Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

כאן, אנו מציגים פרוטוקול חלופי לגרימת אנצפלומיאליטיס אוטואימונית ניסיונית בעכברי C57BL/6, תוך שימוש בגליקופרוטאין מיאלין אוליגודנדרוציטים (MOG)35-55 אפיטופ אימונוגני המושהה באדג'ובנט של פרוינד המכיל את תת-המין Mycobacterium avium paratuberculosis שהומת בחום.

Abstract

אנצפלומיאליטיס אוטואימונית ניסיונית (EAE) הנגרמת על ידי גליקופרוטאין אוליגודנדרוציטים מיאלין (MOG) דורשת חיסון על ידי פפטיד MOG המתחלב באדג'ובנט מלא של פרוינד (CFA) המכיל Mycobacterium tuberculosis בלתי פעיל. המרכיבים האנטיגניים של המיקובקטריום מפעילים תאים דנדריטיים כדי לעורר תאי T לייצר ציטוקינים המקדמים את תגובת Th1 באמצעות קולטנים דמויי אגרה. לכן, כמות ומינים של מיקובקטריה נוכחים במהלך האתגר האנטיגני קשורים ישירות להתפתחות EAE. מאמר שיטות זה מציג פרוטוקול חלופי להשראת EAE בעכברי C57BL/6 באמצעות אדג'ובנט לא שלם של פרוינד המכיל את תת-המין Mycobacterium avium paratuberculosis זן K-10 שהומת בחום.

M. paratuberculosis, חבר בקומפלקס Mycobacterium avium, הוא הגורם הסיבתי למחלת ג'ון במעלי גירה וזוהה כגורם סיכון למספר הפרעות בתיווך תאי T אנושיים, כולל טרשת נפוצה. באופן כללי, עכברים שחוסנו בחיידק Mycobacterium paratuberculosis הראו התפרצות מוקדמת יותר וחומרת מחלה גבוהה יותר מאשר עכברים שחוסנו ב-CFA המכיל את הזן של M. tuberculosis H37Ra באותם מינונים של 4 מ"ג/מ"ל. הדטרמיננטים האנטיגניים של תת-המין Mycobacterium avium paratuberculosis (MAP) זן K-10 הצליחו לגרום לתגובה תאית חזקה של Th1 במהלך שלב האפקטורים, המאופיינת במספר גבוה משמעותית של לימפוציטים מסוג T (CD4+ CD27+), תאים דנדריטיים (CD11c+ I-A/I-E+) ומונוציטים (CD11b+ CD115+) בטחול בהשוואה לעכברים שחוסנו ב-CFA. יתר על כן, נראה כי תגובת תאי T למפפטיד MOG הייתה הגבוהה ביותר בעכברים שחוסנו נגד M. paratuberculosis. השימוש באנצפליטוגן (למשל, MOG35-55) המתחלב באדג'ובנט המכיל M. paratuberculosis בניסוח עשוי להיות שיטה חלופית ומתוקפת להפעלת תאים דנדריטיים לפרימינג של תאי T ספציפיים לאפיטופ מיאלין CD4+ במהלך שלב האינדוקציה של EAE.

Introduction

אנצפלומיאליטיס אוטואימונית ניסיונית (EAE) היא מודל נפוץ לחקר הפרעות דה-מיאלינציה בבני אדם1. ישנם מספר מודלים של EAE: חיסון פעיל באמצעות פפטידים שונים של מיאלין בשילוב עם אדג'ובנטים חזקים, חיסון פסיבי על ידי העברה חוץ גופית של לימפוציטים ספציפיים CD4+ למיאלין, ומודלים טרנסגניים של EAE2 ספונטני. לכל אחד מהמודלים הללו יש תכונות ספציפיות המאפשרות ללמוד היבטים שונים של EAE, כגון שלב ההתפרצות, שלב האפקט או השלב הכרוני. מודל הגליקופרוטאין אוליגודנדרוציטים של המיאלין (MOG) של EAE הוא מודל טוב לחקר המנגנונים בתיווך מערכת החיסון של דלקת עצבית כרונית ודמיאלינציה, שכן הוא מאופיין בחדירה דלקתית חד-גרעינית, דמיאלינ....

Protocol

כל הניסויים בעכברים אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של בית הספר לרפואה של אוניברסיטת חונטנדו (אישור מספר 290238) ונערכו בהתאם להנחיות המכונים הלאומיים לבריאות לניסויים בבעלי חיים.

1. הערות כלליות על הניסוי

  1. אחסן את העכברים בכלובים נפרדים במת?.......

Representative Results

קבוצות של עכברי C57BL/6 (סה"כ n = 15/קבוצה) חוסנו ב-MOG35-55 בתחליב המכיל M. paratuberculosis או בשיטה הנפוצה עם CFA. כל קבוצות העכברים הפגינו מחלה מונופאזית חריפה המאופיינת בשיא נכות יחיד שנצפה לאחר 14-17 ימים, ואחריו החלמה חלקית של הסימפטומים במהלך 10 הימים הבאים (איור 1A

Discussion

הדגמנו פרוטוקול חלופי חזק לגרימת EAE חמור באופן פעיל בעכברי C57BL/6J באמצעות הפפטיד MOG35-55 המתחלב באדג'ובנט המכיל M. paratuberculosis10. השראת EAE בשיטה זו הביאה למחלה חמורה יותר מזו שנגרמה על ידי הפרוטוקול המשותף עם CFA. הבדל זה יכול לנבוע מהמרכיבים השומניים השונים בדופן התא של המיקו?.......

Acknowledgements

עבודה זו קיבלה תמיכה ממענק מהאגודה היפנית לקידום המדע (מענק מס. JP 23K14675).

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
anti-mouse CD115 antibodyBiolegend, USA135505for cytofluorimetry 1:1,000
anti-mouse CD11b antibodyBiolegend, USA101215for cytofluorimetry 1:1,000
anti-mouse CD11c antibodyBiolegend, USA117313for cytofluorimetry 1:1,000
anti-mouse CD16/32  antibodyBiolegend, USA101302for cytofluorimetry 1:1,000
anti-mouse CD4  antibodyBiolegend, USA116004for cytofluorimetry 1:1,000
anti-mouse CD8a  antibodyBiolegend, USA100753for cytofluorimetry 1:1,000
anti-mouse I-A/I-E antibodyBiolegend, USA107635for cytofluorimetry 1:1,000
anti-mouse Ly-6C  antibodyBiolegend, USA128023for cytofluorimetry 1:1,000
BBL Middlebrook OADC EnrichmentThermo Fisher Scientific, USABD 211886for isolation and cultivation of mycobacteria
C57BL/6J miceCharles River Laboratory, Japan3 weeks old, male and female
FBS 10279-106Gibco Life Techologies, USA42F9155Kfor cell culture, warm at 37 °C before use
Freeze Dryer machineEyela, Tokyo, JapanFDU-1200for bacteria lyophilization
incomplete e Freund’s adjuvantDifco Laboratories, MD, USA263810for use in adjuvant
Middlebrook 7H9 BrothDifco Laboratories, MD, USA90003-876help in the growth of Mycobacteria
Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis K-10ATCC, USABAA-968bacteria from bovine origin
Mycobacterium tuberculosis H37 Ra, DesiccatedBD Biosciences, USA743-26880-EAfor use in adjuvant
Mycobactin JAllied Laboratory, MO, USAgrowth promoter
Myelin Oligodendrocyte Glycolipid (MOG) 35-55AnaSpec, USAAS-60130-10encephalotigenic peptide
Ovalbumin (257-264)Sigma-Aldrich, USAS7951-1MGnegative control antigen  for proliferative assay
pertussis toxin solutionFujifilm Wako, Osaka Japan168-22471From gram-negative bacteria Bordetella pertussi, increases blood-brain barrier permeability
Polytron homogenizer PT 3100Kinematicafor mixing the antigen with the adjuvant
RPMI 1640 with L-glutamineGibco Life Techologies, USA11875093For cell culture
Thymidine, [Methyl-3H], in 2% ethanol, 1 mCiPerkinElmer, Waltham, MA, USANET027W001MCfor proliferation assay, use (1 μCi/well)
Zombie NIR Fixable Viability KitBiolegend, USA423105 cytofluorimetry, for cell viability

References

  1. Bittner, S., Afzali, A. M., Wiendl, H., Meuth, S. G. Myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG35-55) induced experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in C57BL/6 mice. Journal of Visualized Experiments. (86), e51275 (2014).
  2. Constantinescu, C. S., Farooqi, N., O'Brien, K., Gran, B.

Explore More Articles

JoVE195adjuvantMycobacterium avium subsp paratuberculosisC57BL 6J

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved