Isolamento de células endoteliais linfáticas dérmicas murinas

Summary

Este artigo descreve um método para isolamento baseado em esferas magnéticas de células endoteliais murinas de capilares linfáticos dérmicos. As células endoteliais linfáticas isoladas podem ser usadas para experimentos in vitro a jusante e análise de expressão de proteínas.

Abstract

O sistema linfático participa da regulação da vigilância imunológica, absorção de lipídios e equilíbrio de fluidos teciduais. O isolamento de células endoteliais linfáticas murinas é um processo importante para a pesquisa linfática, pois permite a realização de experimentos in vitro e bioquímicos nas células isoladas. Além disso, o desenvolvimento da tecnologia Cre-lox permitiu a deficiência específica do tecido de genes que não podem ser direcionados globalmente, levando à determinação precisa de seu papel nos tecidos estudados. A dissecação do papel de certos genes na fisiologia e fisiopatologia linfática requer o uso de promotores linfático-específicos e, portanto, a verificação experimental dos níveis de expressão dos genes-alvo.

Métodos para isolamento eficiente de células endoteliais linfáticas de camundongos selvagens ou transgênicos permitem o uso de ensaios ex vivo e in vitro para estudar os mecanismos que regulam as funções linfáticas e a identificação dos níveis de expressão das proteínas estudadas. Desenvolvemos, padronizamos e apresentamos um protocolo para o isolamento eficiente de células endoteliais linfáticas dérmicas murinas (DLECs) via purificação de esferas magnéticas com base na expressão de LYVE-1. O protocolo descrito visa equipar os pesquisadores com uma ferramenta para entender e elucidar ainda mais os atores importantes das funções das células endoteliais linfáticas, especialmente em instalações onde o equipamento de classificação de células ativadas por fluorescência não está disponível.

Introduction

O sistema linfático desempenha um papel fundamental na fisiologia humana. É considerado um fator homeostático vital, que facilita funções importantes, como a manutenção do equilíbrio hídrico tecidual-plasmático, a vigilância imunológica e a absorção de lipídios¹, bem como funções recentemente identificadas, como a capacidade de reparo do coração² e a capacidade regenerativa do osso e hematopoiese³. Apesar do papel significativo do sistema linfático, vários aspectos do papel dos linfáticos, bem como os mecanismos moleculares que governam certos parâmetros e respostas fisiológicas, permanecem indefi....

Protocol

Os estudos em animais foram realizados de acordo com os protocolos aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) do Centro de Ciências da Saúde da Texas Tech University (TTUHSC) para os experimentos no TTUHSC e pela Administração Veterinária da Prefeitura da Grécia Ocidental de acordo com a Diretiva 2010/63 para os experimentos na Universidade de Patras. Siga diligentemente os regulamentos de descarte de resíduos ao descartar resíduos animais.

1. Isola.......

Discussion

O sistema linfático é um importante regulador da função homeostática do organismo, sendo as funções mais importantes a manutenção do plasma fluido, a remoção de subprodutos do metabolismo celular e moléculas tóxicas, a absorção de lipídios e o tráfego de células imunes ^1,19. A identificação de marcadores apropriados provocou uma explosão de novos dados no campo linfático, revelando novas funções da vasculatura linfática, como seu papel no.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 μm Syringe Filters	Fisher Scientific	09-719C
100 mm Tissue Culture Dishes	Fisher Scientific	FB012924
60 mm Tissue Culture Dishes	Fisher Scientific	FB012921
Animal Hair Clipper	Wahl
Antibiotic-Antimycotic Solution 100x	Fisher Scientific	15240-062
Blunt Forceps	Fine Science Tools	11992-20
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A4919
Cell Strainer 40 μm	Fisher Scientific	542040
Cell Strainer 70 μm	Fisher Scientific	542070
CO2 Incubator
Collagen I, High Concentration Rat Tail	Corning	354249	dilute in 0.02 M Acetic Acid in H2O
Collagenase Type II	Life Technologies	17101-015
Dispase	Life Technologies	17105-041
DMEM	Fisher Scientific	11-995-073
DNAse I Solution (2,500 U/mL)	Thermo Scientific	90083
Dynal MPC-L Magnetic Particle Concentrator	Invitrogen	120-21D
EDTA	Sigma-Aldrich	3690
Endothelial Cell Growth Base Medium & Supplement (LEC medium)	R&D Systems	CCM027
Euthanasia chamber	Euthanex Corporation
Fine Forceps	Fine Science Tools	11255-20
Fine Scissors-Sharp	Fine Science Tools	14060-10
FITC anti-mouse F4/80 Antibody	Biolegend	123107
Goat Anti-Rabbit IgG Magnetic Beads	New England Biolabs	S1432S
LARC-A E-Z Anesthesia Induction Chamber	Euthanex Corporation
MagnaBind Goat Anti-Rabbit IgG Beads	Thermo Scientific	21356
Paraformaldehyde Solution 4% in PBS	Fisher Scientific	AAJ19943K2
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Fisher Scientific	SH30256FS
Rabbit Anti-Mouse LYVE-1	ReliaTech GmbH	103-PA50
Rotating/Shaking Incubator
Round-Bottom Polypropylene Tubes	Corning	352063
Syringe Filters w 0.2 μm Pores	Fisher Scientific	09-719C
Trypsin-EDTA	Fisher Scientific	25-300-120