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Se desarrolló un marco de imágenes hiperespectrales rápidas y multimodales para obtener imágenes de generación de suma de frecuencia vibracional (VSFG) de banda ancha, junto con modalidades de imágenes de generación de segundos armónicos (SHG) de campo claro. Debido a que la frecuencia infrarroja es resonante con las vibraciones moleculares, se revela el conocimiento microscópico estructural y de la morfología mesoscópica de las muestras permitidas por simetría.
La generación vibracional de suma de frecuencia (VSFG), una señal óptica no lineal de segundo orden, se ha utilizado tradicionalmente para estudiar moléculas en interfaces como una técnica de espectroscopia con una resolución espacial de ~100 μm. Sin embargo, la espectroscopia no es sensible a la heterogeneidad de una muestra. Para estudiar muestras mesoscópicamente heterogéneas, nosotros, junto con otros, empujamos el límite de resolución de la espectroscopia VSFG hasta un nivel de ~1 μm y construimos el microscopio VSFG. Esta técnica de imagen no solo puede resolver las morfologías de las muestras a través de imágenes, sino que también registra un espectro VSFG de banda ancha en cada píxel de las imágenes. Al ser una técnica óptica no lineal de segundo orden, su regla de selección permite la visualización de estructuras autoensambladas no centrosimétricas o quirales que se encuentran comúnmente en biología, ciencia de materiales y bioingeniería, entre otras. En este artículo, se guiará a la audiencia a través de un diseño de transmisión invertida que permite obtener imágenes de muestras no fijadas. Este trabajo también muestra que la microscopía VSFG puede resolver información geométrica química específica de láminas autoensambladas individuales combinándola con un solucionador de funciones de red neuronal. Por último, las imágenes obtenidas bajo configuraciones de campo claro, SHG y VSFG de varias muestras discuten brevemente la información única revelada por las imágenes VSFG.
La generación vibracional de suma de frecuencia (VSFG), una técnica óptica no lineal de segundo orden1,2, se ha utilizado ampliamente como herramienta de espectroscopia para perfilar químicamente muestras con simetría permitida 3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13, 14,15,16,17,18,19,20,21,22. Tradicionalmente, VSFG se ha aplicado a los sistemas interfaciales 8,9,10,11 (es decir, gas-líquido, líquido-líquido, gas-sólido, sólido-líquido), que carecen de simetría de inversión, un requisito para la actividad de VSFG. Esta aplicación de VSFG ha proporcionado una gran cantidad de detalles moleculares de las interfaces enterradas 12,13, las configuraciones de las moléculas de agua en las interfaces 14,15,16,17,18 y las especies químicas en las interfaces 19,20,21,22.
Aunque VSFG ha sido poderoso en la determinación de especies moleculares y configuraciones en interfaces, su potencial en la medición de estructuras moleculares de materiales que carecen de centros de inversión no se ha cumplido. Esto se debe en parte a que los materiales podrían ser heterogéneos en su entorno químico, composiciones y disposición geométrica, y un espectrómetro VSFG tradicional tiene una gran área de iluminación del orden de 100 μm2. Por lo tanto, la espectroscopia VSFG tradicional informa sobre la información promediada por conjuntos de la muestra en un área de iluminación típica de 100 μm2. Este promedio de conjuntos puede conducir a cancelaciones de señales entre dominios bien ordenados con orientaciones opuestas y a una caracterización errónea de las heterogeneidades locales 15,20,23,24.
Con los avances en los objetivos de microscopio basados en reflectantes de alta apertura numérica (NA) (geometrías Schwarzschild y Cassegrain), que están casi libres de aberraciones cromáticas, el tamaño de enfoque de los dos haces en experimentos VSFG puede reducirse de 100 μm 2 a 1-2 μm2 y, en algunos casos, submicrónico25. Incluyendo este avance tecnológico, nuestro grupo y otros han desarrollado VSFG en una plataforma de microscopía 20,23,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36. Recientemente, hemos implementado un diseño óptico invertido y un esquema de detección de banda ancha37, que permite una recopilación perfecta de imágenes multimodales (VSFG, segunda generación de armónicos (SHG) y óptica de campo claro). Las imágenes multimodales permiten una inspección rápida de las muestras mediante imágenes ópticas, correlacionando varios tipos de imágenes y localizando las posiciones de las señales en las imágenes de la muestra. Con la óptica de iluminación acromática y la elección de la fuente de iluminación láser pulsada, esta plataforma óptica permite la integración perfecta en el futuro de técnicas adicionales como la microscopía de fluorescencia38 y la microscopía Raman, entre otras.
En esta nueva disposición, se han estudiado muestras como organizaciones jerárquicas y una clase de autoensamblajes moleculares (MSA). Estos materiales incluyen el colágeno y la biomimética, donde tanto la composición química como la organización geométrica son importantes para la función final del material. Debido a que VSFG es una señal óptica no lineal de segundo orden, es específicamente sensible a los arreglos intermoleculares39,40, como la distancia intermolecular o los ángulos de torsión, lo que lo convierte en una herramienta ideal para revelar tanto composiciones químicas como arreglos moleculares. Este trabajo describe las modalidades VSFG, SHG y de campo claro del instrumento central que consiste en un láser de estado sólido de cavidad dopada con iterbio que bombea un amplificador paramétrico óptico (OPA), un microscopio invertido multimodal construido en casa y un analizador de frecuencia monocromador acoplado a un detector de dispositivo acoplado cargado bidimensional (CCD)27. Se proporciona un procedimiento de construcción y alineación paso a paso, y una lista completa de piezas de la configuración. Un análisis en profundidad de un MSA, cuya subunidad molecular fundamental está compuesta por una molécula de sulfato de sodio-dodecilo (SDS), un tensioactivo común, y dos moléculas de β-ciclodextrina (β-CD), conocida como SDS@2 β-CD en este documento, también se proporciona como ejemplo para mostrar cómo VSFG puede revelar detalles geométricos específicos de moléculas de materia organizada. También se ha demostrado que los detalles geométricos específicos de la MSA se pueden determinar con un enfoque de solucionador de funciones de red neuronal.
1. Microscopio VSFG de barrido de línea hiperespectral
Figura 1: Microscopio VSFG hiperespectral multimodal. (A) Vista superior de la configuración principal. Se envió un láser de bomba de 1025 nm a un OPA para generar un pulso de infrarrojo medio sintonizable. Los 1025 nm residuales se estrechaban con frecuencia con un etalón (E) y se filtraban espacialmente en un haz gaussiano mediante un filtro espacial (SFG). Los haces de infrarrojo medio y de 1025 nm se superponen espacialmente en un espejo dicroico (DM) personalizado y se guían a través del microscopio invertido (región encajonada en A). (B) Los dos haces se envían a un escáner de haz resonante de 325 Hz montado en un control deslizante integrado de 2 posiciones (I2PS), lo que permite cambiar sin problemas entre las modalidades ópticas de campo claro y no lineales. La plataforma del microscopio está equipada con un objetivo Schwarzschild (SO) con corrección al infinito basado en la reflexión que actúa como condensador y un objetivo de imagen (RO) con corrección al infinito basado en la refracción montado en una platina del eje z de nanoposicionamiento vertical (VNP). El SO enfoca la línea de haces entrantes que el escáner de haz resonante refleja en la muestra mientras que el RO recopila la sección de señales de la línea VSFG. Es importante controlar con precisión la posición del eje z de la ósmosis inversa con una precisión de 1 μm para garantizar que la muestra esté en las mejores condiciones focales para obtener imágenes de alta calidad. La línea colimada de la señal VSFG se dirige a un sistema de lentes de tubo compuesto por 2 lentes de tubo (TL1 y TL2), formando una imagen ampliada en la rendija de entrada del monocromador (MC). A continuación, se obtiene una imagen hiperespectral de la línea de espectros con resolución de frecuencia en un dispositivo de carga acoplada (CCD). Después de recolectar cada línea hiperespectral, la muestra se escanea en el eje perpendicular al eje de escaneo del escáner de haz resonante utilizando el NP. Para recoger imágenes de campo claro de la muestra, el I2PS se mueve a la posición de campo claro y se instala un espejo que intercepta la fuente de luz blanca (WLS). A continuación, la luz es enfocada por el RO y fotografiada por el SO. A continuación, se forma una imagen en el plano del sensor de la cámara de campo claro (BC) en la parte superior del microscopio invertido. (C) Vista detallada de la trayectoria óptica a través del área de la lente del tubo hacia el MC y el CCD. (D) Vista detallada del área de muestra entre el SO y el RO. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
2. Alineación del microscopio hiperespectral y calibración espacial del eje CCD vertical
Figura 2: Calidad de imagen representativa para la alineación aproximada de la modalidad de imágenes de campo claro de un patrón de ZnO. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Flujo de trabajo de calibración del eje vertical. Esta figura ilustra cómo convertir los píxeles CCD a dimensiones espaciales verticales en la unidad de μm. (A) Se recopila y reconstruye una imagen del cubreobjetos con patrón de ZnO. Luego, la distancia en píxeles de uno a los otros bordes del patrón (pequeña barra vertical en A). Debido a que la cruz del patrón de ZnO está diseñada para tener un ancho de 25 μm, se puede usar la relación entre el ancho físico y el ancho de píxel aquí para calcular la relación de dimensión física/píxel. En (B) se muestra una imagen representativa calibrada del eje vertical. (C) Por último, se toma un corte vertical como lo indica la línea roja. (D) Se toma la derivada de la rebanada vertical para obtener la resolución espacial. La derivada de la rebanada vertical se utiliza para obtener la resolución espacial. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
3. Recopilación de datos hiperespectrales
4. Análisis de datos hiperespectrales
5. Análisis geométrico de la muestra
Figura 4: Ilustración de la transformación de Euler. (A) Ilustración de la transformación de Euler entre la susceptibilidad de segundo orden χ(2) de las coordenadas de laboratorio (XYZ) y la hiperpolarizabilidad de las coordenadas moleculares (xyz) βijk. z-y'-z'' La rotación de Euler se realiza en las coordenadas moleculares, siendo φ como el ángulo de rotación en el plano, θ como el ángulo de inclinación y ψ como el ángulo de torsión. ψ está integrado para ángulos de torsión arbitrarios sobre el eje molecular. φ no se integra porque todas las moléculas giran en un ángulo específico en relación con el marco del laboratorio para formar las láminas autoensambladas. N es la cobertura relativa de la superficie de las dos hojas. (B) Visualización de las subunidades inclinadas que forman una hoja determinada por los resultados de la red neuronal. Esta figura ha sido modificada a partir de Wagner et al.27. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Estructura molecular, morfología y orientación potencial del SDS@β-CD. (A) Vista superior y (B) vista lateral de la estructura química del SDS@β-CD. (C) Distribución muestral heterogénea representativa de las láminas de mesoescala en el plano muestral. La subunidad molecular podrí...
Los pasos más críticos son de 1,42 a 1,44. Es fundamental alinear bien la lente del objetivo para obtener una resolución espacial óptica. También es importante recoger la señal emitida, retransmitir y proyectar el haz de escaneo como una línea en las rendijas de entrada. Las alineaciones adecuadas garantizarían la mejor resolución y la mejor relación señal-ruido. Para una muestra típica, como hojas de SDS@2 β-CD de 100 μm por 100 μm, una imagen de buena resolución (~1 μm de resolución) con una alta rela...
Los autores no tienen nada que revelar.
El desarrollo del instrumento cuenta con el apoyo de la subvención NSF CHE-1828666. ZW, JCW y WX cuentan con el apoyo de los Institutos Nacionales de Salud, Instituto Nacional de Ciencias Médicas Generales, Subvención 1R35GM138092-01. BY cuenta con el apoyo de la Asociación de Promoción de la Innovación Juvenil de la Academia China de Ciencias (CAS, 2021183).
Name | Company | Catalog Number | Comments |
1x Camera Por | Thorlabs | WFA4100 | connect a camera to a microscope or optical system |
25.0 mm Right-Angle Prism Mirror, Protected Gold | Thorlabs | MRA25-M01 | reflect light and produce retroreflection, redirecting light back along its original path |
3” Universal Post Holder-5 Pack | Thorlabs | UPH3-P5 | hold and support posts of various sizes and configurations |
30 mm to 60 mm Cage Plate, 4 mm Thick | Thorlabs | LCP4S | convert between a 30 mm cage system and a 60 mm cage system |
500 mm Tall Cerna Body with Epi Arm | Thorlabs | CEA1500 | provide the function of enabling top illumination techniques in microscopy |
60 mm Cage Mounted Ø50.0 mm Iris | Thorlabs | LCP50S | control the amount of light passing through an optical system |
60 mm Cage Mounting Bracket | Thorlabs | LCP01B | mount and position a 60 mm cage system in optical setups |
Air spaced Etalon | SLS Optics Ltd. | Customized | generate narrow-band 1030 nm light |
Cage Plate Mounting Bracket | Thorlabs | KCB2 | hold and adjust mirrors at a precise angle |
CCD | Andor Technologies | Newton | 2D CCD for frequency and spatial resolution |
Collinear Optical Parametric Amplifier | Light Conversion | Orpheus-One-HP | Tunable MID light generator |
Copper Chloride | Thermo Fischer Scientific | A16064.30 | Self-assembly component |
Customized Dichroic Mirror | Newport | Customized | selectively reflects or transmits light based on its wavelength or polarization |
Ext to M32 Int Adapter | Thorlabs | SM1A34 | provide compatibility and facilitating the connection between components with different thread types |
Infinity Corrected Refractive Objective | Zeiss | 420150-9900-000 | Refractive Objective |
Infinity Corrected Schwarzschild Objective | Pike Technologies Inc. | 891-0007 | Reflective objective |
Laser | Carbide, Light-Conversion | C18212 | Laser source |
M32x0.75 External to Internal RMS | Thorlabs | M32RMSS | adapt or convert the threading size or type of microscope objectives |
M32x0.75 External to M27x0.75 Internal Engraving | Thorlabs | M32M27S | adapt or convert the threading size or type of microscope objectives |
Manual Mid-Height Condenser Focus Module | Thorlabs | ZFM1030 | adjust the focus of an optical element |
Monochromator | Andor Technologies | Shamrock 500i | Provides frequency resolution for each line scan |
Motorized module with 1" Travel for Edge-Mounted Arms | Thorlabs | ZFM2020 | control the vertical positon of the imaging objective |
Nanopositioner | Mad City Labs Inc. | MMP3 | 3D sample stage |
Resonant Scanner | EOPC | SC-25 | 325Hz resonant beam scanner |
RGB Color CCD Camera | Thorlabs | DCU224C | Brightfield camera, discontinued but other cameras will work just as well |
RGB tube lens | Thorlabs | ITL200 | white light collection |
Right Angle Kinematic Breadboard | Thorlabs | OPX2400 | incorporate a sliding mechanism with two fixed positions |
Right Angle Kinematic Mirror Mount, 30 mm | Thorlabs | KCB1 | hold and adjust mirrors at a precise angle |
Right Angle Kinematic Mirror Mount, 60 mm | Thorlabs | KCB2 | hold and adjust mirrors at a precise angle |
SM2, 60 mm Cage Arm for Cerna Focusing Stage | Thorlabs | CSA2100 | securely mount and position condensers |
Snap on Cage Cover for 60 mm Cage, 24 in Long, | Thorlabs | C60L24 | enclose and protect the components inside the cage |
Sodium dodecyl sulfate | Thermo Fischer Scientific | J63394.AK | Self-assembly component |
Three-Chnnale Controller and Knob Box for 1" Cerna Travel Stages | Thorlabs | MCM3001 | control ZFM2020 |
Tube lens | Thorlabs | LA1380-AB - N-BK7 | SFG signal collection |
Visible LED Set | Thorlabs | WFA1010 | provide illumination in imaging setup |
Whitelight Source | Thorlabs | WFA1010 | Whitelight illumination source for brightfield imaging |
WPH05M-1030 - Ø1/2" Zero-Order Half-Wave Plate, Ø1" Mount, 1030 nm | Thorlabs | WPH05M-1030 | alter the polarization state of light passing through it |
WPLQ05M-3500 - Ø1/2" Mounted Low-Order Quarter-Wave Plate, 3.5 µm | Thorlabs | WPLQ05M-3500 | alter the polarization state of light passing through it |
X axis Long Travel Steel Extended Contact Slide Stages | Optosigma | TSD-65122CUU | positioning stages that offer extended travel in the horizontal (X) direction |
XT95 4in Rail Carrier | Thorlabs | XT95RC4 | mount and position optical components |
X-Y Axis Translation Stage w/ 360 deg. Rotation | Thorlabs | XYR1 | precise movement and positioning of objects in two dimensions, along with the ability to rotate the platform |
XY(1/2") Linear Translator with Central SM1 Thru Hole | Thorlabs | XYT1 | provide precise movement and positioning in two dimensions |
Yb doped Solid State Laser | Light Conversion | CB3-40W | Seed laser |
β-Cyclodextrin | Thermo Fischer Scientific | J63161.22 | Self-assembly component |
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