיות רעילה יותר ממה שהוערך בעבר. לבסוף, הדיון סוקר תחילה וריאציות לפרוטוקול והוראות לפתרון בעיות בשיטות אלה, לפני שנבחן כיצד מחקר עתידי עשוי לייעל עוד יותר את התזונה המלאכותית המשמשת במחקר זה. בסך הכל, על ידי מתן סקירת וידאו מפורטת של גידול ומדידה של חלבוני כרוב בדיאטות מלאכותיות, פרוטוקול זה מספק משאב לשימוש במערכת זו במגוון רחב של מחקרים.

The small cabbage white butterfly (Pieris rapae, hereafter &#34;cabbage white&#34;) is a cosmopolitan pest species of mustard crops, such as cabbage, broccoli, and canola1,2,3. At the same time, the cabbage white is a powerful system for research in biology and a commonly used butterfly model, as they can be easily reared and manipulated in controlled lab experiments4,5. Research on cabbage white butterflies has provided critical insights with respect to host searching6,7,8, nectar resource use9,10,11, mate choice and sexual selection12,13,14, wing pattern development and evolution15,16,17, and responses to novel and changing environments18,19. Many of these insights rely on the fact that cabbage whites can be reared on artificial diets4,20,21, which can be precisely manipulated to reflect poor nutritional conditions22,23, ecologically relevant pollutant levels24,25,26,27, or transitions to novel host plants28,29. The present study uses an experiment on exposure to heavy metals to illustrate basic methods for rearing cabbage white butterflies on an artificial diet in the laboratory and key performance measures of larvae and adults. Many aspects of these methods apply to other butterflies30,31 and moths32,33,34 that can be reared on an artificial diet.
In this paper, an experiment on metal tolerance is used to illustrate the general methods of rearing cabbage white butterflies. Heavy metals are a common anthropogenic pollutant stemming from the degradation of human products, industrial processes, and legacy contamination from historical use in pesticides, paints, and other products35,36,37,38. Many heavy metals, including lead, copper, zinc, and nickel, can move from soil and water into plant tissue39,40,41,42, and metals in dust can be deposited on plant leaves43,44,45, resulting in multiple routes of exposure to phytophagous insect larvae. Heavy metal exposure early in life can have negative effects on animal development, especially on neural tissue, and high levels can be lethal35,36,46,47,48. A number of studies have shown the negative effects of metal exposure on developing insects, including both pests and beneficial insects49,50,51. The large number of heavy metal pollutants, and the fact that they often co-occur in human environments52, means that precise lab methods are needed in which researchers can expose developing insects to different levels and combinations of diverse metals to understand and mitigate their environmental effects.
The present work contrasts the impacts of common metals on cabbage white survival and development, focusing on copper (Cu), zinc (Zn), and nickel (Ni), three common pollutants in human environments. For instance, forbs from rural Minnesota roadsides contain up to 71 ppm Zn, 28 ppm Cu, and 5 ppm Ni53. This experiment manipulates the levels of these metals in artificial diets of cabbage white butterflies at levels corresponding to, and exceeding, the levels seen in the environment. An artificial diet is used to contrast the relative toxicity of these metals, predicting that cabbage whites would be more sensitive to metal pollutants that are not an integral part of their physiology (nickel) relative to those that occur, albeit at small levels, in enzymes and tissue (copper and zinc; Figure 1). Throughout, this text provides methodological details and accompanying video visualizations to illustrate the rearing and research methods of this important butterfly model system.

מחבר זרקור: חקירת סובלנותם של פרפרי כרוב למזהמים עירוניים 

גידול הפרפר הלבן של הכרוב (Pieris rapae) בתנאים מבוקרים: מקרה בוחן עם עמידות למתכות כבדות

In this study, we're interested in understanding how organisms deal with anthropogenic environments like cities, roadsides, and crop fields. We use cabbage white butterflies as a system because they're easy to manipulate experimentally. For instance, we're studying genetic variation intolerance to urban pollutants.We collect samples from different locations and populations to study variation over species or space. Nets, coolers, and envelopes are our main tools in the field. Butterfly traits are measured by microscopy and ICP-MS is the best method to measure heavy metal concentrations in small samples.One of the current experimental challenges is studying the variation across species and their developmental adjustments to human environments. The main difficulty lies in rearing diverse species under controlled experimental conditions. While cabbage white butterflies are easy to raise, finding suitable analogous diets for 10 or 20 different species that feed on various plants presents a significant challenge from an experimental perspective.We're interested in mitigating exposure to urban toxins, the ecological interventions that could decrease the toxicity of heavy metals and other urban pollutants, such as microplastics, are being explored. Additionally, we aim to investigate how to design pockets of habitat within city spaces to encourage the health of plants and animals living there, including humans.

סקירה ניתן להשתמש בתזונה מלאכותית כדי לגדל פרפרים לבנים של כרוב בתנאים סטנדרטיים כדי לבדוק את ההשפעות של רכיבי תזונה מסוימים על ביצועי הפרפרים. בעבודה הנוכחית השתמשו בדיאטות מלאכותיות כדי לחקור את הרעילות של מתכות שונות שנמצאו בצמחים פונדקאים שגדלים באזורים מזוהמים (איור 1). הזחלים גודלו על דיאטות שהכילו ריכוזים הולכים וגדלים של שלוש מתכות שונות (איור 2; פרטים מתודולוגיים ספציפיים שהוצגו בסעיף 6 של הפרוטוקול). הישרדות והתפתחות פרפרים הושפעו יותר מנחושת ואבץ והכי פחות מניקל (איור 3 ואיור 4), עם רגישות דומה למחקרים אחרים עם פרפרים ועשים שגדלו על תזונה מלאכותית (איור 5).
הישרדות זחלי הפרפרים הועברו לתזונה מלאכותית שהכילה נחושת, ניקל, אבץ או קבוצת ביקורת, שבה ריכוז כל סוג מתכת השתנה בשלוש רמות (טבלה 3). תמונה מייצגת של זחלים במינון הולך וגדל של רעלן מוצגת באיור 2. לא הייתה השפעה של ריכוז המתכות על הישרדות הניקל, אבל הייתה השפעה משמעותית גם על נחושת וגם על אבץ (טבלה 3 ואיור 3). השוואות צ'י-ריבוע פוסט-הוק הראו כי אבץ הראה ירידה בהישרדות ביחס לדיאטת הביקורת רק ברמה הגבוהה ביותר של אבץ (1,000 ppm, השוואה פוסט-הוק X12 = 8.41, p = 0.004; איור 1). נחושת גם הראתה ירידה משמעותית בהישרדות רק ברמות הגבוהות ביותר בשימוש (500 ppm, X12 = 7.00, p = 0.008), אם כי הייתה עלייה מועילה לא משמעותית בהישרדות בשתי הרמות הנמוכות ביותר (50 ppm ו- 100 ppm; איור 3).
זמן פיתוח נמצאה השפעה משמעותית של ריכוז נחושת ואבץ על זמן הפיתוח (טבלה 4 ואיור 4). ככל שריכוז הנחושת עלה, חלה עלייה בזמן הפיתוח, עם סטייה משמעותית מהבקרה החל מ-50 ppm (p = 0.027; איור 3). ככל שריכוז האבץ עלה, חלה עלייה בזמן הפיתוח, עם סטייה משמעותית מהבקרה שהחלה ב-100 ppm (p = 0.03; איור 4). הייתה מגמה של הגדלת הניקל כדי לגרום לזמני התפתחות ארוכים יותר (p = 0.08; טבלה 4), והשוואות של כל דיאטה עם קבוצת הביקורת הראו השפעות משמעותיות החל מ-100 חל"מ (p = 0.022; איור 4).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65383/65383fig01.jpg"> איור 1: רמות נצפות של מתכות מוקדיות ברקמת פרפר ובצמחים מארחים . (נתוניםמ-62.) רמות של נחושת, ניקל ואבץ הודגמו ברקמת פרפר פייריס (שגודלה על בוק צ'וי במעבדה) ובחרדל שנאסף בטבע (Bertorea sp). מכוניות מציינות את הרמות הנראות בעלי צמחים לאורך כבישים עמוסי תנועה53. רמות המתכות בתזונה מלאכותית ששימשו במחקר זה מדווחות בטבלה 1; נקודות מייצגות אמצעים, וסרגלי שגיאה מייצגים שגיאה סטנדרטית. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65383/65383fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65383/65383fig02.jpg"> איור 2: תמונה של זחלים לבנים של כרוב שהועברו באותו יום לתזונה מלאכותית של ריכוז הולך וגדל של רעלן. תמונה זו מציגה זחלים ממחקר מנה-תגובה (הוצג ב-28 באמצעות חומר צמחי מיובש עבור הצמח הרעיל אריסטולוצ'יה). צילום: ESR. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65383/65383fig02large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65383/65383fig03.jpg"> איור 3: שונות בהישרדות בין דיאטות מתכת של ריכוזים הולכים וגדלים. כוכביות מצביעות על סטייה משמעותית בהישרדות ביחס לדיאטת הביקורת. ריכוזי המתכות המדויקים בתזונה מפורטים בטבלה 2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65383/65383fig03large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65383/65383fig04.jpg"> איור 4: השפעות ריכוז המתכות על זמן הפיתוח. הכוכביות מציינות את ריכוז המתכת הנמוך ביותר עבורו יש הבדל משמעותי ביחס לבקרה (באמצעות מבחן t). ריכוזי המתכות המדויקים בתזונה מפורטים בטבלה 2. נקודות מייצגות אמצעים, וסרגלי שגיאה מייצגים שגיאה סטנדרטית. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65383/65383fig04large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65383/65383fig05.jpg"> איור 5: סיכום סבילות למתכות בלפידופטרות אחרות. מוצגים נתוני הישרדות מורכבים מ-11 מחקרים קיימים 49,50,51,56,63,64,65,66,67,68. משתנה התגובה הוא רמת ריכוז המתכות (ב-ppm) שבה נראות לראשונה השפעות שליליות על הישרדות. פרפרים מצביעים על תוצאות מחקר זה, ומציינים כי ערכי הסבילות לניקל היו גבוהים יותר מאלה שנמדדו במחקר זה. נקודות מייצגות אמצעים, וסרגלי שגיאה מייצגים שגיאה סטנדרטית. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65383/65383fig05large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>מרכיב</td>
			<td>לשקול כ</td>
			<td>g</td>
			<td>מ"ל</td>
		</tr><tr><td>נבט חיטה</td>
			<td>רכיבים יבשים</td>
			<td>50</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>תאית</td>
			<td>רכיבים יבשים</td>
			<td>10</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>קמח כרוב</td>
			<td>רכיבים יבשים</td>
			<td>15</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>קזאין</td>
			<td>רכיבים יבשים</td>
			<td>27</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>סוכרוז</td>
			<td>רכיבים יבשים</td>
			<td>24</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>תערובת מלח ווסון</td>
			<td>רכיבים יבשים</td>
			<td>9</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>שמרי טורולה</td>
			<td>רכיבים יבשים</td>
			<td>12</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>כולסטרול</td>
			<td>רכיבים יבשים</td>
			<td>3.6</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>תערובת ויטמינים</td>
			<td>רכיבים יבשים</td>
			<td>10.5</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>מתיל פרבן</td>
			<td>רכיבים יבשים</td>
			<td>0.75</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>חומצה סורבית</td>
			<td>רכיבים יבשים</td>
			<td>1.5</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>חומצה אסקורבית</td>
			<td>רכיבים יבשים</td>
			<td>3</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>סטרפטומיצין</td>
			<td>רכיבים יבשים</td>
			<td>0.175</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>שמן זרעי פשתן</td>
			<td>מרכיבים רטובים</td>
			<td></td>
			<td>5</td>
		</tr><tr><td>אגר</td>
			<td>אגר</td>
			<td>15</td>
			<td></td>
		</tr></tbody></table>טבלה 1: מתכון לתזונה מלאכותית. מוצגים המשקלים (והנפחים) של המרכיבים במנה אחת של דיאטת פרפר לבן כרוב. החומרים היבשים (ושמן זרעי פשתן) מוכנים בנפרד מתערובת האגר (מומסים ב 400 מ"ל מים רותחים, ואז מביאים לטמפרטורה קרירה יותר עם 400 מ"ל מים בטמפרטורת החדר).
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>סוג דיאטה</td>
			<td>נחושת (ppm)</td>
			<td>ניקל (ppm)</td>
			<td>אבץ (ppm)</td>
		</tr><tr><td>נחושת-"100 עמודים לדקה"</td>
			<td>96.1</td>
			<td>1.75</td>
			<td>69.9</td>
		</tr><tr><td>ניקל-"100 עמודים לדקה"</td>
			<td>7.29</td>
			<td>109.6</td>
			<td>68.9</td>
		</tr><tr><td>אבץ-"100 חל"מ"</td>
			<td>7.96</td>
			<td>1.06</td>
			<td>186.2</td>
		</tr><tr><td>אבץ-"500 חל"מ"</td>
			<td>6.51</td>
			<td>1.16</td>
			<td>708</td>
		</tr><tr><td>לשלוט</td>
			<td>5.89</td>
			<td>0.59</td>
			<td>59.3</td>
		</tr></tbody></table>טבלה 2: מדידות של מתכות בדיאטות. מוצגות הרמות הממוצעות של נחושת, ניקל ואבץ בתת-קבוצה של התזונה המלאכותית ששימשה במחקר. שם הדיאטה ("סוג" בניתוח) מוצג בצד שמאל, כאשר הערכים במרכאות הם הרמה המחושבת. ריכוז היעד מוצג במרכאות. תת-קבוצה של דיאטות ששימשו במחקר נותחה כדי לוודא שהערכים המחושבים היו על היעד עם ערכים ממומשים; יש לציין כי לעתים קרובות יש מידה קטנה של שונות בהרכב רכיבי הדיאטה, וכל שורה המדווחת מייצגת רק שכפול אחד.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>אנילאאל</td>
			<td>פירסון X32</td>
			<td>P</td>
		</tr><tr><td>נחושת (N = 118)</td>
			<td>17.82</td>
			<td>0.0005</td>
		</tr><tr><td>ניקל (N = 152)</td>
			<td>3.45</td>
			<td>0.33</td>
		</tr><tr><td>אבץ (N = 152)</td>
			<td>12.52</td>
			<td>0.006</td>
		</tr></tbody></table>טבלה 3: השפעות ריכוז המתכות על הישרדות. מוצגות תוצאות של בדיקת chi-square עבור כל מתכת, בניגוד לשלושה ריכוזים של מתכת ביחס לדיאטת ביקורת.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>מתכת</td>
			<td>F</td>
			<td>P</td>
		</tr><tr><td>נחושת (N = 61)</td>
			<td>F3,57 = 9.84</td>
			<td><0.0001</td>
		</tr><tr><td>ניקל (N = 75)</td>
			<td>F3,71 = 2.35</td>
			<td>0.079</td>
		</tr><tr><td>אבץ (N = 64)</td>
			<td>F3,60= 3.79</td>
			<td>0.015</td>
		</tr></tbody></table>טבלה 4: השפעות ריכוז המתכות על זמן הפיתוח. מוצגות התוצאות של ANOVAs בודדים עבור כל מתכת.
זמינות נתונים:
כל הנתונים זמינים במנדלי61.

Watch this Scientific Journal Video about Investigating the Tolerance of Cabbage Butterflies to Urban Pollutants at JoVE.com

מאמר זה מציג פרוטוקול מפורט לגידול הפרפר הלבן של הכרוב בתנאי מעבדה מבוקרים באמצעות תזונה מלאכותית, המאפשרת מניפולציות מדויקות של תזונה מוקדמת וחשיפה לרעלנים. התוצאות המייצגות מראות כיצד ניתן לבדוק רעילות של מתכות כבדות באמצעות פרוטוקול זה.

The cabbage white butterfly (Pieris rapae) is an important system for applied pest control research and basic research in behavioral and nutritional ...

במחקר זה אנו מעוניינים להבין כיצד אורגניזמים מתמודדים עם סביבות אנתרופוגניות כמו ערים, צדי דרכים ושדות יבולים. אנו משתמשים בפרפרים לבנים כרוב כמערכת מכיוון שקל לתמרן אותם באופן ניסיוני. למשל, אנחנו חוקרים אי-סבילות של שונות גנטית למזהמים עירוניים.אנו אוספים דגימות ממקומות שונים ומאוכלוסיות שונות כדי לחקור שונות בין מינים או מרחב. רשתות, מצננים ומעטפות הם הכלים העיקריים שלנו בתחום. תכונות הפרפר נמדדות במיקרוסקופיה, ו-ICP-MS היא השיטה הטובה ביותר למדוד ריכוזי מתכות כבדות בדגימות קטנות.אחד האתגרים הניסיוניים הנוכחיים הוא חקר השונות בין מינים וההתאמות ההתפתחותיות שלהם לסביבה האנושית. הקושי העיקרי טמון בגידול מינים מגוונים בתנאי ניסוי מבוקרים. בעוד שקל לגדל פרפרים לבנים של כרוב, מציאת תזונה מקבילה מתאימה ל-10 או 20 מינים שונים הניזונים מצמחים שונים מהווה אתגר משמעותי מנקודת מבט ניסיונית.אנו מעוניינים להפחית את החשיפה לרעלים עירוניים, ההתערבויות האקולוגיות שיכולות להפחית את הרעילות של מתכות כבדות ומזהמים עירוניים אחרים, כגון מיקרופלסטיק, נחקרים. בנוסף, אנו שואפים לחקור כיצד לעצב כיסים של בתי גידול בתוך מרחבים עירוניים כדי לעודד את בריאותם של צמחים ובעלי חיים החיים שם, כולל בני אדם.

גידול הפרפר הלבן של הכרוב (Pieris rapae) בתנאים מבוקרים: מקרה בוחן עם עמידות למתכות כבדות

Abstract