Aqui, apresentamos um fluxo de trabalho rápido e econômico para caracterizar genomas do vírus da raiva (RABV) usando a tecnologia de nanoporos. O fluxo de trabalho destina-se a apoiar a vigilância genômica informada em nível local, fornecendo informações sobre linhagens RABV circulantes e sua colocação dentro de filogenias regionais para orientar medidas de controle da raiva.
Os dados genômicos podem ser usados para rastrear a transmissão e a disseminação geográfica de doenças infecciosas. No entanto, a capacidade de sequenciamento necessária para a vigilância genômica permanece limitada em muitos países de baixa e média renda (PBMRs), onde a raiva mediada por cães e/ou a raiva transmitida por animais selvagens, como morcegos hematófagos, representam grandes preocupações econômicas e de saúde pública. Apresentamos aqui um fluxo de trabalho rápido e acessível de amostra para sequência para interpretação usando a tecnologia de nanoporos. Os protocolos para coleta de amostras e diagnóstico de raiva são brevemente descritos, seguidos por detalhes do fluxo de trabalho otimizado de sequenciamento do genoma inteiro, incluindo o projeto e a otimização de primers para reação em cadeia da polimerase (PCR) multiplex, preparação de uma biblioteca de sequenciamento modificada e de baixo custo, sequenciamento com chamada de base ao vivo e off-line, designação de linhagem genética e análise filogenética. A implementação do fluxo de trabalho é demonstrada, e etapas críticas são destacadas para a implantação local, como validação de pipeline, otimização de primer, inclusão de controles negativos e o uso de dados publicamente disponíveis e ferramentas genômicas (GLUE, MADDOG) para classificação e colocação dentro de filogenias regionais e globais. O tempo de resposta para o fluxo de trabalho é de 2 a 3 dias, e o custo varia de US$ 25 por amostra para uma execução de 96 amostras a US$ 80 por amostra para uma execução de 12 amostras. Concluímos que a criação de vigilância genômica do vírus da raiva em PBMRs é viável e pode apoiar o progresso em direção à meta global de zero mortes por raiva humana mediadas por cães até 2030, bem como um monitoramento aprimorado da disseminação da raiva na vida selvagem. Além disso, a plataforma pode ser adaptada para outros patógenos, ajudando a construir uma capacidade genômica versátil que contribui para a preparação para epidemias e pandemias.
O vírus da raiva (RABV) é um lissavírus da família Rhabdoviridae que causa uma doença neurológica fatal em mamíferos1. Embora a raiva seja 100% evitável pela vacinação, continua sendo um grande problema de saúde pública e econômico em países endêmicos. Das 60.000 mortes por raiva humana estimadas para ocorrer a cada ano, mais de 95% estão na África e na Ásia, onde os cães são o principal reservatório2. Em contraste, a vacinação de cães levou à eliminação da raiva mediada por cães em toda a Europa Ocidental, América do Norte e grande parte da América Latina. Nessas regiões, os reservatórios de raiva estão agora restritos à fauna silvestre, como morcegos, guaxinins, gambás e canídeos selvagens3. Em toda a América Latina, o morcego hematófago comum é uma fonte problemática de raiva devido à transmissão regular de morcegos para humanos e animais durante a alimentação sanguínea noturna4. O impacto econômico global anual da raiva é estimado em US$ 8,6 bilhões, sendo as perdas de gado responsáveis por 6%5.
Dados de sequência de patógenos virais combinados com metadados sobre o momento e a fonte das infecções podem fornecer insights epidemiológicos robustos6. Para o RABV, o sequenciamento tem sido utilizado para investigar a origem dos surtos7,8, identificar associações do hospedeiro com animais selvagens ou cães domésticos 8,9,10,11,12 e rastrear fontes de casos humanos 13,14. Investigações de surtos usando análise filogenética indicaram que a raiva surgiu na província anteriormente livre de raiva de Bali, na Indonésia, através de uma única introdução nas áreas endêmicas próximas de Kalimantan ou Sulawesi15. Enquanto isso, nas Filipinas, um surto na ilha de Tablas, província de Romblon, foi comprovadamente introduzido a partir da ilha principal de Luzon16. Dados genômicos virais também têm sido usados para entender melhor a dinâmica de transmissão de patógenos necessária para direcionar geograficamente as medidas de controle. Por exemplo, a caracterização genômica do RABV ilustra o agrupamento geográfico dos clados 17,18,19, a cocirculação de linhagens 20,21,22, o movimento viral mediado por humanos 17,23,24 e a dinâmica metapopulacional 25,26.
O monitoramento da doença é uma função importante da vigilância genômica que foi aprimorada com o aumento global da capacidade de sequenciamento em resposta à pandemia de SARS-CoV-2. A vigilância genômica apoiou o rastreamento em tempo real das variantes de preocupação do SARS-COV-227,28 e contramedidas associadas6. Os avanços na tecnologia de sequenciamento acessível, como a tecnologia de nanoporos, levaram a protocolos aprimorados e mais acessíveis para o sequenciamento rápido de patógenos humanos 29,30,31,32 e animais33,34,35. No entanto, em muitos países endêmicos de raiva, ainda há barreiras para operacionalizar a vigilância genômica de patógenos, como mostrado pelas disparidades globais na capacidade de sequenciamento de SARS-CoV-236. Limitações na infraestrutura laboratorial, cadeias de suprimentos e conhecimento técnico tornam o estabelecimento e a rotinização da vigilância genômica desafiadores. Neste artigo, demonstramos como um fluxo de trabalho otimizado, rápido e acessível de sequenciamento de genoma inteiro pode ser implantado para vigilância RABV em configurações com recursos limitados.
O estudo foi aprovado pelo Comitê Coordenador de Pesquisa Médica do National Institute for Medical Research (NIMR/HQ/R.8a/vol. IX/2788), o Ministério da Administração Regional e Governo Local (AB.81/288/01) e o Conselho de Revisão Institucional do Instituto de Saúde Ifakara (IHI/IRB/No:22-2014) na Tanzânia; o Instituto de Doenças Tropicais e Infecciosas da Universidade de Nairóbi (P947/11/2019) e o Instituto de Pesquisa Médica do Quênia (KEMRI-SERU; protocolo nº 3268) no Quênia; e o Instituto de Pesquisa em Medicina Tropical (RITM), Departamento de Saúde (2019-023) nas Filipinas. O sequenciamento de amostras originárias da Nigéria foi realizado em material diagnóstico arquivado coletado como parte da vigilância nacional.
NOTA: Seção 1-4 são pré-requisitos. As seções 5-16 descrevem o fluxo de trabalho amostra-seqüência-para-interpretação para o sequenciamento de nanoporos RABV (Figura 1). Para etapas subsequentes do protocolo que necessitem de centrifugação por pulso, centrifugar a 10-15.000 x g por 5-15 s.
1. Configuração de ambiente computacional para sequenciamento e análise de dados
2. Projetar ou atualizar o esquema de primer multiplex
NOTA: Os esquemas RABV existentes estão disponíveis no repositório artic-rabv40. Ao visar uma nova área geográfica, deve ser concebido um novo regime ou modificado um regime existente para incorporar uma diversidade adicional.
3. Configurar pipelines de bioinformática RAMPART e ARTIC
4. Biossegurança e configuração laboratorial
5. Coleta e diagnóstico da amostra de campo
OBS: As amostras devem ser coletadas por pessoal treinado e imunizado, utilizando equipamentos de proteção individual e seguindo os procedimentos padrão referenciados47,48,49.
6. Preparação da amostra e extração de RNA (3 h)
NOTA: Use um kit de extração de RNA viral baseado em coluna de spin adequado para o tipo de amostra.
7. Preparação de cDNA (20 min)
8. Preparação do estoque da piscina da cartilha (1 h)
NOTA: Esta etapa só é necessária se forem feitas novas existências a partir de primers individuais, após as quais podem ser utilizadas soluções de existências pré-preparadas.
9. PCR multiplex (5 h)
10. Limpeza e quantificação por PCR (3,5 h)
11. Normalização (30 min)
12. Preparação final e código de barras (1,5 h)
NOTA: As próximas etapas pressupõem o uso de reagentes específicos de kits de sequenciamento de ligadura e código de barras específicos de nanoporos (consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes). O protocolo é transferível entre diferentes versões químicas, mas os usuários devem ter o cuidado de usar kits compatíveis, de acordo com as instruções do fabricante.
13. Sequenciamento (máximo de 48 h)
14. Basecalling ao vivo e off-line
Observação : essas instruções pressupõem que a estrutura de diretório pré-existente fornecida no repositório artic-rabv e que as seções de pré-requisitos 1 e 3 do protocolo foram seguidas.
15. Lavagem das células de fluxo
16. Análise e interpretação
O fluxo de trabalho amostra-seqüência-interpretação para RABV descrito neste protocolo tem sido utilizado com sucesso em diferentes condições laboratoriais em países endêmicos, como Tanzânia, Quênia, Nigéria e Filipinas (Figura 4). O protocolo foi utilizado em diferentes tipos e condições de amostra (Tabela 6): tecido cerebral fresco e congelado, extratos de cDNA e RNA do tecido cerebral transportados sob cadeia de frio por longos períodos e cartões de FTA com esfregaços de tecido cerebral.
Basecalling ao vivo usando RAMPART (Figura 5) mostra a geração quase em tempo real de leituras e a porcentagem de cobertura por amostra. Isso é particularmente útil para decidir quando parar a execução e salvar a célula de fluxo para reutilização. Observou-se variação no tempo de execução, com alguns terminados em 2 h, enquanto outros poderiam levar mais de 12 h para atingir uma profundidade adequada de cobertura (x100). Também podemos ver regiões com pouca amplificação; por exemplo, a Figura 6 mostra um instantâneo de uma execução de sequenciamento onde os perfis de cobertura mostram alguns amplicons com amplificação muito baixa, indicando primers potencialmente problemáticos. Ao investigar mais detalhadamente essas regiões pouco amplificadoras, conseguimos identificar incompatibilidades de primers, o que nos permitirá redesenhar e melhorar os primers individuais. Alguns esquemas de primers mostraram mais incompatibilidades do que outros. Isso é observado no esquema de cartilhas da África Oriental, em comparação com as Filipinas, de acordo com a diversidade direcionada, já que o esquema da África Oriental visa capturar uma diversidade muito mais ampla.
RABV-GLUE42, um recurso de uso geral para o gerenciamento de dados do genoma de RABV, e MADDOG60, um sistema de classificação e nomenclatura de linhagens, foram usados para compilar e interpretar as sequências RABV resultantes. A Tabela 7 mostra os clados maiores e menores que circulam em cada país atribuído usando RABV-GLUE. Também é mostrada uma classificação de maior resolução de linhagens locais após a atribuição MADDOG.
Figura 1: Fluxo de trabalho de amostra para sequência para interpretação para RABV. São apresentadas etapas resumidas para (A) preparação da amostra, (B) PCR e preparação da biblioteca, e (C) sequenciamento e bioinformática até a análise e interpretação. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Esquema de primers esquemático. Posições de recozimento ao longo do "genoma de referência índice" (roxo escuro) para pares de primers para frente e para trás (meias setas), que são atribuídos em dois pools separados: A (vermelho) e B (verde). Os pares de primers geram amplicons sobrepostos de 400 pb (azul) que são numerados sequencialmente ao longo do genoma de referência do índice no formato 'scheme_name_X_DIRECTION', onde 'X' é um número referente ao amplicon gerado pelo primer e 'DIRECTION' é 'LEFT' ou 'RIGHT', descrevendo o forward ou reverse respectivamente. Valores ímpares ou pares de 'X' determinam o pool (A ou B, respectivamente). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Célula de fluxo de nanoporos48. As etiquetas azuis ilustram as diferentes partes da célula de fluxo, incluindo a tampa da porta de escorvamento que cobre a porta de escorvamento onde a solução de escorvamento é adicionada, a tampa da porta de amostra SpotON que cobre a porta de amostra onde a amostra é adicionada de forma gota a gota, as portas de resíduos 1 e 2 e o ID da célula de fluxo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Mapa mostrando o local onde o sequenciamento do RABV foi realizado usando o fluxo de trabalho otimizado em 2021 e 2022. O tamanho e a cor da bolha correspondem ao número de sequências por local, onde menor e mais escuro é menor, enquanto maior e mais claro é mais. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Captura de tela da visualização RAMPART no navegador da Web. Os nomes de código de barras são substituídos por nomes de amostra de acordo com a configuração de bioinformática. Os três painéis superiores mostram gráficos de resumo para toda a execução: profundidade de cobertura de leituras mapeadas para cada código de barras por posição de nucleotídeo no genoma de referência do índice (canto superior esquerdo, colorido por código de barras), leituras mapeadas somadas de todos os códigos de barras ao longo do tempo (meio superior) e leituras mapeadas por código de barras (canto superior direito, colorido por código de barras). Os painéis inferiores mostram linhas de gráficos por código de barras. Da esquerda para a direita: a profundidade de cobertura das leituras mapeadas por posição de nucleotídeos no genoma de referência índice (esquerda), distribuição de comprimento das leituras mapeadas (meio) e proporção de posições de nucleotídeos no genoma de referência índice que obtiveram uma cobertura de 10x, 100x e 1.000x de leituras mapeadas ao longo do tempo (direita). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: Um exemplo de cobertura de leitura em todo o genoma de uma amostra do vírus da raiva das Filipinas sequenciada usando o protocolo. A cobertura de leitura em cada posição do nucleotídeo no genoma é mostrada, juntamente com a posição dos amplicons sobrepostos (1-41) usados para gerar a biblioteca. Picos na profundidade de cobertura correspondem a áreas de sobreposição de amplicon. Amplicons com baixa profundidade de cobertura correspondem a áreas de sobreposição de amplicon. Amplicons com baixa profundidade de cobertura são destacados em vermelho indicando regiões problemáticas que podem exigir otimização. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Tabela 1: Condições da mistura principal e do termociclador para a preparação de cDNA. Clique aqui para baixar esta tabela.
Tabela 2: Condições da mistura mestre e do termociclador para PCR multiplex. Clique aqui para baixar esta tabela.
Tabela 3: Condições da mistura principal e do termociclador para a reação de preparação final. Clique aqui para baixar esta tabela.
Tabela 4: Condições da mistura mestre e do termociclador para código de barras. Clique aqui para baixar esta tabela.
Tabela 5: Mistura mestre de ligadura do adaptador e diluição da biblioteca final para sequenciamento. Clique aqui para baixar esta tabela.
Tabela 6: O número de sequências do genoma completo do vírus da raiva geradas e o tipo de amostras usadas em diferentes países usando o fluxo de trabalho amostra-a-seqüência-para-interpretação. Clique aqui para baixar esta tabela.
Tabela 7: Atribuições de clados maiores e menores do RABV-GLUE e atribuições de linhagem do MADDOG para sequências geradas usando o fluxo de trabalho. Clique aqui para baixar esta tabela.
Arquivo Suplementar 1: Projeto e otimização do esquema de primers e análise de profundidade de leitura amplicon. Clique aqui para baixar este arquivo.
Arquivo Suplementar 2: Configuração computacional Clique aqui para baixar este arquivo.
Arquivo suplementar 3: Planilha de protocolo RABV WGS Clique aqui para baixar este arquivo.
Um fluxo de trabalho acessível de sequenciamento do genoma completo baseado em nanoporos foi desenvolvido por Brunker et al.61, utilizando recursos da rede ARTIC46. Aqui, apresentamos um fluxo de trabalho atualizado, com etapas completas de amostra para sequência para interpretação. O fluxo de trabalho detalha a preparação de amostras de tecido cerebral para sequenciamento do genoma inteiro, apresenta um pipeline de bioinformática para processar leituras e gerar sequências de consenso e destaca duas ferramentas específicas da raiva para automatizar a atribuição de linhagens e determinar o contexto filogenético. O fluxo de trabalho atualizado também fornece instruções abrangentes para a configuração de espaços de trabalho computacionais e laboratoriais apropriados, com considerações para implementação em diferentes contextos (incluindo configurações com poucos recursos). Demonstramos a implementação bem-sucedida do fluxo de trabalho em ambientes acadêmicos e de institutos de pesquisa em quatro PBMRs endêmicos de RABV com nenhuma ou limitada capacidade de vigilância genômica. O fluxo de trabalho provou ser resiliente à aplicação em diversas configurações e compreensível por usuários com experiência variada.
Esse fluxo de trabalho para sequenciamento RABV é o protocolo mais abrangente disponível publicamente (cobrindo etapas de amostra para sequência para interpretação) e especificamente adaptado para reduzir os custos de inicialização e execução. O tempo e o custo necessários para a preparação e sequenciamento de bibliotecas com tecnologia de nanoporos são muito reduzidos em relação a outras plataformas, como o Illumina61, e os desenvolvimentos contínuos da tecnologia estão melhorando a qualidade e a precisão da sequência para serem comparáveis ao Illumina62.
Este protocolo foi projetado para ser resiliente em diversos contextos de poucos recursos. Ao consultar as diretrizes de solução de problemas e modificações fornecidas junto com o protocolo principal, os usuários têm suporte para adaptar o fluxo de trabalho às suas necessidades. A adição de ferramentas de bioinformática amigáveis ao fluxo de trabalho constitui um grande desenvolvimento em relação ao protocolo original, fornecendo métodos rápidos e padronizados que podem ser aplicados por usuários com experiência prévia mínima em bioinformática para interpretar dados de sequência em contextos locais. A capacidade de o fazer in situ é muitas vezes limitada pela necessidade de dispor de competências específicas de programação e filogenéticas, que exigem um investimento intensivo e a longo prazo na formação de competências. Embora esse conjunto de habilidades seja importante para interpretar completamente os dados de sequência, ferramentas de interpretação básicas e acessíveis são igualmente desejáveis para capacitar os "campeões de sequenciamento" locais, cuja experiência principal pode ser baseada em laboratório úmido, permitindo-lhes interpretar e se apropriar de seus dados.
Como o protocolo vem sendo realizado há vários anos em vários países, agora podemos fornecer orientações sobre como otimizar esquemas de primer multiplex para melhorar a cobertura e lidar com a diversidade acumulada. Esforços também têm sido feitos para ajudar os usuários a melhorar a relação custo-efetividade ou para permitir a facilidade de aquisição em uma determinada região, o que é tipicamente um desafio para a sustentabilidade das abordagens moleculares63. Por exemplo, na África (Tanzânia, Quênia e Nigéria), optamos pela mistura mestre de ligase romba/TA na etapa de ligadura do adaptador, que estava mais prontamente disponível em fornecedores locais e uma alternativa mais barata a outros reagentes de ligadura.
A partir da experiência, existem várias maneiras de reduzir o custo por amostra e por execução. Reduzir o número de amostras por corrida (por exemplo, de 24 para 12 amostras) pode estender a vida útil das células de fluxo ao longo de várias corridas, enquanto aumentar o número de amostras por execução maximiza o tempo e os reagentes. Em nossas mãos, conseguimos lavar e reutilizar células de fluxo para uma em cada três sequências, permitindo que mais 55 amostras fossem sequenciadas. Lavar a célula de fluxo imediatamente após o uso, ou se não for possível, remover o fluido residual do canal de resíduos após cada corrida, pareceu preservar o número de poros disponíveis para uma segunda corrida. Levando em consideração o número inicial de poros disponíveis em uma célula de fluxo, uma execução também pode ser otimizada para planejar quantas amostras serão executadas em uma célula de fluxo específica.
Embora o fluxo de trabalho tenha como objetivo ser o mais abrangente possível, com a adição de orientações detalhadas e recursos sinalizados, o procedimento ainda é complexo e pode ser assustador para um novo usuário. O usuário é incentivado a buscar treinamento e suporte presencial, idealmente localmente, ou alternativamente por meio de colaboradores externos. Nas Filipinas, por exemplo, um projeto sobre a capacitação dentro de laboratórios regionais para a vigilância genômica do SARS-CoV-2 usando ONT desenvolveu competências essenciais entre os diagnosticadores de cuidados de saúde que são prontamente transferíveis para o sequenciamento de RABV. Etapas importantes, como a limpeza de contas SPRI, podem ser difíceis de dominar sem treinamento prático, e uma limpeza ineficaz pode danificar a célula de fluxo e comprometer a corrida. A contaminação de amostras é sempre uma grande preocupação quando os amplicons estão sendo processados em laboratório e podem ser difíceis de eliminar. Em particular, a contaminação cruzada entre amostras é extremamente difícil de detectar durante a bioinformática pós-execução. Boas técnicas e práticas de laboratório, como manter superfícies de trabalho limpas, separar áreas pré e pós-PCR e incorporar controles negativos, são imperativas para garantir o controle de qualidade. O ritmo acelerado dos desenvolvimentos de sequenciamento de nanoporos é uma vantagem e uma desvantagem para a vigilância genômica de rotina do RABV. Melhorias contínuas na precisão, acessibilidade e repertório de protocolos dos nanoporos ampliam e melhoram o escopo de sua aplicação. No entanto, os mesmos desenvolvimentos tornam desafiador manter procedimentos operacionais padrão e pipelines de bioinformática. Neste protocolo, fornecemos um documento auxiliando a transição de kits de preparação de bibliotecas de nanoporos mais antigos para os atuais (Tabela de Materiais).
Um obstáculo comum ao sequenciamento em LMICs é a acessibilidade, incluindo não apenas o custo, mas também a capacidade de adquirir consumíveis em tempo hábil (em particular reagentes de sequenciamento, que são relativamente novos para equipes de compras e fornecedores) e recursos computacionais, além de simplesmente ter acesso a energia estável e à internet. Usar a tecnologia de sequenciamento de nanoporos portáteis como base desse fluxo de trabalho ajuda com muitos desses problemas de acessibilidade, e demonstramos o uso de nosso protocolo em uma variedade de configurações, conduzindo o protocolo completo e a análise no país. É certo que a aquisição de equipamento e a sequenciação de consumíveis em tempo útil continua a ser um desafio e, em muitos casos, fomos forçados a transportar ou enviar reagentes do Reino Unido. No entanto, em algumas áreas, pudemos confiar inteiramente em rotas de fornecimento locais para reagentes, beneficiando-nos do investimento no sequenciamento do SARS-CoV-2 (por exemplo, nas Filipinas), que simplificou os processos de aquisição e começou a normalizar a aplicação da genômica do patógeno.
A necessidade de uma conexão de internet estável é minimizada por instalações únicas; por exemplo, repositórios do GitHub, download de software e sequenciamento de nanoporos em si só exigem acesso à internet para iniciar a execução (não por completo) ou podem ser realizados completamente offline com o acordo da empresa. Se os dados móveis estiverem disponíveis, um telefone pode ser usado como um ponto de acesso para o laptop para iniciar a execução de sequenciamento, antes de se desconectar durante a execução. Ao processar amostras rotineiramente, os requisitos de armazenamento de dados podem crescer rapidamente e, idealmente, os dados seriam armazenados em um servidor. Caso contrário, os discos rígidos de unidade de estado sólido (SSD) são relativamente baratos de obter.
Embora reconheçamos que ainda existem barreiras à vigilância genômica em PBMRs, o aumento do investimento na construção de acessibilidade e conhecimento genômico (por exemplo, Africa Pathogen Genomics Initiative [Africa IGP])64 sugere que essa situação irá melhorar. A vigilância genômica é crítica para a preparação para pandemias6, e a capacidade pode ser estabelecida por meio do roteamento da vigilância genômica de patógenos endêmicos, como o RABV. As disparidades globais nas capacidades de sequenciamento destacadas durante a pandemia SARS-CoV-2 devem ser um motor de mudança catalítica para abordar essas desigualdades estruturais.
Este fluxo de trabalho amostra-a-seqüência-para-interpretação para RABV, incluindo ferramentas de bioinformática acessíveis, tem o potencial de ser usado para orientar medidas de controle visando a meta de zero mortes humanas por raiva mediada por cães até 2030 e, finalmente, para a eliminação de variantes RABV. Combinados com metadados relevantes, os dados genômicos gerados a partir desse protocolo facilitam a rápida caracterização do RABV durante investigações de surtos e na identificação de linhagens circulantes em um país ou região60,61,65. Ilustramos nosso pipeline usando principalmente exemplos de raiva mediada por cães; no entanto, o fluxo de trabalho é diretamente aplicável à raiva da vida selvagem. Essa transferibilidade e o baixo custo minimizam os desafios em tornar o sequenciamento de rotina facilmente disponível, não só para a raiva, mas também para outros patógenos46,66,67, para melhorar o manejo e o controle da doença.
Este trabalho foi apoiado por Wellcome [207569/Z/17/Z, 224670/Z/21/Z], financiamento Newton do Conselho de Pesquisa Médica [MR/R025649/1] e do Departamento de Ciência e Tecnologia das Filipinas (DOST), o esforço global de pesquisa e inovação do Reino Unido sobre COVID-19 [MR/V035444/1], o Fundo de Apoio Estratégico Institucional da Universidade de Glasgow [204820], Prêmio de Novo Pesquisador do Conselho de Pesquisa Médica (KB) [MR/X002047/1], e Fundo de Desenvolvimento de Parceria Internacional, um DOST British Council-Philippines studentship (CB), um National Institute for Health Research [17/63/82] GemVi scholarship (GJ), e bolsas de estudo da Universidade de Glasgow do MVLS DTP (KC) [125638-06], do EPSRC DTP (RD) [EP/T517896/1] e do Wellcome IIB DTP (HF) [218518/Z/19/Z]. Somos gratos aos colegas e colaboradores que apoiaram este trabalho: Daniel Streicker, Alice Broos, Elizabeth Miranda, DVM, Daria Manalo, DVM, Thumbi Mwangi, Kennedy Lushasi, Charles Kayuki, Jude Karlo Bolivar, Jeromir Bondoc, Esteven Balbin, Ronnel Tongohan, Agatha Ukande, Davis Kuchaka, Mumbua Mutunga, Lwitiko Sikana e Anna Czupryna.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Brand name | |||
Software | |||
Sequencing software (MinKnow) | Oxford Nanopore Technologies | https://community.nanoporetech.com/downloads | |
Bioinformatics tool kit (Guppy) | Oxford Nanopore Technologies | https://community.nanoporetech.com/docs/prepare/library_prep_protocols/Guppy-protocol/v/gpb_2003_v1_revao_14dec2018 | |
Equipment | |||
Thermal cycler (miniPCR™ mini16 thermal cycler) | Cambio | MP-QP-1016-01 | |
Homogenizer (Precellys Evolution Touch Homogenizer) | Bertin Instruments | EQ02520-300 | |
Cold Racks (0.2-0.5mL) (PCR Mini-cooler with transparent lid) | BRAND | 781260 | |
Pipettor | |||
(Pipetman L Fixed F1000L, 1000 uL) | Gilson | SKU: FA10030 | |
(Pipetman L Fixed F100L, 100 uL) | Gilson | SKU: FA10024 | |
(Pipetman L Fixed F10L, 10 uL) | Gilson | SKU: FA10020 | |
(Pipetman L Fixed F1L, 1 uL) | Gilson | SKU: FA10025 | |
(Pipetman L Fixed F20L, 20 uL) | Gilson | SKU: FA10021 | |
(Pipetman L Fixed F250L, 250 uL) | Gilson | SKU: FA10026 | |
Fluorometer (Qubit 4 Fluorometer) | Thermofisher scientific/Fisher scientific | Q33238 | |
Laptop (Any brand with ~2 GB of drive space, minimum of 512 GB storage space, msi installer [GPU]) | |||
Microcentrifuge (Refrigerated centrifuge) | Thermofisher scientific/Fisher scientific | 75004081 | |
Vortex mixer (Basic vortex mixer) | Thermofisher scientific/Fisher scientific | 88882011 | |
Magnetic rack (DynaMag -2 Magnet) | Thermofisher scientific/Fisher scientific | 12321D | |
Sequencing device (MinION) | Oxford Nanopore Technologies | MinION Mk1B | |
RNA Extraction | |||
RNA extraction kit (Qiagen RNEasy Mini Kit 250) | Qiagen | 74106 | |
RNA stabilizing reagents | |||
(RNA later) | Invitrogen | AM7020 | |
(DNA/RNA Shield) | Zymo Research | R1100-50 | |
PCR | |||
Nuclease-free Water (Nuclease-free Water [not DEPC-treated]) | Thermofisher scientific/Fisher scientific | AM9937 | |
Master mix for first strand cDNA synthesis (LunaScript RT SuperMix Kit) | New England Biolabs | E3010S | |
DNA amplification master mix (Q5® Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix [NEB]) | New England Biolabs | M0494L | |
Primer (Scheme) (Custom DNA oligos) | Invitrogen | ||
SPRI Bead Clean-up | |||
SPRI beads (Aline Biosciences PCR Clean DX ) | Cambio | AL-AC1003-50 | |
Ethanol, Pure Absolute, >99.8% (GC) [Riedel-De Haen] | Merck | 818760 | |
Short Fragment buffer (SFB expansion pack) | Oxford Nanopore Technologies | EXP-SFB001 | |
DNA Quantification | |||
DNA quantification kit (Qubit® dsDNA HS Assay Kit) | Thermofisher scientific/Fisher scientific | Q32854 | |
DNA quantification assay tubes (Qubit™ Assay Tubes) | Thermofisher scientific/Fisher scientific | Q32856 | |
End Prep and barcoding (Qubit™ Assay Tubes) | |||
End Prep master mix (NEBNext Ultra End Repair/dA-Tailing Module) | New England Biolabs | E7546L | |
Barcoding kit | |||
*Chemistry 9 | Oxford Nanopore Technologies | *Chemistry 9 | |
(Native Barcoding Expansion 1-12) | EXP-NBD104 | ||
(Native Barcoding Expansion 13-24) | EXP-NBD114 | ||
(Native Barcoding Expansion 96) | EXP-NBD196 | ||
*Chemistry 14 | Oxford Nanopore Technologies | *Chemistry 14 | |
(not compatible) | (not compatible) | ||
(Native Barcoding Kit 24 V14) | SQK-NBD114.24 | ||
(Native Barcoding Kit 96 V14) | SQK-NBD114.96 | ||
Ligation mastermix (Blunt/TA Ligase Master Mix) | New England Biolabs | M0367S | |
Adapter Ligation | |||
Adapter ligation master mix | |||
(NEBNext Quick Ligation Module) | New England Biolabs | E6056S | |
(NEBNext Ultra II Ligation Module) | New England Biolabs | E7595S | |
(Blunt/TA Ligase Master Mix) | New England Biolabs | M0367S | |
Adapter mix | |||
*Chemistry 9 | Oxford Nanopore Technologies | *Chemistry 9 EXP-AMII001 | |
(Adapter Mix II [AMII]) | |||
*Chemistry 14 | Oxford Nanopore Technologies | *Chemistry 14 EXP-NBA114 | |
(Native adapter [NA]) | |||
Sequencing | |||
Flowcell priming kit | |||
*Chemistry 9 | Oxford Nanopore Technologies | *Chemistry 9 EXP-FLP002 | |
(Flush Buffer [FB]) | |||
(Flush Tether [FT]) | |||
*Chemistry 14 | Oxford Nanopore Technologies | *Chemistry 14 EXP-FLP004 | |
(Flow Cell Flush [FCF]) | |||
(Flow Cell Tether [FCT]) | |||
Ligation Sequencing Kit | |||
*Chemistry 9 | Oxford Nanopore Technologies | *Chemistry 9 SQK-LSK109 | |
Adapter Mix (Adapter Mix [AMX]) | |||
Ligation Buffer (Ligation buffer [LNB]) | |||
Short Fragment Buffer (Short Fragment buffer [SFB]) | |||
Sequencing Buffer (Sequencing Buffer [SQB]) | |||
Elution Buffer (Elution buffer [EB]) | |||
Loading Beads (Loading Beads [LB]) | |||
Sequencing Tether (Sequencing Tether [SQT]) | |||
*Chemistry 14 | Oxford Nanopore Technologies | *Chemistry 14 SQK-LSK114 | |
Adapter Mix (Ligation Adapter [LA]) | |||
Ligation Buffer (Ligation buffer [LNB]) | |||
Short Fragment Buffer (Short Fragment buffer [SFB]) | |||
Sequencing Buffer (Sequencing Buffer [SB]) | |||
Elution Buffer (Elution buffer [EB]) | |||
Loading Beads (Loading Beads [LIB]) | |||
Sequencing Tether (Flow Cell Tether [FCT]) | |||
Library solution (Library solution [LIS]) | |||
Flush buffer (Flow Cell Flush [FCF]) | |||
Flow Cell | |||
*Chemistry 9 | Oxford Nanopore Technologies | *Chemistry 9 FLO-MIN106D | |
(Flow Cell [R9.4.1]) | |||
*Chemistry 14 | Oxford Nanopore Technologies | *Chemistry 14 FLO-MIN114 | |
(Flow Cell [R10.4.1]) | |||
Flow Cell wash | |||
Flowcell wash kit (Flow cell wash kit) | Oxford Nanopore Technologies | EXP-WSH004 | |
Consummables | |||
Surface decontaminant | |||
(DNA Away Surface Decontaminant, Squeeze Bottle [Molecular Bio]) | Thermofisher scientific/Fisher scientific | 7010PK | |
(RNase Away Surface Decontaminant, Bottle [Molecular Bio]) | Thermofisher scientific/Fisher scientific | 7002PK | |
PCR 8-Tube Strip 0.2ml, individual cap (PCR 8-Tube Strip 0.2ml, with Individual attached Flat Caps, Sterile, DNAse/RNAse, Pyrogen Free,Natural [Greiner]) | Greiner | 608281 | |
PCR Tube 0.2ml (PCR Tube 0.2ml, Natural [Domed Cap] Bagged in 500s, Non-Sterile [Greiner]) | Greiner | 671201 | |
1000µL Filter Tips (500) (Stacked 1000µL Filter Tips [500]) | Thermofisher scientific/Fisher scientific | 11977724 | |
100µL Filter Tips (1000) | Thermofisher scientific/Fisher scientific | 11947724 | |
10µL Filter Tips (1000) (Stacked 100µL Filter Tips [1000]) | Thermofisher scientific/Fisher scientific | 11907724 | |
Reinforced tubes tubes (2ml) with screw caps and o-rings (Fisherbrand™ Bulk tubes) | Thermofisher scientific/Fisher scientific | 15545809 | |
Microcentrifuge tube (1.5ml) (1.5 ml Eppendorf Tubes [500]) | Eppendorf | 1229888 | |
DNA LoBind Tubes (1.5ml) (DNA LoBind Tubes) | Thermofisher scientific/Fisher scientific | 10051232 | |
Cryobabies labels | |||
Gloves (S/M/L) | |||
Paper towel |
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