Riproducibilità e armonizzazione nella ricerca utilizzando standard biologici: l'esempio del peptide correlato al collagene agonista piastrinico

Summary

Qui presentiamo un metodo per standardizzare il peptide correlato al collagene agonista piastrinico cross-linked (CRP-XL) utilizzando l'aggregometria a trasmissione luminosa. Sebbene il protocollo sia mirato alla funzione piastrinica, il processo sperimentale può essere applicato alla maggior parte delle molecole biologiche e dei saggi biologici per garantire rigore scientifico e riproducibilità.

Abstract

La metrologia - la scienza della misura - è una materia che pochi scienziati biologici vengono istruiti nella loro formazione a loro danno; L'applicazione di semplici processi di standardizzazione alle pratiche di lavoro quotidiane fornisce fiducia nei dati e riproducibilità a distanza e nel tempo.

Questo metodo dimostra come standardizzare un esperimento di laboratorio di base ampiamente utilizzato nella ricerca sull'emostasi e nella pratica clinica, in particolare, misurando le risposte al peptide correlato al collagene agonista del recettore piastrinico (glicoproteina [GP]VI), reticolato (CRP-XL) mediante aggregometria a trasmissione luminosa (LTA). L'utilizzo di questo approccio garantirà la riproducibilità intra-laboratorio e l'armonizzazione inter-laboratorio, indipendentemente dallo stock o dal fornitore di agonisti. È importante sottolineare che questo metodo è applicabile ad altri agonisti piastrinici e, in effetti, a molte altre molecole biologiche e saggi biologici.

Il processo descritto di seguito prevede la creazione di una serie di diluizioni a 6-8 punti dello "standard" e del "test" (il materiale che si sta controllando) e l'esecuzione fianco a fianco in un saggio scelto (in questo caso, LTA). Il CRP-XL viene utilizzato a concentrazioni di massa/volume, ma non tutti i materiali danno la stessa attività biologica a una data concentrazione, quindi viene effettuata una serie di diluizioni per confrontare il materiale standard e quello di prova e determinare quale concentrazione è necessaria per dare un'attività equivalente. La serie di diluizione deve estendersi da 0 a 100% di aggregazione. I dati vengono tracciati utilizzando la regressione non lineare e viene determinato il valore EC₅₀ di ciascun campione (standard e test). Per assegnare l'attività, dividere il valore EC₅₀ dello standard per quello del test per determinare quanto è più o meno potente e regolare la concentrazione di conseguenza. Questo approccio garantirà che la stessa "attività" biologica venga aggiunta al test più e più volte.

Introduction

Molti di noi usano agonisti e antagonisti biologici nei nostri esperimenti, il più delle volte in un saggio biologico che quantifica il loro effetto sulla funzione cellulare in condizioni specifiche. Il metodo qui descritto è per l'agonista piastrinico collagene-related peptide, cross-linked (CRP-XL), un agonista della glicoproteina VI che attiva le piastrine e la cui attività può essere misurata in una varietà di saggi (aggregometria a trasmissione luminosa, microscopia, citometria a flusso, rilascio di Ca²⁺ , ecc.), ma il protocollo di standardizzazione dell'agonista è applicabile a qualsiasi agonista/antagonista biologico e/o biodosaggio. Le scienze fisiche sono esperte nell'uso degli standard nelle loro pratiche di lavoro quotidiane e le aziende che sviluppano farmaci bioterapeutici nel settore commerciale comprendono il valore dell'utilizzo di standard di riferimento¹, ma rimangono sottoutilizzati da molti scienziati biologici, specialmente nella comunità di ricerca accademica, e la loro mancanza di utilizzo ha un impatto negativo sulla qualità della produzione scientifica.

CRP-XL è un agonista specifico specifico per GPVI che il campo piastrinico ha utilizzato per decenni dalla sua descrizione nel 1995², aiutando la comunità a delineare il ruolo di GPVI da quello di altre proteine piastriniche leganti il collagene^sin da ^3,4. Questo agonista può essere procurato da una varietà di fonti commerciali o prodotto internamente. Il monomero peptidico può essere acquistato da un fornitore e poi reticolato internamente oppure può essere fatto dal fornitore a un costo aggiuntivo. Un ulteriore risparmio sui costi può essere ottenuto riducendo la purezza richiesta al momento della consegna (70% contro 95%, ad esempio). Inoltre, non c'è consenso su come il CRP-XL dovrebbe essere conservato, con alcuni che optano per la crioconservazione e altri per la refrigerazione, alcuni mantengono il materiale liofilizzato fino all'uso e altri lo conservano in soluzione (acqua o tampone, a seconda delle preferenze). Pertanto, la qualità e la composizione delle scorte di laboratorio non sono standardizzate o armonizzate. Poiché questo agonista viene utilizzato a una concentrazione definita (massa/volume) piuttosto che a unità di attività, la potenza di CRP-XL in un laboratorio, ad esempio a 1 μg/mL, non sarà la stessa di un altro. Vale la pena notare che altri agonisti piastrinici utilizzati nel campo sono già standardizzati (ad esempio, la trombina, che viene fornita e utilizzata in unità di attività piuttosto che in massa/volume), quindi il passaggio da massa/volume a unità di biologico non dovrebbe essere troppo impegnativo per la comunità. Va inoltre notato che le risposte dei pazienti agli agonisti piastrinici, inclusa la CRP-XL, sono variabili in termini di sensibilità agli agonisti e di capacità di risposta (entità della risposta)⁵, quindi è ancora più importante utilizzare quantità costanti di attività agonista nei test.

Se gli agonisti piastrinici possono essere armonizzati utilizzandoli in un'attività definita piuttosto che in peso/volume, si può garantire che un esperimento in un laboratorio sia direttamente paragonabile a quello in altri laboratori e possa essere riprodotto accuratamente con sicurezza. Fino a quando il settore non raggiungerà un accordo su come immagazzinare e standardizzare l'attività di CRP-XL, è essenziale eseguire controlli regolari sul materiale per garantirne la coerenza nel corso dei mesi/anni in cui viene utilizzato.

L'assegnazione del valore di attività per gli standard biologici deve essere effettuata attraverso studi collaborativi multicentrici (ad esempio ^6,7) e richiede competenze specialistiche. La necessità di stabilire standard biologici per gli agonisti piastrinici è stata recentemente evidenziata da uno studio multicentrico collaborativo⁸ sostenuto dalla Società Internazionale per la Trombosi e l'Emostasi (ISTH); fino a quando non sarà disponibile uno standard internazionale CRP-XL, i ricercatori possono standardizzare il proprio materiale a livello locale per garantire la coerenza nel tempo e che il nuovo materiale proveniente commercialmente o internamente sia di attività paragonabile alle preparazioni precedenti, così come a quelle del resto della comunità.

Protocol

Il sangue deve essere raccolto da volontari sani consenzienti e trattato in conformità con le norme locali. Questo protocollo misura l'aggregazione piastrinica indotta da agonisti nel plasma ricco di piastrine (PRP) mediante aggregometria a trasmissione luminosa (LTA). L'ISTH fornisce protocolli standardizzati, tra cui un metodo del 2013 per la preparazione del PRP e LTA⁹.  Raccogliere il sangue intero in citrato di sodio al 4% secondo le raccomandazioni ISTH in conformità con le regole del comitato etico locale. Escludere i donatori che hanno assunto FANS nelle ultime 2 settimane.

1. Procedura di analisi

1. Prelevare un'aliquota di CRP-XL di riserva e diluirla nel tampone del saggio (Tyrodes¹⁰) (Tabella 1) fino a una concentrazione iniziale che provochi la massima aggregazione (vedere la NOTA al punto 1.3).
   NOTA: In letteratura, una concentrazione di 1 μg/mL induce la massima aggregazione, ma alcuni laboratori hanno bisogno di concentrazioni più elevate per ottenere lo stesso effetto: regolare di conseguenza la serie di diluizione
2. Effettuare una serie di diluizioni corrispondente con lo standard (vedere la NOTA sotto il punto 1.3 e la Figura 1) in modo che le concentrazioni siano le stesse del reagente in esame.
3. Produrre una serie di diluizioni da 6 a 8 punti per il test e lo standard, sempre nel tampone del saggio, che porta la risposta di aggregazione dal 100% allo 0% di aggregazione. Un esempio che mostra una curva di concentrazione della serie di diluizione a 8 punti è mostrato nella Tabella 2.
   NOTA: Alcuni laboratori aggiungono un agonista a un volume totale del 10%, ad esempio 50 μL di agonista a 450 μL di piastrine, in modo tale da diluire una concentrazione 10x a una concentrazione finale di 1x nel saggio, mentre altri aggiungono volumi più piccoli (più concentrati) di agonista, ad esempio 5 μL di agonista a 495 μL di piastrine - assicurarsi solo che la serie di diluizione sia appropriata per il test tenendo presente come lo spostamento di volume influisce sulla concentrazione piastrinica - ancora una volta, sii coerente. Nell'esempio, 30 μL di agonista 10x vengono aggiunti a 270 μL di plasma ricco di piastrine (PRP).
4. Una volta che le piastrine sono riposate e pronte per l'uso, aliquotarle in cuvette LTA, aggiungere una barra di agitazione e lasciare che raggiungano i 37 °C nei pozzetti di contenimento.
5. Una volta raggiunta la temperatura, posizionare le cuvette nell'aggregometro e iniziare a registrare le tracce. Aggiungere l'agonista (con agitazione) e registrare i dati.
6. Ripetere il passaggio 1.4 per ciascuna concentrazione della prova e dello standard fino a quando non sono stati raccolti i dati necessari per tracciare le curve (curve di esempio mostrate nella Figura 2).
7. Calcolare la potenza del reagente in esame rispetto a quella dello standard; Anche in questo caso, utilizzare qualsiasi metrica (aggregazione massima o area sotto la curva), purché vi sia coerenza e il modello di analisi si adatti in modo appropriato ai dati.

2. Controllo delle curve di concentrazione

1. Innanzitutto, verificare che le curve concentrazione-risposta siano parallele. Esistono molti pacchetti software che lo fanno, ma qui il processo è descritto per Graphpad Prism (vedere la Figura 3).
   1. Immettere i dati in modo che log(concentrazione) si trovi sull'asse X e la risposta (% aggregazione massima/AUC) sia sull'asse Y (Figura 3A)
   2. Trasformare le concentrazioni di CRP-XL (Figura 3B)
   3. Selezionare Regressione non lineare dalle funzioni di analisi e utilizzare l'equazione per la stimolazione/inibizione dose-risposta.
   4. Selezionare log (agonista) rispetto alla risposta (pendenza variabile) - utilizzare l'adattamento a 3 o 4 vie a seconda di quale sia il migliore per i dati.
   5. Determinare se le curve sono parallele utilizzando la scheda Confronta (come mostrato nella Figura 3C) e fare clic sul pulsante per confrontare i set di dati per assicurarsi che la pendenza (pendenza Hill) e gli asintoti (la parte superiore e inferiore delle curve) siano equivalenti. In questo esempio, la pendenza di Hill per il test è 2,279 e quella dello standard è 2,025 con un rapporto di 1,125.
   6. Se i pendii sono paralleli (ad esempio, un criterio di accettazione del rapporto di pendenza compreso tra 0,8 e 1,25) e gli asintoti sono equivalenti, procedere con il calcolo della potenza (EC₅₀) utilizzando i passaggi 2.1.3 e 2.1.4. Nell'esempio mostrato qui, gli asintoti sono stati vincolati poiché la valutazione nel passaggio 2.1.5 ha confermato che gli asintoti sono equivalenti.
   7. Dividere il valore EC₅₀ dello standard per quello del test per determinare la potenza relativa. Nell'esempio mostrato qui, test/standard (0,07259/0,1498) = 0,4846, cioè il 'test' è potente la metà dello standard.
   8. Regolare le concentrazioni di massa/volume per tenere conto della differenza di potenza, ad esempio, se lo standard è stato utilizzato in precedenza a 1 μg/mL, il nuovo materiale verrebbe utilizzato a 1/0,4846 = 2,063 μg/mL) per garantire che negli esperimenti vengano utilizzate quantità comparabili di materiale attivo

Discussion

Come mostrato qui, il processo di standardizzazione dei materiali è molto semplice. Sebbene richieda un po' di tempo per valutare nuovi lotti di materiale e/o per verificare che il lotto corrente sia stabile e non perda attività nel tempo, la ricompensa è che gli esperimenti sono riproducibili più e più volte e confrontabili nel corso degli anni piuttosto che solo la durata di un lotto di reagenti. Significa anche che altri ricercatori possono ricreare accuratamente le condizioni del saggio e che la comunità è armonizzata a livello globale. Le fasi critiche del protocollo includono la raccolta del sangue intero e la preparazione del PRP⁹, nonché la precisione durante la realizzazione della serie di diluizione. È inoltre importante assicurarsi che le curve di prova e standard siano parallele prima di procedere con il confronto EC₅₀ . Se le linee non sono parallele o gli asintoti non sono equivalenti, potrebbe indicare che il materiale di prova e quello standard sono diversi in una certa misura.

Chiunque lavori nelle scienze biologiche sa che i saggi biologici non sempre funzionano in modo coerente, quindi è necessario essere consapevoli di questo quando si valutano i dati. Nell'esempio mostrato qui, anche se stiamo usando gli stessi donatori per misurare la potenza di due materiali molto simili, se non identici, i pendii e gli asintoti della collina non sono identici. Tuttavia, accettiamo un certo grado di variabilità e concludiamo che le curve sono, in questo caso, parallele, e quindi adatte per confrontare e regolare la potenza. Le molecole biologiche sono grandi e complesse e le modifiche post-traduzionali durante la produzione possono influenzare la loro potenza nei saggi biologici. La standardizzazione delle biomolecole e dei saggi biologici non può essere effettuata utilizzando solo la massa o il volume e deve essere effettuata quantificando e confrontando l'attività biologica in un test biologico¹¹. È necessario utilizzare la propria formazione ed esperienza per valutare i dati nel contesto del saggio.

I limiti della tecnica sono che, sebbene i dati possano indicare un problema con i reagenti, non possono indicare quale sia il problema. Saranno necessari ulteriori studi per determinare il motivo per cui i materiali non sono comparabili. In un mondo ideale, qualsiasi materiale critico per gli esperimenti e le successive conclusioni scientifiche verrebbe verificato mediante spettroscopia di massa, ma questa non è sempre un'opzione. Tuttavia, se i dati non sono comparabili, sono comunque necessarie ulteriori indagini. Un altro limite di questo approccio è il tempo e le risorse necessarie per farlo. Idealmente, il test e lo standard dovrebbero essere confrontati in 3-6 donatori per fornire una certa sicurezza nell'assegnazione dell'attività biologica al materiale, ma riteniamo che ciò sia giustificato dal supporto della riproducibilità e dell'affidabilità. La standardizzazione del materiale biologico non è necessaria ogni volta che vengono eseguiti esperimenti, ma come minimo, dovrebbe essere fatta per ogni nuovo lotto di agonisti, preferibilmente più frequentemente, a seconda della stabilità e dell'uso. In effetti, se uno standard dovesse essere reso disponibile, questo è qualcosa su cui le organizzazioni internazionali di standardizzazione possono fare chiarezza.

Mentre l'esempio mostrato qui è per CRP-XL nel contesto della misurazione dell'aggregazione piastrinica, il protocollo di confronto dell'attività biologica delle biomolecole nei saggi biologici è ampiamente applicabile in tutto il settore.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
4% sodium citrate	Sigma-Aldrich	S1804	Anticoagulant dissolved in water9
4-(2- hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES)	Sigma-Aldrich	54457
CRP-XL	Peptide Protein Research Ltd.		A crosslinked, triple-helical peptide2,4 with the sequence GCP*(GPP*)GCP*G (single letter amino acid code: P* = hydroxyproline was obtained as a custom order from Peptide Protein Research Ltd.
Cuvettes and stir bars	Stago	86921	Consumables for aggregometer
Glucose	Sigma-Aldrich	G7021
KCl	Sigma-Aldrich	P5405
MgCl2	Sigma-Aldrich	M4880
Na2HPO4	Sigma-Aldrich	S5136
NaCl	Sigma-Aldrich	Sigma-Aldrich
NaHCO3	Sigma-Aldrich	S6014
Prism	Graphpad		Analysis software package
Platelet rich plasma			Isolated from whole blood from healthy volunteers free of non-steroidal anti-inflammatory drugs for a minimum of 10 days8.