Isolamento di cellule endoteliali linfatiche dermiche murine

Summary

Questo articolo descrive un metodo per l'isolamento basato su biglie magnetiche di cellule endoteliali murine dai capillari linfatici dermici. Le cellule endoteliali linfatiche isolate possono essere utilizzate per esperimenti in vitro a valle e per l'analisi dell'espressione proteica.

Abstract

Il sistema linfatico partecipa alla regolazione della sorveglianza immunitaria, dell'assorbimento dei lipidi e dell'equilibrio dei liquidi tissutali. L'isolamento delle cellule endoteliali linfatiche murine è un processo importante per la ricerca linfatica, in quanto consente l'esecuzione di esperimenti in vitro e biochimici sulle cellule isolate. Inoltre, lo sviluppo della tecnologia Cre-lox ha permesso la carenza tessuto-specifica di geni che non possono essere bersagliati a livello globale, portando alla determinazione precisa del loro ruolo nei tessuti studiati. La dissezione del ruolo di alcuni geni nella fisiologia linfatica e nella fisiopatologia richiede l'uso di promotori linfatici-specifici e, quindi, la verifica sperimentale dei livelli di espressione dei geni bersaglio.

I metodi per l'isolamento efficiente di cellule endoteliali linfatiche da topi wild-type o transgenici consentono l'uso di saggi ex vivo e in vitro per studiare i meccanismi che regolano le funzioni linfatiche e l'identificazione dei livelli di espressione delle proteine studiate. Abbiamo sviluppato, standardizzato e presentato un protocollo per l'isolamento efficiente di cellule endoteliali linfatiche dermiche murine (DLEC) tramite purificazione con biglie magnetiche basato sull'espressione di LYVE-1. Il protocollo delineato mira a fornire ai ricercatori uno strumento per comprendere e chiarire ulteriormente gli attori importanti delle funzioni delle cellule endoteliali linfatiche, in particolare nelle strutture in cui non sono disponibili apparecchiature di smistamento cellulare attivate dalla fluorescenza.

Introduction

Il sistema linfatico svolge un ruolo fondamentale nella fisiologia umana. È considerato un fattore omeostatico vitale, che facilita funzioni importanti, come il mantenimento dell'equilibrio dei fluidi tissutali-plasmatici, la sorveglianza immunitaria e l'assorbimento dei lipidi¹, nonché funzioni recentemente identificate, come la capacità di riparazione del cuore² e la capacità rigenerativa dell'osso e l'emopoiesi³. Nonostante il ruolo significativo del sistema linfatico, diversi aspetti del ruolo dei linfatici, così come i meccanismi molecolari che governano alcuni parametri fisiologici e le risp....

Protocol

Gli studi sugli animali sono stati eseguiti secondo i protocolli approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) del Texas Tech University Health Sciences Center (TTUHSC) per gli esperimenti presso il TTUHSC e dall'Amministrazione veterinaria della Prefettura della Grecia occidentale secondo la direttiva 2010/63 per gli esperimenti presso l'Università di Patrasso. Seguire diligentemente le norme sullo smaltimento dei rifiuti durante lo smaltimento dei materiali di scarto animale.

Discussion

Il sistema linfatico è un importante regolatore della funzione omeostatica del corpo, con le funzioni più importanti che sono il mantenimento del plasma fluido, la rimozione dei sottoprodotti del metabolismo cellulare e delle molecole tossiche, l'assorbimento dei lipidi e il traffico delle cellule immunitarie ^1,19. L'identificazione di marcatori appropriati ha provocato un'esplosione di nuovi dati nel campo linfatico, rivelando nuove funzioni del sistema vascol.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 μm Syringe Filters	Fisher Scientific	09-719C
100 mm Tissue Culture Dishes	Fisher Scientific	FB012924
60 mm Tissue Culture Dishes	Fisher Scientific	FB012921
Animal Hair Clipper	Wahl
Antibiotic-Antimycotic Solution 100x	Fisher Scientific	15240-062
Blunt Forceps	Fine Science Tools	11992-20
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A4919
Cell Strainer 40 μm	Fisher Scientific	542040
Cell Strainer 70 μm	Fisher Scientific	542070
CO2 Incubator
Collagen I, High Concentration Rat Tail	Corning	354249	dilute in 0.02 M Acetic Acid in H2O
Collagenase Type II	Life Technologies	17101-015
Dispase	Life Technologies	17105-041
DMEM	Fisher Scientific	11-995-073
DNAse I Solution (2,500 U/mL)	Thermo Scientific	90083
Dynal MPC-L Magnetic Particle Concentrator	Invitrogen	120-21D
EDTA	Sigma-Aldrich	3690
Endothelial Cell Growth Base Medium & Supplement (LEC medium)	R&D Systems	CCM027
Euthanasia chamber	Euthanex Corporation
Fine Forceps	Fine Science Tools	11255-20
Fine Scissors-Sharp	Fine Science Tools	14060-10
FITC anti-mouse F4/80 Antibody	Biolegend	123107
Goat Anti-Rabbit IgG Magnetic Beads	New England Biolabs	S1432S
LARC-A E-Z Anesthesia Induction Chamber	Euthanex Corporation
MagnaBind Goat Anti-Rabbit IgG Beads	Thermo Scientific	21356
Paraformaldehyde Solution 4% in PBS	Fisher Scientific	AAJ19943K2
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Fisher Scientific	SH30256FS
Rabbit Anti-Mouse LYVE-1	ReliaTech GmbH	103-PA50
Rotating/Shaking Incubator
Round-Bottom Polypropylene Tubes	Corning	352063
Syringe Filters w 0.2 μm Pores	Fisher Scientific	09-719C
Trypsin-EDTA	Fisher Scientific	25-300-120