Questo documento presenta un protocollo dettagliato per l'allevamento della farfalla bianca di cavolo in condizioni di laboratorio controllate con una dieta artificiale, che consente manipolazioni precise della nutrizione precoce e dell'esposizione alle tossine. I risultati rappresentativi mostrano come la tossicità dei metalli pesanti può essere misurata con questo protocollo.
La farfalla bianca del cavolo (Pieris rapae) è un sistema importante per la ricerca applicata sul controllo dei parassiti e la ricerca di base nell'ecologia comportamentale e nutrizionale. I bianchi di cavolo possono essere facilmente allevati in condizioni controllate con una dieta artificiale, rendendoli un organismo modello del mondo delle farfalle. In questo articolo, una manipolazione dell'esposizione ai metalli pesanti viene utilizzata per illustrare i metodi di base per l'allevamento di questa specie. Il protocollo generale illustra come le farfalle possono essere catturate sul campo, indotte a deporre le uova in gabbie di serra e trasferite come larve a diete artificiali. I metodi mostrano come le farfalle possono essere marcate, misurate e studiate per una varietà di domande di ricerca. I risultati rappresentativi danno un'idea di come le diete artificiali che variano nei componenti possono essere utilizzate per valutare le prestazioni delle farfalle rispetto a una dieta di controllo. Più specificamente, le farfalle erano più tolleranti al nichel e meno tolleranti al rame, con una tolleranza di zinco da qualche parte nel mezzo. Vengono discusse le possibili spiegazioni per questi risultati, tra cui l'iper-accumulo di nichel in alcune piante ospiti di senape e recenti prove negli insetti che il rame può essere più tossico di quanto precedentemente apprezzato. Infine, la discussione esamina prima le variazioni al protocollo e le indicazioni per la risoluzione dei problemi di questi metodi, prima di considerare come la ricerca futura potrebbe ottimizzare ulteriormente la dieta artificiale utilizzata in questo studio. Nel complesso, fornendo una panoramica video dettagliata dell'allevamento e della misurazione dei cavoli bianchi con diete artificiali, questo protocollo fornisce una risorsa per l'utilizzo di questo sistema in una vasta gamma di studi.
La piccola farfalla bianca di cavolo (Pieris rapae, di seguito "cavolo bianco") è una specie cosmopolita di colture di senape, come cavoli, broccoli e colza 1,2,3. Allo stesso tempo, il cavolo bianco è un potente sistema per la ricerca in biologia e un modello di farfalla comunemente usato, in quanto possono essere facilmente allevati e manipolati in esperimenti di laboratorio controllati 4,5. La ricerca sulle farfalle bianche di cavolo ha fornito approfondimenti critici per quanto riguarda la ricerca dell'ospite 6,7,8, l'uso delle risorse nettarie9,10,11, la scelta del compagno e la selezione sessuale 12,13,14, lo sviluppo e l'evoluzione del modello alare 15,16,17 e le risposte al nuovo e al cambiamento ambienti18,19. Molte di queste intuizioni si basano sul fatto che i bianchi di cavolo possono essere allevati con diete artificiali 4,20,21, che possono essere manipolate con precisione per riflettere cattive condizioni nutrizionali 22,23, livelli di inquinanti ecologicamente rilevanti 24,25,26,27, o transizioni a nuove piante ospiti28,29. Il presente studio utilizza un esperimento sull'esposizione a metalli pesanti per illustrare i metodi di base per l'allevamento di farfalle bianche di cavolo su una dieta artificiale in laboratorio e le misure chiave delle prestazioni di larve e adulti. Molti aspetti di questi metodi si applicano ad altre farfalle30,31 e falene32,33,34 che possono essere allevate con una dieta artificiale.
In questo articolo, un esperimento sulla tolleranza del metallo viene utilizzato per illustrare i metodi generali di allevamento delle farfalle bianche di cavolo. I metalli pesanti sono un inquinante antropogenico comune derivante dalla degradazione dei prodotti umani, dei processi industriali e dalla contaminazione ereditata dall'uso storico in pesticidi, vernici e altri prodotti35,36,37,38. Molti metalli pesanti, tra cui piombo, rame, zinco e nichel, possono spostarsi dal suolo e dall'acqua nel tessuto vegetale 39,40,41,42 e i metalli nella polvere possono essere depositati sulle foglie delle piante43,44,45, con conseguente molteplici vie di esposizione alle larve di insetti fitofagi. L'esposizione ai metalli pesanti nelle prime fasi della vita può avere effetti negativi sullo sviluppo degli animali, specialmente sul tessuto neurale, e livelli elevati possono essere letali 35,36,46,47,48. Numerosi studi hanno dimostrato gli effetti negativi dell'esposizione ai metalli sugli insetti in via di sviluppo, compresi sia i parassiti che gli insetti benefici 49,50,51. Il gran numero di inquinanti di metalli pesanti e il fatto che spesso coesistono in ambienti umani52, significa che sono necessari metodi di laboratorio precisi in cui i ricercatori possono esporre gli insetti in via di sviluppo a diversi livelli e combinazioni di metalli diversi per comprendere e mitigare i loro effetti ambientali.
Il presente lavoro contrasta gli impatti dei metalli comuni sulla sopravvivenza e sullo sviluppo dei cavoli bianchi, concentrandosi su rame (Cu), zinco (Zn) e nichel (Ni), tre inquinanti comuni negli ambienti umani. Ad esempio, i forbs provenienti dai bordi delle strade rurali del Minnesota contengono fino a 71 ppm Zn, 28 ppm Cu e 5 ppm Ni53. Questo esperimento manipola i livelli di questi metalli nelle diete artificiali delle farfalle bianche di cavolo a livelli corrispondenti e superiori ai livelli osservati nell'ambiente. Una dieta artificiale viene utilizzata per contrastare la tossicità relativa di questi metalli, prevedendo che i bianchi di cavolo sarebbero più sensibili agli inquinanti metallici che non sono parte integrante della loro fisiologia (nichel) rispetto a quelli che si trovano, seppur a piccoli livelli, negli enzimi e nei tessuti (rame e zinco; Figura 1). In tutto, questo testo fornisce dettagli metodologici e visualizzazioni video di accompagnamento per illustrare i metodi di allevamento e ricerca di questo importante sistema di modelli di farfalle.
Questa ricerca è stata condotta sotto il permesso APHIS USDA P526P-13-02979.
1. Collezione di farfalle sperimentali
2. Fare diete artificiali
3. Trasferimento e allevamento con diete artificiali
4. Emergenza e manipolazione degli adulti
5. Misure di performance
6. Caso di studio
NOTA: Le farfalle bianche adulte di cavolo femmina sono state raccolte in natura nel 2014 per fondare le popolazioni sperimentali. Le femmine adulte provenivano dalla vicina Davis, California (N = 8 femmine fondatrici).
Panoramica
La dieta artificiale può essere utilizzata per allevare farfalle bianche di cavolo in condizioni standard per testare gli effetti di alcuni ingredienti dietetici sulle prestazioni delle farfalle. Nel presente lavoro, le diete artificiali sono state utilizzate per studiare la tossicità di diversi metalli trovati nelle piante ospiti che crescono in aree inquinate (Figura 1). Le larve sono state allevate con diete contenenti concentrazioni crescenti di tre diversi metalli (Figura 2; dettagli metodologici specifici presentati nella sezione 6 del protocollo). La sopravvivenza e lo sviluppo delle farfalle sono stati più influenzati dal rame e dallo zinco e meno influenzati dal nichel (Figura 3 e Figura 4), con una sensibilità paragonabile ad altri studi con farfalle e falene allevate con diete artificiali (Figura 5).
Sopravvivenza
Le larve di farfalla sono state trasferite a diete artificiali contenenti rame, nichel, zinco o controllo, dove ogni tipo di metallo variava in concentrazione a tre livelli (Tabella 3). Un'immagine rappresentativa delle larve a un dosaggio crescente di tossina è mostrata nella Figura 2. Non c'è stato alcun effetto della concentrazione di metallo sulla sopravvivenza del nichel, ma c'è stato un effetto significativo sia per il rame che per lo zinco (Tabella 3 e Figura 3). Confronti post-hoc chi-quadrato hanno dimostrato che lo zinco ha mostrato un declino della sopravvivenza rispetto alla dieta di controllo solo al più alto livello di zinco (1.000 ppm, confronto post-hoc X12 = 8,41, p = 0,004; Figura 1). Il rame ha anche mostrato un significativo declino della sopravvivenza solo ai livelli più alti utilizzati (500 ppm, X12 = 7,00, p = 0,008), sebbene vi sia stato un aumento benefico non significativo della sopravvivenza ai due livelli più bassi (50 ppm e 100 ppm; Figura 3).
Tempo di sviluppo
C'è stato un effetto significativo della concentrazione di rame e zinco sul tempo di sviluppo (Tabella 4 e Figura 4). All'aumentare della concentrazione di rame, c'è stato un aumento del tempo di sviluppo, con una deviazione significativa dal controllo a partire da 50 ppm (p = 0,027; Figura 3). All'aumentare della concentrazione di zinco, c'è stato un aumento del tempo di sviluppo, con una deviazione significativa dal controllo a partire da 100 ppm (p = 0,03; Figura 4). C'era una tendenza all'aumento del nichel per ottenere tempi di sviluppo più lunghi (p = 0,08; Tabella 4), e i confronti di ciascuna dieta con il controllo hanno mostrato effetti significativi a partire da 100 ppm (p = 0,022; Figura 4).
Figura 1: Livelli osservati di metalli focali nel tessuto delle farfalle e nelle piante ospiti. (Dati da62.) I livelli di rame, nichel e zinco sono mostrati per il tessuto farfalla Pieris (allevato su bok choy in laboratorio) e le mostarde selvatiche raccolte (Bertorea sp.). Le auto indicano i livelli osservati nelle foglie delle piante lungo le strade ad alto traffico53. I livelli di metalli nelle diete artificiali utilizzate in questo studio sono riportati nella Tabella 1; I punti rappresentano i mezzi e le barre di errore rappresentano l'errore standard. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Immagine di larve bianche di cavolo trasferite lo stesso giorno a diete artificiali di crescente concentrazione di una tossina. Questa immagine mostra le larve di uno studio dose-risposta (presentato in 28 utilizzando materiale vegetale essiccato per la pianta tossica Aristolochia). Foto di ESR. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: Variazione della sopravvivenza tra le diete a base di metalli di concentrazioni crescenti. Gli asterischi indicano una deviazione significativa nella sopravvivenza rispetto alla dieta di controllo. Le concentrazioni esatte di metalli nelle diete sono elencate nella Tabella 2. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 4: Effetti della concentrazione di metalli sul tempo di sviluppo. Gli asterischi indicano la concentrazione di metallo più bassa per la quale esiste una differenza significativa rispetto al controllo (utilizzando un t-test). Le concentrazioni esatte di metalli nelle diete sono elencate nella Tabella 2. I punti rappresentano i mezzi e le barre di errore rappresentano l'errore standard. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 5: Riassunto della tolleranza del metallo in altri Lepidotteri. Sono mostrati i dati compositi di sopravvivenza tracciati da 11 studi esistenti 49,50,51,56,63,64,65,66,67,68. La variabile di risposta è il livello (in ppm) di concentrazione del metallo in cui si osservano per la prima volta effetti negativi sulla sopravvivenza. Le farfalle indicano i risultati di questo studio, osservando che i valori di tolleranza per il nichel erano superiori a quelli misurati in questo studio. I punti rappresentano i mezzi e le barre di errore rappresentano l'errore standard. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Ingrediente | Pesare come | g | Ml |
Germe di grano | ingredienti secchi | 50 | |
Cellulosa | ingredienti secchi | 10 | |
Farina di cavolo | ingredienti secchi | 15 | |
Caseina | ingredienti secchi | 27 | |
Saccarosio | ingredienti secchi | 24 | |
Wesson Salt Mix | ingredienti secchi | 9 | |
Lievito Torula | ingredienti secchi | 12 | |
Colesterolo | ingredienti secchi | 3.6 | |
Mix di vitamine | ingredienti secchi | 10.5 | |
Metil Parabene | ingredienti secchi | 0.75 | |
Acido sorbico | ingredienti secchi | 1.5 | |
Acido ascorbico | ingredienti secchi | 3 | |
Streptomicina | ingredienti secchi | 0.175 | |
Olio di semi di lino | Ingredienti umidi | 5 | |
Agar | agar | 15 |
Tabella 1: Ricetta per la dieta artificiale. Sono mostrati i pesi (e i volumi) degli ingredienti in un lotto di dieta a farfalla bianca di cavolo. Gli ingredienti secchi (e l'olio di semi di lino) vengono preparati separatamente dalla miscela di agar (sciolti in 400 ml di acqua bollente, quindi portati a una temperatura più fredda con 400 ml di acqua a temperatura ambiente).
Tipo di dieta | Rame (ppm) | Nichel (ppm) | Zinco (ppm) |
Rame-"100 ppm" | 96.1 | 1.75 | 69.9 |
Nichel-"100 ppm" | 7.29 | 109.6 | 68.9 |
Zinco-"100 ppm" | 7.96 | 1.06 | 186.2 |
Zinco-"500 ppm" | 6.51 | 1.16 | 708 |
Controllo | 5.89 | 0.59 | 59.3 |
Tabella 2: Misure dei metalli nelle diete. Sono mostrati i livelli medi di rame, nichel e zinco in un sottoinsieme delle diete artificiali utilizzate nello studio. Il nome della dieta ("tipo" nell'analisi) è mostrato a sinistra, con i valori tra virgolette che rappresentano il livello calcolato. La concentrazione target è indicata tra virgolette. Un sottoinsieme di diete utilizzate nello studio è stato analizzato per garantire che i valori calcolati fossero in target con i valori realizzati; Va notato che c'è spesso un piccolo grado di variazione nella composizione dei componenti della dieta, e ogni linea riportata rappresenta solo una replica.
Metal | Pearson X32 | P |
Rame (N = 118) | 17.82 | 0.0005 |
Nichel (N = 152) | 3.45 | 0.33 |
Zinco (N = 152) | 12.52 | 0.006 |
Tabella 3: Effetti della concentrazione di metalli sulla sopravvivenza. Sono mostrati i risultati di un test del chi quadrato per ogni metallo, che contrasta tre concentrazioni di metallo rispetto a una dieta di controllo.
Metallo | F | P |
Rame (N = 61) | F3,57 = 9,84 | <0,0001 |
Nichel (N = 75) | F3,71 = 2,35 | 0.079 |
Zinco (N = 64) | F3,60= 3,79 | 0.015 |
Tabella 4: Effetti della concentrazione di metalli sul tempo di sviluppo. Sono mostrati i risultati dei singoli ANOVA per ogni metallo.
Disponibilità dei dati:
Tutti i dati sono disponibili su Mendeley61.
In questa ricerca, le farfalle bianche di cavolo (Pieris rapae) sono state allevate con una dieta artificiale per esaminare le differenze nella tossicità dei metalli pesanti. In tal modo, questo studio fornisce metodi generali per l'allevamento e studi di laboratorio di questo sistema di farfalle facile da manipolare. Questa discussione considera prima domande più generali sui metodi qui esaminati, quindi esamina le nostre scoperte scientifiche prima di concludere con riflessioni sui componenti della dieta artificiale.
Il protocollo qui esaminato fornisce i passaggi di un metodo di allevamento generale per le farfalle bianche di cavolo, ma ci sono molti punti all'interno di questo protocollo che possono essere modificati. Ad esempio, mentre il caso di studio qui presentato utilizza spugne per l'alimentazione, altri ricercatori hanno avuto fortuna con stoppini dentali e fiori di seta riempiti con acqua di miele5. Mentre il presente studio utilizza l'acqua del miele come cibo, altri ricercatori hanno usato soluzioni di zucchero e persino Gatorade. Se le pupe devono essere pesate o spostate in altre condizioni per l'emergenza (ad esempio, inducendo diapausa e necessità di conservare in frigorifero per 1 mese), il ricercatore può facilmente rimuoverle dalle tazze spruzzandole con acqua per inumidire i loro attacchi di seta e afferrarle con una pinza di piume, quindi riappenderle usando del nastro biadesivo. Se i ricercatori hanno bisogno di maggiore flessibilità in termini di quando le farfalle adulte vengono spostate in gabbie per il comportamento degli adulti, possono essere tenute in frigorifero per diverse settimane, ma devono essere nutrite. Ogni diversi giorni, le farfalle dovrebbero essere portate fuori per essere alimentate con una soluzione diluita di acqua al miele. Sotto l'illuminazione interna, questo può essere fatto usando un perno per srotolare la loro proboscide nel cibo. Sul lato delle prestazioni degli adulti, una vasta gamma di misure di fitness può essere presa su farfalle bianche cavoli. Le dimensioni corporee possono essere misurate come la massa umida o secca delle larve in determinate fasi, pupe o adulti (sacrificate o tenute in buste di vetro), o attraverso la misurazione della lunghezza delle ali nel programma ImageJ (vedi 12,24,25,28). La fecondità nel corso della vita delle femmine può essere misurata attraverso raccolte giornaliere di uova su piante ospiti 25,69,70 e la dimensione di tratti specifici può essere misurata come metrica delle prestazioni; Ad esempio, la massa o il volume del cervello o delle singole regioni cerebrali 62,71,72, o la massa o il contenuto proteico del torace o del muscolo volante 62,70. Infine, gli adulti possono essere utilizzati negli studi comportamentali per testare qualsiasi numero di domande che esaminano l'effetto della manipolazione della dieta sul foraggiamento o sulla scelta dell'ovideposizione27,73.
Se il protocollo di allevamento non funziona come previsto, ci sono alcuni aspetti da risolvere. In primo luogo, ci si può chiedere se i livelli di luce sono abbastanza alti da suscitare il normale comportamento degli adulti. Mentre le linee di Pieris adattate in laboratorio depongono le uova sotto la luce fluorescente, l'unica luce artificiale che funziona per le linee di tipo selvatico sono potenti luci a effetto serra ad ampio spettro. La luce naturale nelle serre, nei davanzali delle finestre o all'aperto funziona meglio per suscitare il comportamento di accoppiamento e deposizione delle uova. In secondo luogo, se le uova non si schiudono o se le larve muoiono all'inizio dello sviluppo, ci sono alcune cose da considerare. Il materiale della pianta ospite deve essere organico, osservando che le piante "organiche" dei negozi sono talvolta trattate con sostanze chimiche che possono uccidere le larve, quindi allevare le proprie piante ospiti è spesso la cosa migliore. Se il tasso di accettazione dell'ospite è inferiore, si possono tentare foglie più giovani con un contenuto di azoto più elevato, presentando piante in vaso invece di singole foglie e assicurando che le femmine siano accoppiate. Le femmine accetteranno la semina di Brassica, anche piccoli germogli che hanno 2 settimane di età. Il metodo della paraffina funziona bene per trasferire le uova a condizioni diverse, ma va notato che il tasso di accettazione tende ad essere inferiore rispetto alle piante intere. In terzo luogo, tutti i componenti della dieta devono essere di alta qualità e non scaduti. L'olio di semi di lino deve essere sostituito annualmente e conservato in frigorifero24,25. Anche il germe di grano, il mix vitaminico e gli antibiotici dovrebbero essere mantenuti freschi. In quarto luogo, si può considerare di modificare la configurazione della tazza di dieta. Qualsiasi numero di tipi di bicchieri di plastica usa e getta può essere utilizzato per l'allevamento, da 1 oz a 15 oz. Abbiamo scoperto che 4 once è una buona dimensione per consentire l'emergenza adulta e si imballa bene nelle nostre camere climatiche. I fori infilati nei coperchi consentono il flusso d'aria, ma troppi fori possono asciugare la dieta in condizioni di bassa umidità, quindi potrebbe essere necessario regolare questo numero. In quinto luogo, potrebbe essere necessario regolare le condizioni nella camera climatica in combinazione con le condizioni della tazza. Se le condizioni sono troppo secche, le piante ospiti con uova possono seccarsi prima che le larve possano essere trasferite e le tazze con dieta possono asciugarsi prima che emergano le farfalle. D'altra parte, se le condizioni sono troppo bagnate, le tazze possono ospitare muffe e malattie. I ricercatori potrebbero aver bisogno di regolare il flusso d'aria nelle tazze attraverso l'uso di coperchi a rete o più o meno fori nei coperchi. Un altro problema comune sono le luci della camera che sono abbastanza luminose da causare oscillazioni di temperatura nelle tazze e un accumulo di condensa; L'uso di luci dimmer è un'opzione facile per l'allevamento larvale.
Per quanto riguarda le domande di ricerca in questo documento, questo studio ha scoperto che i bianchi di cavolo erano relativamente più sensibili al rame che al nichel o allo zinco. Il rame ha avuto impatti negativi significativi sul tempo di sviluppo a concentrazioni fino a 50 ppm (Figura 3 e Tabella 3) e sulla sopravvivenza a 500 ppm (Figura 4, Tabella 4). Al contrario, non ci sono stati effetti negativi del nichel sulla sopravvivenza (fino a 500 ppm; Figura 3) o effetti negativi sul tempo di sviluppo a 100 ppm (Figura 4). I bianchi di cavolo erano abbastanza tolleranti allo zinco, con effetti di sopravvivenza osservati solo a 1.000 ppm (Figura 3) ed effetti negativi sul tempo di sviluppo a partire da 100 ppm (Figura 4). Sulla base delle concentrazioni relativamente maggiori di zinco nel tessuto delle farfalle e nelle mostarde (la loro pianta ospite; Figura 1), ci si aspettava che si sarebbe osservata una tolleranza relativamente maggiore allo zinco. Tuttavia, la sensibilità al rame e la tolleranza al nichel erano in qualche modo inaspettate dati i livelli molto bassi di nichel nel tessuto delle farfalle (Figura 1) e la necessità di rame come micronutriente. Questi risultati inaspettati sono discussi di seguito dopo aver considerato la tolleranza di questi metalli in altre farfalle e falene.
Per confrontare i dati attuali con la sensibilità ai metalli misurata in altri lepidotteri, sono stati compilati dati da studi esistenti sulla concentrazione minima, dove i metalli pesanti hanno avuto un impatto negativo sulla sopravvivenza 49,50,51,56,63,64,65,66,67,68; questi studi si sono concentrati sulle falene, in particolare sulle specie infestanti (Galleria mellonella, Lymantria dispar, Plutella xylostella, Spodoptera sp.). Tutti i valori di sensibilità misurati in questo studio si avvicinano all'intervallo misurato per queste altre specie (Figura 5). Tuttavia, la misura della tolleranza al nichel in questo studio sembra essere superiore al previsto: mentre non c'era un effetto significativo di sopravvivenza a 500 ppm, lo studio precedente su Pieris rapae ha anche trovato una tolleranza molto elevata per il nichel (effetti significativi a partire da 1.000 ppm56), nonostante bassi livelli nei loro tessuti naturalmente (Figura 1). La misura della sensibilità al rame in questo studio sembra anche essere nella fascia bassa per gli studi sui lepidotteri. Mentre l'uso di una dieta artificiale consente un confronto conveniente e controllato della sensibilità relativa dei metalli, è importante notare che i componenti della dieta potrebbero alterare la misurazione della sensibilità assoluta dei metalli. Ad esempio, la vitamina C nella dieta potrebbe compensare lo stress ossidativo indotto dal metallo74, o gli antibiotici nella dieta potrebbero alterare eventuali effetti dei microbi sulla lavorazione dei metalli75. Una linea interessante di ricerca futura sarebbe quella di manipolare sistematicamente tali componenti della dieta per testare gli effetti sulla tossicità dei metalli, specialmente date le domande sul ruolo funzionale dei microbi intestinali dei lepidotteri 76,77 e dei componenti del nettare che possono avere proprietà antiossidanti78. Inoltre, la variazione dei requisiti dietetici tra le specie può rendere difficili i confronti interspecifici e i metodi basati sulla dieta artificiale dovrebbero essere integrati con manipolazioni delle piante ospiti.
Queste farfalle sono particolarmente tolleranti al nichel e sensibili al rame. Ricerche precedenti hanno notato che molte piante della famiglia della senape, che comprende piante favorite dai Pieridae, iperaccumulano nichel come meccanismo difensivo contro gli erbivori 55,56,63,79,80,81. Questo iper-accumulo è di oltre 1.000 ppm nel tessuto vegetale, che è ordini di grandezza maggiore di quello che si vede nella maggior parte delle piante (Figura 1). È possibile che i Pieris abbiano una tolleranza particolarmente elevata per il nichel a causa della selezione passata da parte di tali accumulatori di nichel, come precedentemente ipotizzato26. Mentre il rame è stato studiato meno frequentemente come micronutriente nelle diete degli insetti, ci sono alcune prove che svolge un piccolo ruolo nella riproduzione e nell'immunità, anche se principalmente negli insetti che si nutrono di sangue (ad esempio, 82,83). È possibile che il rame svolga un ruolo fisiologico meno importante nelle farfalle rispetto ad altri animali 84,85,86, coerentemente con il recente lavoro che evidenzia come il rame possa essere un inquinante per gli insetti come piombo, cadmio e mercurio (ad esempio, 87,88,89). Mentre i Pieri hanno dimostrato di evitare la contaminazione da rame a bassi livelli90, la mobilità del rame nelle piante (ad esempio, spostandosi in foglie e fiori) lo ha anche segnalato come contaminante metallico preoccupante91.
Mentre questi risultati forniscono dati interessanti sulla tossicità relativa di questi metalli per le farfalle bianche di cavolo, questo documento mira anche ad essere di uso generale come illustrazione visiva dettagliata dei metodi per allevare questo potente sistema. I bianchi di cavolo sono facili da allevare e manipolare in esperimenti di laboratorio controllati 4,5 facilitando gli studi sulla ricerca dell'ospite 6,7,8, il foraggiamento9,10,11 e la selezione sessuale12,13,14. La capacità di allevare queste farfalle con una dieta artificiale è la chiave per creare condizioni comuni del giardino per i confronti e per manipolare nutrienti, tossine e persino nuove piante ospiti. Tuttavia, è importante notare che questa dieta artificiale non è necessariamente la dieta artificiale ottimale per questa specie e potrebbe probabilmente essere migliorata con future manipolazioni. Ad esempio, la miscela di sali in questa dieta (e in altre diete di lepidotteri) è stata originariamente sviluppata per i vertebrati e ha livelli di calcio più elevati di quelli di cui la maggior parte degli insetti ha bisogno92,93. Pertanto, alcuni dei nostri sforzi di allevamento hanno realizzato miscele di sale personalizzate con livelli di calcio più bassi (ad esempio, 62), e altri fanno uso di "miscela di sali di Beck", che può essere più appropriata per molte specie di insetti94. Nelle nostre manipolazioni, abbiamo anche scoperto che le farfalle hanno funzionato meglio con relativamente meno germe di grano e relativamente più cellulosa rispetto alle concentrazioni originali4. Un'area che necessita di ulteriore attenzione è la fonte lipidica e la concentrazione nella dieta. Ad esempio, lavori precedenti hanno dimostrato che il passaggio dall'olio di lino (utilizzato in questo studio) ai fosfolipidi ha aumentato i tassi di accoppiamento e i tassi di crescita di Pieris con diete artificiali95. L'integrazione di acidi grassi specifici nelle diete artificiali può avere ulteriori effetti positivi96,97. L'ottimizzazione della dieta artificiale di Pieris98,99 crea opportunità per affrontare domande interessanti sull'ecologia nutrizionale 100,101,102, sull'ecologia evolutiva e sull'ecotossicologia. Questi approcci dietetici artificiali consentono ai ricercatori di affrontare domande sul ruolo di lipidi specifici nell'evoluzione cognitiva 103, pre-adattamento alle tossine28, componenti dietetici che riducono la tossicità degli inquinanti 104 o interazioni stechiometriche tra i nutrienti105.
Siamo grati per il sostegno degli assistenti universitari durante l'allevamento per questo lavoro, in particolare Regina Kurandina e Rhea Smykalski. Carolyn Kalinowski ha contribuito a compilare la letteratura sulla tossicità dei metalli in altri lepidotteri. Questo lavoro è stato reso possibile da una borsa di ricerca estiva del Dipartimento di Ecologia, Evoluzione e Comportamento dell'Università del Minnesota.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
1-L Pyrex beaker | Fisher Scientific | 07-250-059 | |
500 mL graduated cylinder | Fisher Scientific | 03-007-43 | |
60-mm plastic petri dish lid | Fisher Scientific | 08-757-100B | |
Ascorbic Acid | Frontier | 6015 | |
Blender | Amazon - Ninja Store | BL610 Professional | |
Cabbage Flour | Frontier | 1086 | |
Casein | Frontier | 1100 | |
Celluose | Frontier | 3425 | |
Cholsterol | Sigma | C3045 | |
Cups for rearing (4 oz) | Wasserstrom | 6094583 | purchase with matching lids |
Fine Mesh Agar | Sigma | ||
Flaxseed Oil | amazon | B004R63VI6 | |
Floral water tubes, 2.8 x 0.8inch | Amazon - Yimaa Direct | B08BZ969DK | |
Glassine envelopes (1 3/4 x 2 7/8 INCHES) | Amazon - Wizard Coin Supply | B0045FG90G | |
Mesh Cages (15.7 x 15.7 x 23.6") | Amazon | B07SK6P94S | |
Methyl Paraben | Frontier | 7685 | |
Ohaus Portable Scale | Fisher Scientific | 02-112-228 | |
Organic Honey | Amazon | B07DHQQFGM | |
Photo studio portable lightbox | Amazon | B07T6TNYJ1 | |
Plastic bin, shoebox size | Amazon | B09L3B3V1R | |
Plastic disposable transfer pipets | Fisher Scientific | 13-680-50 | |
Sorbic Acid | Sigma | S1626 | |
Spatulas | Fisher Scientific | 14-357Q | |
Streptomycin | Sigma | S9137 | |
Sucrose | Target | ||
Torula Yeast | Frontier | 1720 | |
Vanderzant vitamin mix | Frontier | F8045 | |
Weigh boats | Fisher Scientific | 01-549-750 | |
Wesson Salt Mix | Frontier | F8680 | |
Wheat Germ | Frontier | G1659 | |
Wooden handled butterfly net, 12" hoop | Amazon - Educational Science | B00O5JDLVC | |
Yellow sponges | Amazon-Celox | B0B8HTHY5B |
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