Sequenzierung des gesamten Genoms zur schnellen Charakterisierung des Tollwutvirus mittels Nanoporentechnologie

Genomische Daten können verwendet werden, um die Übertragung und geografische Ausbreitung von Infektionskrankheiten zu verfolgen. Die für die genomische Überwachung erforderliche Sequenzierungskapazität ist jedoch in vielen Ländern mit niedrigem und mittlerem Einkommen (LMICs) nach wie vor begrenzt, da die durch Hunde vermittelte Tollwut und/oder die durch Wildtiere wie Vampirfledermäuse übertragene Tollwut große Bedenken für die öffentliche Gesundheit und die Wirtschaft aufwirft. Wir präsentieren hier einen schnellen und kostengünstigen Workflow von der Probe über die Sequenz bis zur Interpretation unter Verwendung der Nanoporentechnologie. Die Protokolle für die Probenentnahme und die Diagnose von Tollwut werden kurz beschrieben, gefolgt von Details des optimierten Arbeitsablaufs bei der Sequenzierung des gesamten Genoms, einschließlich des Primerdesigns und der Optimierung für die Multiplex-Polymerase-Kettenreaktion (PCR), der Vorbereitung einer modifizierten, kostengünstigen Sequenzierungsbibliothek, der Sequenzierung mit Live- und Offline-Basenaufruf, der Bestimmung genetischer Abstammungslinien und der phylogenetischen Analyse. Die Implementierung des Workflows wird demonstriert und kritische Schritte für den lokalen Einsatz werden hervorgehoben, wie z. B. die Pipeline-Validierung, die Primer-Optimierung, die Einbeziehung von Negativkontrollen und die Verwendung öffentlich zugänglicher Daten und genomischer Tools (GLUE, MADDOG) zur Klassifizierung und Platzierung innerhalb regionaler und globaler Phylogenien. Die Bearbeitungszeit für den Workflow beträgt 2-3 Tage, und die Kosten reichen von 25 USD pro Probe für einen 96-Probenlauf bis zu 80 USD pro Probe für einen 12-Sample-Lauf. Wir kommen zu dem Schluss, dass die Einrichtung einer genomischen Überwachung von Tollwutviren in LMICs machbar ist und Fortschritte in Richtung des globalen Ziels von null durch Hunde verursachten Tollwuttodesfällen beim Menschen bis 2030 sowie eine verbesserte Überwachung der Ausbreitung von Wildtier-Tollwut unterstützen kann. Darüber hinaus kann die Plattform für andere Krankheitserreger angepasst werden, was zum Aufbau einer vielseitigen genomischen Kapazität beiträgt, die zur Vorbereitung auf Epidemien und Pandemien beiträgt.