Imagem de Longo Prazo de Populações Neurais Identificadas Usando Microprismas em Animais em Movimento Livre e Cabeça Fixada

Summary

Quando integrada com uma placa de cabeça e um design óptico compatível com microscópios de um e dois fótons, a lente de microprisma apresenta uma vantagem significativa na medição de respostas neurais em uma coluna vertical sob diversas condições, incluindo experimentos bem controlados em estados fixos na cabeça ou tarefas comportamentais naturais em animais em movimento livre.

Abstract

Com o avanço da microscopia multifóton e das tecnologias moleculares, a imagem por fluorescência está crescendo rapidamente para se tornar uma abordagem poderosa para estudar a estrutura, a função e a plasticidade dos tecidos cerebrais vivos. Em comparação com a eletrofisiologia convencional, a microscopia de fluorescência pode capturar a atividade neural, bem como a morfologia das células, permitindo registros de longo prazo das populações de neurônios identificadas em resolução unicelular ou subcelular. No entanto, imagens de alta resolução normalmente requerem uma configuração estável e fixa na cabeça que restringe o movimento do animal, e a preparação de uma superfície plana de vidro transparente permite a visualização de neurônios em um ou mais planos horizontais, mas é limitada no estudo dos processos verticais que atravessam diferentes profundidades. Aqui, descrevemos um procedimento para combinar uma fixação da placa cefálica e um microprisma que fornece imagens multicamadas e multimodais. Este preparo cirúrgico não apenas dá acesso a toda a coluna do córtex visual do camundongo, mas permite imagens de dois fótons em uma posição fixa da cabeça e imagens de um fóton em um paradigma de movimento livre. Usando essa abordagem, pode-se amostrar populações celulares identificadas em diferentes camadas corticais, registrar suas respostas sob estados de cabeça fixa e movimento livre, e rastrear as mudanças de longo prazo ao longo de meses. Assim, este método fornece um ensaio abrangente dos microcircuitos, permitindo a comparação direta das atividades neurais evocadas por estímulos bem controlados e sob um paradigma comportamental natural.

Introduction

O advento da imagem fluorescente in vivo de dois fótons ^1,2, combinando as novas tecnologias em sistemas ópticos e indicadores de fluorescência geneticamente modificados, surgiu como uma técnica poderosa em neurociência para investigar a intrincada estrutura, função e plasticidade no cérebro vivo ^3,4. Em particular, esta modalidade de imagem oferece uma vantagem incomparável sobre a eletrofisiologia tradicional por capturar tanto a morfologia quanto as atividades dinâmicas dos neurônios, facilitando o rastreamento em longo prazo dos neurônios identificados....

Protocol

Todos os experimentos foram conduzidos de acordo com o UK Animals (Scientific Procedures) Act 1986 sob licenças pessoais e de projeto aprovadas e emitidas pelo Ministério do Interior do Reino Unido após revisão ética apropriada. Linhagens transgênicas adultas CaMKII-TTA; GCaMP6S-TRE²¹ foram criados e seus filhotes utilizados no experimento. Para a segurança dos experimentadores e a manutenção de condições estéreis, todos os procedimentos foram realizados em condições assépticas e co.......

Discussion

Aqui, mostramos a capacidade de observar e comparar diretamente neurônios em condições de cabeça fixa e movimento livre nas mesmas populações neurais. Embora tenhamos demonstrado a aplicação no córtex visual, este protocolo pode ser adaptado a uma infinidade de outras áreas cerebrais, tanto áreas corticais quanto núcleos profundos24,25,26,27,28, bem como outras configurações comportamentais e de

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% Sodium Chloride solution for infusion (Vetivex 11) 250ml	Dechra	20091607	Saline for hydration and drug reconsitution
18004-1 Trephine 1.8mm diameter bur	FST	18004-18	Drill bit
1ml syringe	Terumo	MDSS01SE	1ml syringe
23G x 5/8 inch 6% LUER needle	Terumo	NN-2316R	23G needle
71000 Automated stereotaxic apparatus w/ built-in software	RWD	-	RWD
Absorbable Haemostatic Gelatin Sponge (10x10x10mm)	Surgispon	SSP-101010	gel-foam
Alcohol pads 70% isopropyl alcohol	Braun	9160612	Alcohol pads
Aluminium foil	Any retailer	-	Foil to cover eyes during surgery
Articifical Cerebrospinal Fluid	Tocris Bioscience a Bio-Techne Brand	3525/25ML	ACSF
Automated microinjection pump	WPI	8091
Betadine solution (10% iodinated Povidone) 500ml	Videne/Ecolab	3030440	Betadine
Bruker Ultime 2Pplus (customised)	Bruker	-	Two-photon imaging system
Cardiff Aldasorber	Vet-Tech	AN006	Anaesthesia absorber
CFI S Plan Fluor ELWD ADM 20XC	Nikon	MRH48230	20x objective lens
Compact Anaesthesia system - single gas - isoflurane K/F, with oxygen concentrator model: ZY-5AC and scavenging unit	Vet-Tech	AN001	Compact anaesthesia system
Contec Prochlor	Aston Pharma	AP2111L1	Disinfectant (hypochlorous acid)
Dexamethasone Sodium Phosphate Injection, USP, 4mg/ml, NDC: 0641-6145-25	Hikma	Covetrus:70789	Dexamethasone
Dissecting Knife, cutting edge 4mm, thickness 0.5mm, stainless steel	Fine Science Tools	10055-12	Knife for incisino of cortex
Dual-Sided, Non-Puncture Mouse & Neonatal Rat Ear Bars	Stoelting	51649	Ear bar
Dummy microscope	Inscopix	Dummy microscope	To help with implantation
Ethanol (100%)	VWR	40-1712-25	Used to make 70% ethanol
Fisherbrand Nitrile Indigo Disposable Gloves PPE Cat III	FischerScientific	17182182	Gloves
Homeothermic Monitor 50-7222-F	Harvard Apparatus	50-7222-F	Homeothermic monitoring system/heating pad
Image processing software	ImageJ	-	Image processing software
Inscopix Data Processing Software (IDPS)	Inscopix	-	One-photon calcium imaging processing software
Insight Duals-232, S/N 2043	InSight	Insight Spectra X3	Two-photon imaging laser
IsoFlo 250ml 100% w/w inhalation	Zoetis	WM 42058/4195	Isoflurane
Kwik-Sil Low Toxicity Silicone Adhesive	World Precision Intruments (WPI)	KWIK-SIL	Silicone adhesive
MICROMOT mains adapter NG 2/S, w/ Drill unit 60/E	PROXXON	NO 28 515	Handheld drill
nVoke Integrated Imaging and Optogenetics System package	Inscopix	-	One-photon Imaging system and software
ProView Implant Kit	Inscopix	ProView Implant Kit	Dummy microscope, stereotaxic arm and attachment
ProView Prism Probe	Inscopix	1050-002203	Microprism lens
Rimadyl (50mg/ml)	Zoetis	VM 42058/4123	Carprofen
Stereotaxis Microscope on Articulated arm with table clamp	WPI	PZMTIII-AAC	Microscope
Super-Bond Universal kit, SUN Medical	Prestige-Dental	K058E	Adhesive cement
Two-photon calcium image software	Suite2P	-	Two-photon calcium imaging processing software
Vapouriser	Vet-Tech	-	Isoflurane vapouriser
Xailin Lubricating Eye Ointment 5g	Xailin-Night	MLG/28/1551	Ophthalmic ointment