Vi er takknemlige for støtten fra bachelorassistenter under oppdragelsen for dette arbeidet, spesielt Regina Kurandina og Rhea Smykalski. Carolyn Kalinowski hjalp til med å samle litteratur om metalltoksisitet i andre Lepidoptera. Dette arbeidet ble gjort mulig av et University of Minnesota Department of Ecology, Evolution and Behavior sommerforskningsstipend.

Denne undersøkelsen ble utført under USDA APHIS tillatelse P526P-13-02979.
1. Samling av eksperimentelle sommerfugler
<ol><li>Fang voksne kvinnelige sommerfugler med et insektnett. Kålhvitt finnes vanligvis i åpne, forstyrrede habitater med nektarplanter og vertsplanter (i familien Brassicaceae) til stede.<ol><li>Søk når solen er ute og temperaturen er varm. For å målrette kvinner, se etter individer som flagrer sakte, nær bakken, og lander på planter for å "tromme" (smake) bladene med deres foretarsi.</li>
	</ol></li>
	<li>Sett opp kvinner i bur for å høste egg. MERK: Feltinnsamlede hunner har i gjennomsnitt paret seg med en eller to hanner12, og bør begynne å legge fruktbare egg kort tid etter fangst. Viltfangede hunner trenger naturlig lys til oviposit og kompis, så plasser buret i et drivhus eller vinduskarmen.</li>
	<li>Hus kvinner med en vertsplante for å høste egg. MERK: Hunnene vil akseptere en rekke vertsplanter, inkludert grønnkål, reddik, grønnkål, collards og Arabidopsis, men sørg for at plantene ikke har blitt behandlet med noen plantevernmidler.<ol><li>Presenter vertsplantene enten i potter eller i beholdere med vann for å opprettholde bladtrykket, for eksempel stengler av grønnkål i blomstervannrør.</li>
		<li>Hvis forskeren ønsker å samle egg og overføre dem direkte til kostholdet, bruk først et gummibånd for å feste et vertsplanteblad til toppen av en plastkopp med vann, og strekk deretter et stykke parafilm rundt kanten - hunnene som berører bladet vil oviposit på parafilmen (se5).</li>
	</ol></li>
	<li>Sørg for at buret også inneholder noe som holder den relative luftfuktigheten høy, for eksempel gjennom daglig vanning av en potteplante eller fukting av et håndkle, spesielt under tørre forhold. Hvis potteplanter blir vannet i buret, må du sørge for at et håndkle er under potten, da sommerfugler kan bli sittende fast i bassengvann.</li>
	<li>Fôr sommerfuglene med en 10% fortynnet honningvannsløsning presentert på en gul svamp, hvilke sommerfugler lærer raskt å bruke, spesielt hvis de er plassert hos erfarne personer.<ol><li>For å oppmuntre sommerfugler til å mate fra svamper, plasser dem direkte på materen, spesielt etter lett sprøyting med en vannflaske, noe som ofte får dem til å stikke ut sin proboscis.</li>
		<li>For å sette opp materen, skyll først de gule eller oransje svampene grundig, og kutt dem deretter i små firkanter som passer inn i 60 mm plast petriskåler. Bytt matere daglig og rengjør svampene i en mild blekemiddelløsning, etterfulgt av grundig skylling for å forhindre muggvekst.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Å lage kunstige dietter
<ol><li>Bruk først oppskriften i tabell 1, eller andre relevante kilder, for å bestemme den relevante oppskriften på et eksperiment. Gjør nødvendige modifikasjoner som er spesifikke for fokusarten eller eksperimentet. Skriv ut en oppskrift som skal følges mens du veier ingredienser.</li>
	<li>Vei alle de tørre ingrediensene, bortsett fra agar, i en beholder. Sørg for at ingrediensene settes tilbake på deres respektive lagringssted, og merk at flere ingredienser lagres ved 4 ° C. Legg den forhåndsveide, tørre ingrediensblandingen i en blender med 5 ml linfrøolje.</li>
	<li>For hver diettbatch, følg trinnene som er beskrevet nedenfor.<ol><li>Bland 15 g finmasket agar med 400 ml destillert vann i et beger minst 1 L i størrelse. Mikrobølgeovn til agar er nær koking, med fine bobler gjennom hele blandingen, rør blandingen hver 30-60 s for å forhindre koking over.</li>
		<li>Til denne varme agarblandingen, tilsett 400 ml kran-temperatur destillert vann for å bringe den til en passende temperatur for å blande med de tørre ingrediensene, da vitaminblandingen er varmefølsom.</li>
		<li>Tilsett agarblandingen i blenderen og bland grundig, skrap kantene på blenderen om nødvendig.</li>
	</ol></li>
	<li>Som agar er oppvarming, plasser minst sytti fire-unse diett kopper på benken med kantene rørende. Etter å ha blandet dietten grundig, hell blandingen fra blenderen i diettkopper, slik at dietten dekker bunnen av hver kopp.</li>
	<li>Etter at dietten er avkjølt, legg lokk på koppene, merk diettkoppene med dietttype, stable dem på brett og oppbevar i opptil 1 måned ved 4 ° C til bruk.</li>
</ol>3. Overføring og oppdrett på kunstige dietter
<ol><li>Husvertplanteblader med sommerfuglegg i 30 oz delikatessekopper med nettingdekke i et klimakammer på 24 °C. Etter 1 uke, sjekk koppene - sørg for at larvene er klekket og i slutten av første eller tidlig andre instar scenen, en god tid for overføring til kunstig diett.</li>
	<li>Overfør larvene til kunstig diett med en pensel, desinfiser den med blekemiddel spray og en vannskylling mellom beholdere av larver. Overfør tre larver i hver 4 oz kopp. Mens det kunstige kostholdet er energitett og kan støtte høye tettheter av larver, unngå å pakke larver i kopper, da sykdommer og mugg kan spre seg i kopper med høy larvetetthet.</li>
	<li>Legg koppene i en plastbeholder på sidene slik at frass faller til bunnen av koppene og vekk fra kostholdet, noe som reduserer mugg og sykdomsrisiko.<ol><li>Oppbevar diettkoppene under kontrollerte temperaturforhold med lave til moderate lysnivåer. Overvåk koppene for mugg og sykdom hver 1-2 dag ved å kikke gjennom de klare kopplokkene.</li>
		<li>Kopper med mugg eller sykdom kan settes i karantene eller fryses for å forhindre spredning til andre kopper.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Voksen fremvekst og håndtering
<ol><li>La larvene forpuppe seg og dukke opp i diettkoppene. Når voksne dukker opp, gi dem noen timer for at vingene skal stivne før du fjerner dem for markering. Fjern voksne sommerfugler fra koppene med rene hender ved å forsiktig ta tak i vingene deres, og merk at å ta alle fire vingene nærmere kroppen er et mer stabilt hold.</li>
	<li>For å markere sommerfuglene, hold tørre individer ved hodet og brystkassen og bruk en fintippet sharpie for å markere et tall lett på bakvingen.<ol><li>Sexpersoner som bruker en kombinasjon av vingemarkeringer og kjønnsorganer; Hunnene har generelt to svarte flekker på ryggvingen og mørkere, mer gulaktige bakvinger, mens hannene generelt har en mindre, svart flekk på ryggforvingen på en lysere hvit bakgrunn54.</li>
		<li>Gitt at denne fargen viser individuell og sesongmessig variasjon, bekreft kjønnet ved hjelp av abdominale egenskaper - menn har to klemmer i den distale enden av magen og en smalere mage generelt, mens kvinner har en enkelt kjønnsåpning.</li>
	</ol></li>
	<li>Overfør de voksne til voksglassinkonvolutter ved å åpne konvolutten med en hånd, holde sommerfuglen ved hodet og thoraxen, skyve den inn i konvolutten og ta tak i vingene gjennom konvolutten med den andre hånden.<ol><li>Pass på at alle fire vingene er lukket normalt i konvolutten.</li>
		<li>Hold sommerfuglene i kalde omgivelser (5-6 °C) i opptil 1 uke før eksperimentering, men la minst 1 dag akklimatisere seg når de tas ut av kjøleskapet.</li>
	</ol></li>
</ol>5. Resultatmål
<ol><li>For å måle vingetrekk på døde individer, fjern vingene til sommerfuglen ved å holde thorax i den ene hånden og bruke tang for å fjerne hver vinge ved basen. Plasser vingene flatt i en lysboks og ta bilder for senere målinger.</li>
	<li>For å få estimater av fecundity, hus de voksne i parring bur, slik at minst 1 dag for reproduktiv modning av menn og 1 dag for parring. Ofre hunner på faste tidspunkter for eggtelling gjennom disseksjon, eller samle egg hver dag på vertsplanter.</li>
	<li>For å estimere eggbelastninger, fjern kvinnens underliv, legg den i 1x PBS-buffer og kutt en spalt langs ventralsiden.<ol><li>Bruk tang for å skille innmaten fra neglebåndet, og trekk deretter eggstokkene vekk fra tarmen, trachae og annet innhold i magen.</li>
		<li>Uncurl de fire krøllede eggstokkene i hver av de to eggstokkene, og legg merke til hvor modne, eggeplomme og skallede egg overgår til umodne follikler. Bruk en teller for å telle de totale modne eggene, vanligvis fra 0-200 egg.</li>
	</ol></li>
	<li>For å bestemme parringsstatusen til en dissekert kvinne, åpne bursa copulatrix og skille spermatoforene innenfor. Som spermatoforer fordøyes, utvikler de vanligvis en "hale" og er nestet i hverandre.</li>
</ol>6. Case studie
MERK: Voksne kvinnelige kålhvite sommerfugler ble samlet inn fra naturen i 2014 for å finne eksperimentelle populasjoner. Voksne hunner stammer fra nær Davis, California (N = 8 grunnleggende hunner).
<ol><li>Huser sommerfuglene<ol><li>Hus hunnene i "BugDorm" nettingbur (61 cm x 61 cm x 61 cm) under naturlig lys i et drivhus. Gi et organisk blad av vertsplantekålen (Brassica oleracea) for oviposisjonering.</li>
		<li>For å opprettholde fuktighet i burene, inkludere en liten potteplante (Cosmos), vannet daglig, plassert på toppen av et håndkle i hvert bur.</li>
		<li>Samle egg daglig ved å overføre blader med nye egg til 473 ml plastkopper med hull i lokket og plasser i et klimakammer.</li>
		<li>Gi sommerfugler ad libitum tilgang til en 10% honningvannsløsning (laget ved å fortynne økologisk honning med destillert vann), tilgjengelig gjennom en gul svamp i en liten petriskål som endres daglig.</li>
	</ol></li>
	<li>Forbereder kunstige dietter<ol><li>Forbered kunstige dietter for kålhvite larver ved hjelp av modifikasjoner av tidligere utviklede Lepidoptera dietter4. En gruppe diett inneholdt 50 g hvetekim, 27 g kasein, 10 g cellulose, 24 g sukrose, 15 g kålmel, 9 g Wesson saltblanding, 12 g Torula gjær, 3,6 g kolesterol, 10,5 g Vanderzant vitaminblanding, 1,1 g metylparaben, 1,5 g sorbinsyre, 3 g askorbinsyre og 0,175 g streptomycin (se materialtabell).</li>
		<li>Forhåndsvei de tørre ingrediensene for flere diettpartier (tabell 1) og bland grundig for å øke homogeniteten på tvers av dietttyper før de deles inn i separate batcher for blanding med metallløsninger.</li>
		<li>Legg de tørre ingrediensene i en blender med linolje og tilhørende metallblanding. MERK: Linolje ble brukt i det nåværende eksperimentet da det ble solgt av en tidligere leverandør av insektdietter. Nå brukes organisk linfrøolje utelukkende, som er laget av samme plante, men er mindre sannsynlig å inneholde tilsetningsstoffer som kommersielle leverandører av linolje.</li>
		<li>Hell den tilberedte dietten i 118 ml (4 oz) delikatessekopper av plast. Bruk oppløselige metallsalter for å legge fokalmetaller til kunstige dietter. Ta sikte på metallkonsentrasjoner basert på tidligere observasjoner av metallinnholdet i planter (f.eks. nikkelakkumulering 55,56,57 eller forurensning av planter i veikanten 58,59,60) og toleranse for metalleri andre Lepidoptera 49,50,51.</li>
		<li>Oppløs metallsalter i 500-1000 ml destillert vann før du tar tilsvarende mengder for å legge til kunstige dietter. For eksempel, for å lage 100 ppm nikkeldiett, tilsett 317,6 ml 1 M NiCl2-oppløsning til den kunstige dietten før blanding for å gi en endelig diettkonsentrasjon på 100 mg / g Ni tørrvekt (ca. 53 mg / g våtvekt). Denne mengden oversetter til en gjennomsnittlig målt konsentrasjon på 109,6 ppm (tabell 2) basert på induktivt koblet plasmaatomutslippsspektroskopi. MERK: Nivåene av metaller ble estimert av University of Minnesota's Research Analytical Labs med seks prøver.</li>
	</ol></li>
	<li>Vedlikehold<ol><li>Hold eggene høstet på vertsplanter i klimakamre ved 23 °C i 14:10-fotoperioder i 7 dager. Etter dette, overfør de tidlige andre instar larver til kunstig diett.</li>
		<li>Ved overføring fordeler du larvene jevnt fra en gitt plante på tvers av de fire dietttypene for å unngå å forvirre grupper av larver med dietttype. Overfør larvene (N = 346 totalt) som to individer per 118 ml diettkopp for å redusere sykdomsforekomsten fra overbefolkning og gi god plass for voksne til slutt å lukke.</li>
		<li>Punch hull (tre per lokk) i lokkene på oppdrettskoppene. Plasser koppene i plastkasser i skoeskestørrelse for oppdrett, med de forskjellige diettene ispedd for å unngå systematiske effekter av plassering i oppdrettskammeret.</li>
		<li>Oppbevar larvebegre i klimakamre ved 23 °C på fotoperioder kl. 14.10 (med beholdere med vann i bunnen av kammeret for å holde fuktigheten rundt 50%-60%, overvåket med en fuktighetssensor i hjemmet). I tilfelle koppene ble mugne (omtrent åtte kopper totalt i denne casestudien), fjern koppene fra kammeret og fjern disse personene fra forsøket.</li>
		<li>La larver forpuppe seg og dukke opp i oppdrettskoppene (N = 162 totalt). MERK: For oppdrettsforholdene i denne studien var utviklingstiden fra egginnsamling til voksen fremvekst i gjennomsnitt rundt 25-30 dager (fra 20-40 dager, f.eks. 25,28).</li>
		<li>Når puppene nærmer seg voksen fremvekst, sjekk koppene daglig for nylig lukkede individer og fjern voksne med tørkede vinger. Merk de voksne på bakvingene med tilhørende personnummer (tildelt ved larveoverføring) med en fintippet svart skarphet. Bestem kjønnet til hver enkelt person og merk på en glassinkonvolutt sammen med nummer og fremkomstdato. Legg de voksne sommerfuglene i glassinkonvolutter og oppbevar ved -20 ° C til videre behandling. MERK: En liten brøkdel av nye voksne viser vingedeformiteter som vil forstyrre flukt og voksenoverlevelse (5% -8%); Disse individene er ekskludert fra overlevelsesanalyser for disse forsøkene.</li>
	</ol></li>
	<li>Måling og dataanalyse<ol><li>Mål overlevelsen som overlevelse fra andre stjerne (da larvene ble plassert på diett) til voksen fremvekst. MERK: Den nåværende studien fokuserte på overlevelse og utviklingstid som mål på ytelse på de forskjellige diettene.</li>
		<li>Mål utviklingstiden som antall dager mellom overgang til diett og voksen fremvekst i klimakammeret.</li>
		<li>For dataanalyse, kjør to sett med modeller som inkluderte interaksjoner mellom metallet og konsentrasjonen. MERK: Siden begge interaksjonene var signifikante (F 2194 = 4,56, p = 0,01 for utviklingstid og X2 = 12,1, p = 0,002 for overlevelse), fortsatte studien med separat analyse av hvert metall.</li>
		<li>For å analysere overlevelse, kjør kjikvadrattester for hvert metall for å teste effekten av metalldose (behandlet som fire kategorier) på overlevelse til voksen alder med vingene helt intakte.</li>
		<li>Når en signifikant effekt av dosen oppdages, utfør en oppfølging av kjikvadrat for å sammenligne hvert nivå med kontrolldietten. For å analysere utviklingstiden (fra overføringstidspunkt til fremvekst som voksen), test for effekter av kjønn på utviklingstid. MERK: Siden det ikke var noen effekt av kjønn på utviklingstid, (p > 0,10) for noe metall i dette eksperimentet, droppet vi det fra vurdering i modellen.</li>
		<li>Kjør en separat ANOVA for hvert metall for å teste effekten av de fire konsentrasjonene på utviklingstiden. I tillegg kan du kjøre t-tester for hver konsentrasjon i forhold til kontrollen for å bestemme minimumskonsentrasjonen der en ytelseseffekt sees. MERK: I denne studien ble JMP v16 brukt til alle analyser. Alle rådata er tilgjengelige på Mendeley61.</li>
	</ol></li>
</ol>

Artificial Rearing and Heavy Metal Tolerance in Cabbage White Butterflies

Forfatterne har ingen interessekonflikter å oppgi.

I denne undersøkelsen ble kålhvite sommerfugler (Pieris rapae) oppdratt på en kunstig diett for å undersøke forskjeller i tungmetalltoksisitet. På den måten gir denne studien generelle metoder for oppdrett og laboratorieundersøkelser av dette lett å manipulere sommerfuglsystemet. Denne diskusjonen vurderer først mer generelle spørsmål om metodene som er gjennomgått her, og gjennomgår deretter våre vitenskapelige funn før vi avslutter med refleksjoner om komponentene i det kunstige dietten.
Protokollen som er gjennomgått her gir trinn i en generell oppdrettsmetode for kålhvite sommerfugler, men det er mange punkter i denne protokollen som kan justeres. For eksempel, mens casestudien som presenteres her, bruker svamper til fôring, har andre forskere hatt flaks med tannveker og silkeblomster fylt med honningvann5. Mens denne studien bruker honningvann som mat, har andre forskere brukt sukkerløsninger og til og med Gatorade. Hvis pupper må veies, eller flyttes til andre forhold for fremvekst (f.eks. indusere diapause og trenger å kjølelagre i 1 måned), kan forskeren enkelt fjerne dem fra koppene ved å sprite dem med vann for å fukte silkevedleggene og ta tak i dem med fjærtang, og deretter henge dem på nytt ved hjelp av dobbeltsidig tape. Hvis forskere trenger mer fleksibilitet når det gjelder når voksne sommerfugler flyttes inn i bur for voksenadferd, kan de holdes i kjøleskapet i flere uker, men de må mates. Hver flere dager skal sommerfuglene tas ut for å bli matet en fortynnet honningvannsløsning. Under innendørs belysning kan dette gjøres ved å bruke en pinne for å rulle ut snabelen i maten. På den voksne ytelsessiden kan et bredt spekter av treningstiltak tas på kålhvite sommerfugler. Kroppsstørrelse kan måles som den våte eller tørre massen av larver på bestemte stadier, pupper eller voksne (ofret, eller holdt i glassinkonvolutter), eller gjennom måling av vingelengde i programmet ImageJ (se 12,24,25,28). Hunnens levetidsfruktbarhet kan måles gjennom daglige eggsamlinger på vertsplanter 25,69,70, og størrelsen på spesifikke egenskaper kan måles som en beregning av ytelse; For eksempel massen eller volumet av hjernen eller individuelle hjernegrupper 62,71,72, eller massen eller proteininnholdet i thorax eller flymuskelen 62,70. Endelig kan voksne brukes i atferdsstudier for å teste et hvilket som helst antall spørsmål som undersøker effekten av diettmanipulasjon på foraging eller oviposisjonsvalg 27,73.
Hvis oppdrettsprotokollen ikke fungerer som forventet, er det noen aspekter å feilsøke. Først kan man spørre om lysnivåene er høye nok til å fremkalle normal voksenadferd. Mens laboratorietilpassede linjer av Pieris vil legge egg under fluorescerende lys, er det eneste kunstige lyset som fungerer for villtypelinjer kraftige bredspektrede drivhuslys. Naturlig lys i drivhus, vinduskarmer eller utendørs fungerer best for å fremkalle parring og eggleggingsadferd. For det andre, hvis egg ikke klekkes eller hvis larver dør tidlig i utviklingen, er det noen ting du bør vurdere. Vertsplantematerialet må være organisk, og merk at "organiske" planter fra butikkene noen ganger behandles med kjemikalier som kan drepe larver, så det er ofte best å heve sine egne vertsplanter. Hvis vertsakseptgraden er lavere, kan yngre blader med høyere nitrogeninnhold forsøkes, presentere potteplanter i stedet for individuelle blader og sikre at kvinner blir parret. Hunnene vil akseptere såing Brassica, selv små spirer som er 2 uker gamle. Parafinmetoden fungerer bra for å overføre egg til forskjellige forhold, men det skal bemerkes at akseptgraden har en tendens til å være lavere enn hele planter. For det tredje må alle komponentene i dietten være av høy kvalitet og ikke utløpt. Linfrøolje bør byttes årlig og lagres i kjøleskapet24,25. Hvetekim, vitaminblandingen og antibiotika bør også holdes kjølig. For det fjerde kan man vurdere å justere diettkoppoppsettet. Et hvilket som helst antall engangs plastkopptyper kan brukes til oppdrett, fra 1 oz til 15 oz. Vi har funnet ut at 4 oz er en god størrelse for å tillate voksen fremvekst og pakker pent inn i våre klimakamre. Hull poked i lokkene tillater luftstrøm, men for mange hull kan tørke dietten under lave luftfuktighetsforhold, så dette tallet må kanskje justeres. For det femte kan forholdene i klimakammeret måtte justeres i kombinasjon med koppforholdene. Hvis forholdene er for tørre, kan vertsplanter med egg tørke ut før larver kan overføres, og kopper med diett kan tørke ut før sommerfugler dukker opp. På den annen side, hvis forholdene er for våte, kan koppene havne mugg og sykdom. Forskere må kanskje justere luftstrømmen i kopper ved bruk av nettinglokk, eller mer eller mindre hull i lokkene. Et annet vanlig problem er kammerlys som er lyse nok til å forårsake temperatursvingninger i koppene og en oppbygging av kondens; Å bruke dimmerlys er et enkelt alternativ for larveoppdrett.
Med hensyn til forskningsspørsmålene i denne artikkelen, fant denne studien at kålhvite var relativt mer følsomme for kobber enn for nikkel eller sink. Kobber hadde signifikant negativ innvirkning på utviklingstid ved konsentrasjoner så lave som 50 ppm (figur 3 og tabell 3) og på overlevelse ved 500 ppm (figur 4, tabell 4). Derimot var det ingen negative effekter av nikkel på overlevelse (opptil 500 ppm; Figur 3) eller negative effekter på utviklingstid ved 100 ppm (figur 4). Kålhvite var ganske tolerante for sink, med overlevelseseffekter sett bare ved 1000 ppm (figur 3) og negative effekter på utviklingstid fra 100 ppm (figur 4). Basert på de relativt større konsentrasjonene av sink i sommerfuglvev og sennep (deres vertsplante; Figur 1), var det forventet at man ville se en relativt større toleranse for sink. Følsomheten for kobber og toleransen for nikkel var imidlertid noe uventet gitt de svært lave nivåene av nikkel i sommerfuglvev (figur 1) og nødvendigheten av kobber som mikronæringsstoff. Disse uventede funnene diskuteres nedenfor etter å ha vurdert toleransen til disse metallene i andre sommerfugler og møll.
For å sammenligne nåværende data med metallfølsomhet målt i andre Lepidoptera, ble data fra eksisterende studier samlet på minimumskonsentrasjonen, hvor tungmetaller påvirket overlevelsen negativt 49,50,51,56,63,64,65,66,67,68; Disse studiene fokuserte på møll, spesielt skadedyrsarter (Galleria mellonella, Lymantria dispar, Plutella xylostella, Spodoptera sp.). Alle de målte sensitivitetsverdiene i denne studien ligger nær det som er målt for disse andre artene (figur 5). Imidlertid synes målet for nikkeltoleranse i denne studien å være høyere enn forventet - mens det ikke var en signifikant effekt av overlevelse ved 500 ppm, fant den forrige studien på Pieris rapae også en svært høy toleranse for nikkel (signifikante effekter som starter på 1000 ppm56), til tross for lave nivåer i vevet naturlig (figur 1). Målet på kobberfølsomhet i denne studien ser også ut til å være i den lave enden for studier av Lepidoptera. Mens bruk av et kunstig diett tillater en praktisk og kontrollert sammenligning av relativ metallfølsomhet, er det viktig å merke seg at komponenter i dietten kan endre måling av absolutt metallfølsomhet. For eksempel kan vitamin C i kostholdet kompensere for metallinducert oksidativt stress74, eller antibiotika i dietten kan endre eventuelle effekter av mikrober på behandling av metaller75. En interessant linje med fremtidig forskning ville være å systematisk manipulere slike diettkomponenter for å teste effekter på metalltoksisitet, spesielt gitt spørsmål om den funksjonelle rollen som lepidopteran tarmmikrober 76,77 og nektarkomponenter som kan ha antioksidantegenskaper78. I tillegg kan variasjon i diettbehov på tvers av arter gjøre interspesifikke sammenligninger utfordrende, og kunstige diettbaserte metoder bør suppleres med manipulasjoner av vertsplanter.
Disse sommerfuglene er spesielt tolerante for nikkel og følsomme for kobber. Tidligere forskning har bemerket at mange planter i sennepsfamilien, som inkluderer planter favorisert av Pieridae, hyperakkumulerer nikkel som en defensiv mekanisme mot planteetere 55,56,63,79,80,81. Denne hyperakkumuleringen er over 1000 ppm i plantevev, som er størrelsesordener større enn det som ses i de fleste planter (figur 1). Det er mulig at Pieris har en spesielt høy toleranse for nikkel på grunn av tidligere seleksjon av slike nikkelakkumulatorer, som tidligere spekulerti 26. Mens kobber har blitt sjeldnere studert som et mikronæringsstoff i insektdietter, er det noen bevis på at det spiller en liten rolle i reproduksjon og immunitet, men først og fremst i blodfôrende insekter (f.eks. 82,83). Det er mulig at kobber spiller en mindre viktig fysiologisk rolle hos sommerfugler enn hos andre dyr 84,85,86, i samsvar med nyere arbeid som fremhever hvordan kobber kan være like bekymringsfullt for et forurensende stoff for insekter som bly, kadmium og kvikksølv (f.eks. 87,88,89). Mens Pieris har vist seg å unngå kobberforurensning ved lave nivåer90, har mobiliteten av kobber i planter (f.eks. Flytter inn i blader og blomster) også flagget det som en metallforurensning av bekymring91.
Selv om disse resultatene gir interessante data om den relative toksisiteten til disse metallene til kålhvite sommerfugler, har dette papiret også som mål å være til generell bruk som en detaljert visuell illustrasjon av metoder for oppdrett av dette kraftige systemet. Kålhvite er enkle å oppdra og manipulere i kontrollerte laboratorieeksperimenter 4,5 som letter studier av vertssøk 6,7,8, foraging9,10,11 og seksuell seleksjon12,13,14. Evnen til å oppdra disse sommerfuglene på en kunstig diett er nøkkelen til å skape vanlige hageforhold for sammenligninger og å manipulere næringsstoffer, giftstoffer og til og med nye vertsplanter. Det er imidlertid viktig å merke seg at dette kunstige dietten ikke nødvendigvis er den optimale kunstige dietten for denne arten, og kan sannsynligvis forbedres med fremtidige manipulasjoner. For eksempel ble saltblandingen i denne dietten (og andre lepidopteran dietter) opprinnelig utviklet for vertebrater og har høyere kalsiumnivåer enn hva de fleste insekter trenger92,93. Dermed har noen av våre oppdrettsforsøk gjort tilpassede saltblandinger med lavere kalsiumnivåer (f.eks. 62), og andre bruker "Becks saltblanding", som kan være mer passende for mange insektarter94. I våre egne manipulasjoner fant vi også at sommerfugler presterte bedre med relativt mindre hvetekim og relativt mer cellulose sammenlignet med opprinnelige konsentrasjoner4. Et område som trenger ytterligere oppmerksomhet er lipidkilden og konsentrasjonen i dietten. For eksempel har tidligere arbeid vist at skifting fra linolje (brukt i denne studien) til fosfolipider økte parringshastighetene og vekstratene til Pieris på kunstige dietter95. Tilskudd av spesifikke fettsyrer i kunstige dietter kan ha ytterligere positive effekter96,97. Optimalisering av den kunstige dietten til Pieris98,99 skaper muligheter for å ta opp interessante spørsmål om ernæringsmessig økologi 100,101,102, evolusjonær økologi og økotoksikologi. Disse kunstige dietttilnærmingene tillater forskere å ta opp spørsmål om rollen som spesifikke lipider i kognitiv evolusjon 103, pre-tilpasning til toksiner28, diettkomponenter som reduserer toksisiteten av forurensende stoffer 104 eller støkiometriske interaksjoner mellom næringsstoffer105.

Den lille kålhvite sommerfuglen (Pieris rapae, heretter "kålhvit") er en kosmopolitisk skadedyrart av sennepsavlinger, som kål, brokkoli og raps 1,2,3. Samtidig er kålhviten et kraftig system for forskning i biologi og en vanlig brukt sommerfuglmodell, da de lett kan oppdrettes og manipuleres i kontrollerte laboratorieforsøk 4,5. Forskning på kålhvite sommerfugler har gitt kritisk innsikt med hensyn til vertssøk 6,7,8, nektarressursbruk 9,10,11, kompisvalg og seksuell seleksjon 12,13,14, vingemønsterutvikling og evolusjon15,16,17, og respons på nye og skiftende Miljøer18,19. Mange av disse innsiktene er avhengige av det faktum at kålhvite kan oppdrettes på kunstige dietter 4,20,21, som nøyaktig kan manipuleres for å gjenspeile dårlige ernæringsforhold 22,23, økologisk relevante forurensningsnivåer 24,25,26,27, eller overganger til nye vertsplanter28,29. Denne studien bruker et eksperiment på eksponering for tungmetaller for å illustrere grunnleggende metoder for oppdrett av kålhvite sommerfugler på en kunstig diett i laboratoriet og viktige ytelsesmål for larver og voksne. Mange aspekter av disse metodene gjelder for andre sommerfugler30,31 og møll32,33,34 som kan oppdrettes på en kunstig diett.
I dette papiret brukes et eksperiment på metalltoleranse for å illustrere de generelle metodene for oppdrett av kålhvite sommerfugler. Tungmetaller er et vanlig menneskeskapt forurensende stoff som stammer fra nedbrytning av menneskelige produkter, industrielle prosesser og eldre forurensning fra historisk bruk i plantevernmidler, maling og andre produkter35,36,37,38. Mange tungmetaller, inkludert bly, kobber, sink og nikkel, kan bevege seg fra jord og vann til plantevev 39,40,41,42, og metaller i støv kan avsettes på planteblader43,44,45, noe som resulterer i flere eksponeringsveier for fytofagøse insektlarver. Tungmetalleksponering tidlig i livet kan ha negative effekter på dyrs utvikling, spesielt på nevralvev, og høye nivåer kan være dødelige 35,36,46,47,48. En rekke studier har vist de negative effektene av metalleksponering på utviklende insekter, inkludert både og gunstige insekter 49,50,51. Det store antallet tungmetallforurensninger, og det faktum at de ofte forekommer samtidig i menneskelige miljøer52, betyr at det er behov for nøyaktige laboratoriemetoder der forskere kan utsette utviklende insekter for forskjellige nivåer og kombinasjoner av forskjellige metaller for å forstå og redusere deres miljøeffekter.
Det nåværende arbeidet kontrasterer virkningen av vanlige metaller på kålhvit overlevelse og utvikling, med fokus på kobber (Cu), sink (Zn) og nikkel (Ni), tre vanlige forurensninger i menneskelige miljøer. For eksempel inneholder forbs fra landlige veikanter i Minnesota opptil 71 ppm Zn, 28 ppm Cu og 5 ppm Ni53. Dette eksperimentet manipulerer nivåene av disse metallene i kunstige dietter av kålhvite sommerfugler på nivåer som tilsvarer og overstiger nivåene sett i miljøet. Et kunstig diett brukes til å kontrastere den relative toksisiteten til disse metallene, og forutsi at kålhvite ville være mer følsomme for metallforurensninger som ikke er en integrert del av deres fysiologi (nikkel) i forhold til de som oppstår, om enn i små nivåer, i enzymer og vev (kobber og sink; Figur 1). Gjennom hele denne teksten gir metodologiske detaljer og tilhørende videovisualiseringer for å illustrere oppdretts- og forskningsmetodene til dette viktige sommerfuglmodellsystemet.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1-L Pyrex beaker</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-250-059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 mL graduated cylinder</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>03-007-43</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60-mm plastic petri dish lid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-757-100B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbic Acid</td>
			<td>Frontier</td>
			<td>6015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blender</td>
			<td>Amazon - Ninja Store</td>
			<td>BL610 Professional</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cabbage Flour</td>
			<td>Frontier</td>
			<td>1086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Casein</td>
			<td>Frontier</td>
			<td>1100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Celluose</td>
			<td>Frontier</td>
			<td>3425</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholsterol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C3045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cups for rearing (4 oz)</td>
			<td>Wasserstrom</td>
			<td>6094583</td>
			<td>purchase with matching lids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Mesh Agar</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flaxseed Oil</td>
			<td>amazon</td>
			<td>B004R63VI6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Floral water tubes, 2.8 x 0.8inch</td>
			<td>Amazon - Yimaa Direct</td>
			<td>B08BZ969DK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glassine envelopes (1 3/4 x 2 7/8 INCHES)</td>
			<td>Amazon - Wizard Coin Supply</td>
			<td>B0045FG90G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mesh Cages (15.7 x 15.7 x 23.6&#34;)</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B07SK6P94S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl Paraben</td>
			<td>Frontier</td>
			<td>7685</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ohaus Portable Scale</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-112-228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Organic Honey</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B07DHQQFGM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photo studio portable lightbox</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B07T6TNYJ1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic bin, shoebox size</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B09L3B3V1R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic disposable transfer pipets</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-680-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorbic Acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S1626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spatulas</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-357Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptomycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9137</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Target</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Torula Yeast</td>
			<td>Frontier</td>
			<td>1720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vanderzant vitamin mix</td>
			<td>Frontier</td>
			<td>F8045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weigh boats</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>01-549-750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wesson Salt Mix</td>
			<td>Frontier</td>
			<td>F8680</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wheat Germ</td>
			<td>Frontier</td>
			<td>G1659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wooden handled butterfly net, 12&#34; hoop</td>
			<td>Amazon - Educational Science</td>
			<td>B00O5JDLVC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yellow sponges</td>
			<td>Amazon-Celox</td>
			<td>B0B8HTHY5B</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rearing the cabbage white butterfly (pieris rapae) in controlled conditions: a case study with heavy metal tolerance

Kålhvitsommerfugl (Pieris rapae) er et viktig system for anvendt skadedyrbekjempelsesforskning og grunnforskning innen atferds- og ernæringsøkologi. Kålhvitt kan lett oppdrettes under kontrollerte forhold på en kunstig diett, noe som gjør dem til en modellorganisme i sommerfuglverdenen. I denne artikkelen brukes en manipulering av tungmetalleksponering for å illustrere grunnleggende metoder for oppdrett av denne arten. Den generelle protokollen illustrerer hvordan sommerfugler kan fanges i felt, induseres til å legge egg i drivhusbur, og overføres som larver til kunstige dietter. Metodene viser hvordan sommerfugler kan merkes, måles og studeres for en rekke forskningsspørsmål. De representative resultatene gir en ide om hvordan kunstige dietter som varierer i komponenter, kan brukes til å vurdere sommerfuglytelsen i forhold til et kontrolldiett. Nærmere bestemt var sommerfugler mest tolerante mot nikkel og minst tolerante mot kobber, med en toleranse for sink et sted i midten. Mulige forklaringer på disse resultatene diskuteres, inkludert nikkel hyperakkumulering i noen sennepsvertsplanter og nyere bevis hos insekter at kobber kan være mer giftig enn tidligere verdsatt. Til slutt vurderer diskusjonen først variasjoner i protokollen og instruksjonene for feilsøking av disse metodene, før man vurderer hvordan fremtidig forskning kan optimalisere det kunstige kostholdet som brukes i denne studien. Samlet sett, ved å gi en detaljert videooversikt over oppdrett og måling av kålhvite på kunstige dietter, gir denne protokollen en ressurs for bruk av dette systemet på tvers av et bredt spekter av studier.

The small cabbage white butterfly (Pieris rapae, hereafter &#34;cabbage white&#34;) is a cosmopolitan pest species of mustard crops, such as cabbage, broccoli, and canola1,2,3. At the same time, the cabbage white is a powerful system for research in biology and a commonly used butterfly model, as they can be easily reared and manipulated in controlled lab experiments4,5. Research on cabbage white butterflies has provided critical insights with respect to host searching6,7,8, nectar resource use9,10,11, mate choice and sexual selection12,13,14, wing pattern development and evolution15,16,17, and responses to novel and changing environments18,19. Many of these insights rely on the fact that cabbage whites can be reared on artificial diets4,20,21, which can be precisely manipulated to reflect poor nutritional conditions22,23, ecologically relevant pollutant levels24,25,26,27, or transitions to novel host plants28,29. The present study uses an experiment on exposure to heavy metals to illustrate basic methods for rearing cabbage white butterflies on an artificial diet in the laboratory and key performance measures of larvae and adults. Many aspects of these methods apply to other butterflies30,31 and moths32,33,34 that can be reared on an artificial diet.
In this paper, an experiment on metal tolerance is used to illustrate the general methods of rearing cabbage white butterflies. Heavy metals are a common anthropogenic pollutant stemming from the degradation of human products, industrial processes, and legacy contamination from historical use in pesticides, paints, and other products35,36,37,38. Many heavy metals, including lead, copper, zinc, and nickel, can move from soil and water into plant tissue39,40,41,42, and metals in dust can be deposited on plant leaves43,44,45, resulting in multiple routes of exposure to phytophagous insect larvae. Heavy metal exposure early in life can have negative effects on animal development, especially on neural tissue, and high levels can be lethal35,36,46,47,48. A number of studies have shown the negative effects of metal exposure on developing insects, including both pests and beneficial insects49,50,51. The large number of heavy metal pollutants, and the fact that they often co-occur in human environments52, means that precise lab methods are needed in which researchers can expose developing insects to different levels and combinations of diverse metals to understand and mitigate their environmental effects.
The present work contrasts the impacts of common metals on cabbage white survival and development, focusing on copper (Cu), zinc (Zn), and nickel (Ni), three common pollutants in human environments. For instance, forbs from rural Minnesota roadsides contain up to 71 ppm Zn, 28 ppm Cu, and 5 ppm Ni53. This experiment manipulates the levels of these metals in artificial diets of cabbage white butterflies at levels corresponding to, and exceeding, the levels seen in the environment. An artificial diet is used to contrast the relative toxicity of these metals, predicting that cabbage whites would be more sensitive to metal pollutants that are not an integral part of their physiology (nickel) relative to those that occur, albeit at small levels, in enzymes and tissue (copper and zinc; Figure 1). Throughout, this text provides methodological details and accompanying video visualizations to illustrate the rearing and research methods of this important butterfly model system.

Author Spotlight: Investigating the Tolerance of Cabbage Butterflies to Urban Pollutants 

Oppdrett av kålhvit sommerfugl (Pieris rapae) under kontrollerte forhold: En casestudie med tungmetalltoleranse

Oversikt Kunstig diett kan brukes til å heve kålhvite sommerfugler under standardbetingelser for å teste effekten av visse diettingredienser på sommerfuglens ytelse. I det nåværende arbeidet ble kunstige dietter brukt til å studere toksisiteten til forskjellige metaller som finnes i vertsplanter som vokser i forurensede områder (figur 1). Larvene ble oppdrettet på dietter som inneholdt økende konsentrasjoner av tre forskjellige metaller (figur 2; spesifikke metodologiske detaljer presentert i avsnitt 6 i protokollen). Sommerfuglens overlevelse og utvikling var mer påvirket av kobber og sink og minst påvirket av nikkel (figur 3 og figur 4), med en sensitivitet som kan sammenlignes med andre studier med sommerfugler og møll oppdratt på kunstige dietter (figur 5).
Overlevelse Sommerfugllarver ble overført til kunstige dietter som inneholdt kobber, nikkel, sink eller kontroll, hvor hver metalltype varierte i konsentrasjon på tre nivåer (tabell 3). Et representativt bilde av larver ved økende toksindose er vist i figur 2. Det var ingen effekt av metallkonsentrasjon på overlevelse for nikkel, men det var en signifikant effekt for både kobber og sink (tabell 3 og figur 3). Post-hoc khikvadratsammenligninger viste at sink viste en nedgang i overlevelse i forhold til kontrolldietten på bare det høyeste nivået av sink (1000 ppm, post-hoc sammenligning X12 = 8,41, p = 0,004; Figur 1). Kobber viste også en signifikant nedgang i overlevelse bare på de høyeste nivåene som ble brukt (500 ppm, X12 = 7,00, p = 0,008), selv om det var en ikke-signifikant gunstig økning i overlevelse på de to laveste nivåene (50 ppm og 100 ppm; Figur 3).
Utviklingstid Det var en signifikant effekt av kobber- og sinkkonsentrasjon på utviklingstid (tabell 4 og figur 4). Etter hvert som kobberkonsentrasjonen økte, var det en økning i utviklingstid, med et signifikant avvik fra kontrollen som startet på 50 ppm (p = 0,027; Figur 3). Etter hvert som sinkkonsentrasjonen økte, var det en økning i utviklingstid, med et signifikant avvik fra kontrollen som startet ved 100 ppm (p = 0,03; Figur 4). Det var en tendens til at økende nikkel ga lengre utviklingstid (p = 0,08; Tabell 4), og sammenligninger av hver diett med kontrollen viste signifikante effekter fra 100 ppm (p = 0,022; Figur 4).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65383/65383fig01.jpg"> Figur 1: Observerte nivåer av fokale metaller i sommerfuglvev og vertsplanter. (Data fra62.) Nivåer av kobber, nikkel og sink er vist for Pieris sommerfuglvev (oppdrettet på bok choy i laboratoriet) og viltinnsamlede sennep (Bertorea sp.). Biler indikerer nivåene sett i planteblader langs høytrafikkerte veier53. Nivåene av metaller i kunstige dietter brukt i denne studien er rapportert i tabell 1; Punkt representerer midler, og feilfelt representerer standardfeil. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65383/65383fig01large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65383/65383fig02.jpg"> Figur 2: Bilde av kålhvite larver overført samme dag til kunstige dietter med økende konsentrasjon av et giftstoff. Dette bildet viser larver fra en dose-respons-studie (presentert i 28 ved bruk av tørket plantemateriale for den giftige planten Aristolochia). Foto av ESR. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65383/65383fig02large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65383/65383fig03.jpg"> Figur 3: Variasjon i overlevelse på tvers av metalldietter med økende konsentrasjoner. Stjerner indikerer signifikant avvik i overlevelse i forhold til kontrolldietten. De eksakte metallkonsentrasjonene i diettene er angitt i tabell 2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65383/65383fig03large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65383/65383fig04.jpg"> Figur 4: Effekter av metallkonsentrasjon på utviklingstid. Stjernene indikerer den laveste metallkonsentrasjonen som det er en signifikant forskjell i forhold til kontrollen (ved bruk av en t-test). De eksakte metallkonsentrasjonene i diettene er angitt i tabell 2. Punkter representerer midler, og feilfelt representerer standardfeil. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65383/65383fig04large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65383/65383fig05.jpg"> Figur 5: Sammendrag av metalltoleranse i andre Lepidoptera. Vist er sammensatte overlevelsesdata plottet fra 11 eksisterende studier 49,50,51,56,63,64,65,66,67,68. Responsvariabelen er nivået (i ppm) av metallkonsentrasjon der negative effekter på overlevelse først sees. Sommerfugler indikerer resultater fra denne studien, og bemerker at toleranseverdiene for nikkel var høyere enn de som ble målt i denne studien. Punkter representerer midler, og feilfelt representerer standardfeil. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65383/65383fig05large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Ingrediens</td>
			<td>Vei som</td>
			<td>g</td>
			<td>Ml</td>
		</tr><tr><td>Hvetekim</td>
			<td>tørre ingredienser</td>
			<td>50</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>Cellulose</td>
			<td>tørre ingredienser</td>
			<td>10</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>Kålmel</td>
			<td>tørre ingredienser</td>
			<td>15</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>Kasein</td>
			<td>tørre ingredienser</td>
			<td>27</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>Sukrose</td>
			<td>tørre ingredienser</td>
			<td>24</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>Wesson Salt Mix</td>
			<td>tørre ingredienser</td>
			<td>9</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>Torula gjær</td>
			<td>tørre ingredienser</td>
			<td>12</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>Kolesterol</td>
			<td>tørre ingredienser</td>
			<td>3.6</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>Vitaminblanding</td>
			<td>tørre ingredienser</td>
			<td>10.5</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>Metyl paraben</td>
			<td>tørre ingredienser</td>
			<td>0.75</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>Sorbinsyre</td>
			<td>tørre ingredienser</td>
			<td>1.5</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>Askorbinsyre</td>
			<td>tørre ingredienser</td>
			<td>3</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>Streptomycin</td>
			<td>tørre ingredienser</td>
			<td>0.175</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>Linfrøolje</td>
			<td>våte ingredienser</td>
			<td></td>
			<td>5</td>
		</tr><tr><td>Agar</td>
			<td>Agar</td>
			<td>15</td>
			<td></td>
		</tr></tbody></table>Tabell 1: Oppskrift på kunstig diett. Vist er vektene (og volumene) av ingredienser i en batch av kål hvit sommerfugl diett. De tørre ingrediensene (og linfrøolje) fremstilles separat fra agarblandingen (oppløst i 400 ml kokende vann, deretter brakt til en kjøligere temperatur med 400 ml romtemperatur vann).
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Kosthold type</td>
			<td>Kobber (ppm)</td>
			<td>Nikkel (ppm)</td>
			<td>Sink (ppm)</td>
		</tr><tr><td>Kobber-"100 ppm"</td>
			<td>96.1</td>
			<td>1.75</td>
			<td>69.9</td>
		</tr><tr><td>Nikkel-"100 ppm"</td>
			<td>7.29</td>
			<td>109.6</td>
			<td>68.9</td>
		</tr><tr><td>Sink-"100 ppm"</td>
			<td>7.96</td>
			<td>1.06</td>
			<td>186.2</td>
		</tr><tr><td>Sink-"500 ppm"</td>
			<td>6.51</td>
			<td>1.16</td>
			<td>708</td>
		</tr><tr><td>Kontroll</td>
			<td>5.89</td>
			<td>0.59</td>
			<td>59.3</td>
		</tr></tbody></table>Tabell 2: Målinger av metaller i dietter. Vist er de gjennomsnittlige nivåene av kobber, nikkel og sink i en delmengde av de kunstige diettene som ble brukt i studien. Diettnavnet ("type" i analysen) er vist til venstre, med verdier i anførselstegn som beregnet nivå. Målkonsentrasjonen vises i anførselstegn. En delmengde av dietter som ble brukt i studien ble analysert for å sikre at de beregnede verdiene var i mål med realiserte verdier; Det skal bemerkes at det ofte er en liten grad av variasjon i sammensetningen av diettkomponenter, og hver rapporterte linje representerer bare en replikasjon.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Metal</td>
			<td>Pearson X32</td>
			<td>P</td>
		</tr><tr><td>Kobber (n = 118)</td>
			<td>17.82</td>
			<td>0.0005</td>
		</tr><tr><td>Nikkel (N = 152)</td>
			<td>3.45</td>
			<td>0.33</td>
		</tr><tr><td>Sink (n = 152)</td>
			<td>12.52</td>
			<td>0.006</td>
		</tr></tbody></table>Tabell 3: Effekter av metallkonsentrasjon på overlevelse. Vist er resultatene av en kjikvadrattest for hvert metall, kontrasterende tre konsentrasjoner av metall i forhold til en kontroll diett.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Metall</td>
			<td>F</td>
			<td>P</td>
		</tr><tr><td>Kobber (n = 61)</td>
			<td>F3,57 = 9,84</td>
			<td><0.0001</td>
		</tr><tr><td>Nikkel (N = 75)</td>
			<td>F3,71 = 2,35</td>
			<td>0.079</td>
		</tr><tr><td>Sink (n = 64)</td>
			<td>F3,60= 3,79</td>
			<td>0.015</td>
		</tr></tbody></table>Tabell 4: Effekter av metallkonsentrasjon på utviklingstid. Resultatene fra individuelle ANOVAer for hvert metall vises.
Tilgjengelighet av data:
Alle data er tilgjengelige på Mendeley61.

Watch this Scientific Journal Video about Investigating the Tolerance of Cabbage Butterflies to Urban Pollutants at JoVE.com

Dette papiret presenterer en detaljert protokoll for oppdrett av kålhvit sommerfugl i kontrollerte laboratorieforhold med et kunstig diett, som tillater presise manipulasjoner av tidlig ernæring og toksineksponering. De representative resultatene viser hvordan tungmetalltoksisitet kan analyseres med denne protokollen.

The cabbage white butterfly (Pieris rapae) is an important system for applied pest control research and basic research in behavioral and nutritional ...

I denne studien er vi interessert i å forstå hvordan organismer håndterer menneskeskapte miljøer som byer, veikanter og avlinger. Vi bruker kålhvite sommerfugler som et system fordi de er enkle å manipulere eksperimentelt. For eksempel studerer vi genetisk variasjonsintoleranse mot urbane forurensninger.Vi samler prøver fra forskjellige steder og populasjoner for å studere variasjon over art eller rom. Nøter, kjølere og konvolutter er våre viktigste verktøy i felten. Sommerfuglegenskaper måles ved mikroskopi og ICP-MS er den beste metoden for å måle tungmetallkonsentrasjoner i små prøver.En av dagens eksperimentelle utfordringer er å studere variasjonen på tvers av arter og deres utviklingsmessige tilpasninger til menneskelige miljøer. Hovedproblemet ligger i oppdrett av forskjellige arter under kontrollerte eksperimentelle forhold. Mens kålhvite sommerfugler er enkle å heve, er det en betydelig utfordring fra et eksperimentelt perspektiv å finne passende analoge dietter for 10 eller 20 forskjellige arter som lever av forskjellige planter.Vi er interessert i å redusere eksponeringen for urbane toksiner, de økologiske inngrepene som kan redusere giftigheten av tungmetaller og andre urbane forurensninger, som mikroplast, blir undersøkt. I tillegg tar vi sikte på å undersøke hvordan man kan designe lommer av habitat i byrom for å oppmuntre helsen til planter og dyr som bor der, inkludert mennesker.