Attività adiuvante del Mycobacterium paratuberculosis nel migliorare l'immunogenicità degli autoantigeni durante l'encefalomielite autoimmune sperimentale

Riepilogo

Qui, presentiamo un protocollo alternativo per indurre attivamente l'encefalomielite autoimmune sperimentale in topi C57BL / 6, utilizzando l'epitopo immunogenico mielinico oligodendrocitario glicoproteina (MOG) _35-55 sospeso in adiuvante di Freund incompleto contenente la sottospecie di Mycobacterium avium uccisa dal calore paratuberculosis.

Abstract

L'encefalomielite autoimmune sperimentale (EAE) indotta dalla glicoproteina oligodendrocitaria mielinica (MOG) richiede l'immunizzazione con un peptide MOG emulsionato in adiuvante completo di Freund (CFA) contenente Mycobacterium tuberculosis inattivato. I componenti antigenici del micobatterio attivano le cellule dendritiche per stimolare le cellule T a produrre citochine che promuovono la risposta Th1 attraverso i recettori toll-like. Pertanto, la quantità e la specie di micobatteri presenti durante la sfida antigenica sono direttamente correlate allo sviluppo di EAE. Questo documento sui metodi presenta un protocollo alternativo per indurre EAE in topi C57BL / 6 utilizzando un adiuvante di Freund incompleto modificato contenente il ceppo K-10 della sottospecie di Mycobacterium avium paratuberculosis ucciso dal calore.

M. paratuberculosis, un membro del complesso Mycobacterium avium, è l'agente eziologico della malattia di Johne nei ruminanti ed è stato identificato come un fattore di rischio per diverse malattie umane mediate da cellule T, tra cui la sclerosi multipla. Nel complesso, i topi immunizzati con Mycobacterium paratuberculosis hanno mostrato un esordio precoce e una maggiore gravità della malattia rispetto ai topi immunizzati con CFA contenenti il ceppo di M. tuberculosis H37Ra alle stesse dosi di 4 mg/ml. I determinanti antigenici del ceppo K-10 della sottospecie di Mycobacterium avium paratuberculosis (MAP) sono stati in grado di indurre una forte risposta cellulare Th1 durante la fase effettrice, caratterizzata da un numero significativamente più elevato di linfociti T (CD4+ CD27+), cellule dendritiche (CD11c+ I-A/I-E+) e monociti (CD11b+ CD115⁺) nella milza rispetto ai topi immunizzati con CFA. Inoltre, la risposta proliferativa delle cellule T al peptide MOG sembrava essere più alta nei topi immunizzati con M. paratubercolosi. L'uso di un encefalogeno (ad esempio, MOG_35-55) emulsionato in un adiuvante contenente M. paratuberculosis nella formulazione può essere un metodo alternativo e convalidato per attivare le cellule dendritiche per l'innesco delle cellule T CD4⁺ specifiche dell'epitopo mielinico durante la fase di induzione dell'EAE.

Introduzione

L'encefalomielite autoimmune sperimentale (EAE) è un modello comune per lo studio dei disturbi demielinizzanti umani¹. Esistono diversi modelli di EAE: immunizzazione attiva utilizzando diversi peptidi di mielina in combinazione con potenti adiuvanti, immunizzazione passiva mediante trasferimento in vitro di linfociti CD4⁺ specifici della mielina e modelli transgenici di^{EAE 2} spontanei. Ognuno di questi modelli ha caratteristiche specifiche che consentono di studiare diversi aspetti dell'EAE, come l'insorgenza, la fase effettrice o la fase cronica. Il modello di glicoproteina oligodendrocitaria mielinica (MOG) di EAE è un buon modello per studiare i meccanismi immuno-mediati della neuroinfiammazione cronica e della demielinizzazione, poiché è caratterizzato da infiltrazione infiammatoria mononucleare, demielinizzazione nella sostanza bianca periferica e ridotto recupero dopo^{il picco 1} della malattia.

MOG-EAE è indotta dall'immunizzazione di topi sensibili con il peptide MOG_35-55 in adiuvante completo di Freund (CFA), seguito da un'iniezione intraperitoneale di tossina della pertosse. Ciò aumenta la permeabilità della barriera emato-encefalica e consente alle cellule T mielina-specifiche attivate nella periferia di raggiungere il sistema nervoso centrale (SNC), dove saranno riattivate³. Il CFA svolge un ruolo chiave nell'induzione dell'EAE migliorando l'assorbimento dell'antigene da parte delle cellule presentanti l'antigene e l'espressione di citochine correlate alle risposte umorali e cellulo-mediate⁴. Questo meccanismo è dovuto principalmente alla presenza di Mycobacterium tuberculosis ucciso emulsionato nell'olio, i cui componenti forniscono un forte stimolo per il sistema immunitario⁵. Infatti, l'induzione di EAE è direttamente correlata alla quantità di micobatterio presente durante la sfida antigenica⁶.

L'aggiunta di altri micobatteri uccisi, come il Mycobacterium butyricum, all'adiuvante⁷ incompleto di Freund, così come l'effetto delle combinazioni adiuvanti⁸, possono modulare il decorso clinico dell'EAE e di conseguenza influenzare la riproducibilità dei risultati. Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis (MAP), l'agente eziologico della malattia di Johne nei ruminanti, è stato associato a disturbi infiammatori del SNC umano 9, poiché i suoi componenti antigenici sono in grado di suscitare una forte risposta umorale e cellulo-mediata in pazienti con sclerosi multipla e neuromielite ottica dello spettro⁹. Pertanto, in questo protocollo, mostriamo un metodo alternativo e riproducibile per indurre MOG-EAE sostituendo M. tuberculosis in CFA con M. paratuberculosis.

Protocollo

Tutti gli esperimenti sui topi sono stati approvati dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali della Juntendo University School of Medicine (numero di approvazione 290238) e sono stati condotti in conformità con le linee guida del National Institutes of Health per la sperimentazione animale.

1. Osservazioni generali sull'esperimento

1. Ospitare i topi in gabbie individuali nella struttura per animali in condizioni controllate e prive di agenti patogeni a 23 °C ± 2 °C con 50% ± 10% di umidità e un ciclo luce/buio di 12 ore con accesso ad libitum a cibo e acqua.
2. Iniettare i topi con soluzione salina tamponata fosfato (PBS) senza antigene e CFA e usarli rispettivamente come controlli negativi e positivi.

2. Preparazione di antigeni micobatterici

1. Coltivare il ceppo M. paratuberculosis K-10 in mezzo liquido Middlebrook 7H9 arricchito con il 10% di OADC (acido oleico, albumina, destrosio, catalasi), 0,005% Tween 80 e 2 mg/L di micobactina J per 2 settimane in matraccio di coltura tissutale T25 a 37 °C. Valutare regolarmente la crescita della colonia mediante ispezione visiva.
   ATTENZIONE: Maneggiare M. paratuberculosis in una struttura di livello di biosicurezza 2 (BSL-2).
2. Coltivare il matraccio Erlenmeyer da 500 mL di arricchimento con una sospensione di 1,7 × 10⁵ unità formanti colonie (CFU)/ml in un volume finale di 200 mL (stesso mezzo del punto 2.1) in un incubatore agitatore per 1 settimana.
   NOTA: Poiché gli organismi contaminanti possono influenzare i risultati, i batteri devono essere inoculati su terreni solidi Middlebrook 7H10 per determinare la morfologia della colonia e per verificare la purezza mediante kit convenzionali di rilevamento della reazione a catena della polimerasi (PCR) per M. paratuberculosis.
3. Inattivare le sospensioni batteriche per 5-10 minuti a 70 °C e centrifugare a 3.000 × g per 10 minuti. Lavare il pellet pesato in PBS due volte, interrompere con la sonicazione e conservare a -20 °C.
4. Trasferire il pellet in un contenitore sterile e congelarlo con ghiaccio secco o azoto liquido. Trasferire immediatamente in una camera di liofilizzazione.
5. Liofilizzazione (4 h a -50 °C sotto vuoto) M. paratubercolosi secondo il manuale della macchina.
6. Al termine della liofilizzazione, rimuovere il contenitore in acciaio inossidabile dal liofilizzatore e trasferirlo in un banco di biopulizia. Utilizzare una spatola in acciaio inossidabile per rimuovere i grumi MAP essiccati che aderiscono alla parete interna del contenitore in acciaio inossidabile e polverizzarli il più finemente possibile.
7. Pesare le cellule polverizzate utilizzando una bilancia elettronica e metterle manualmente in un flaconcino asettico da 10 mL ad una concentrazione di 10 mg/ml.
   NOTA: La densità cellulare è stata quantificata in grammi di peso secco per litro di campione. Dopo 3 settimane, 1 mg (peso umido) di pellet cellulare batterico contiene circa 2,5 × 10⁸ CFU.

3. Preparazione dell'emulsione MOG _35-55

1. Macinare il contenuto di un flaconcino di M. paratuberculosis essiccato (10 mg) in polvere fine con mortaio e pestello e aggiungere 10 mL all'adiuvante incompleto di Freund per ottenere una soluzione madre da 10 mg/ml. Conservare a -4 °C.
2. Prima dell'immunizzazione, diluire la soluzione madre fino a una concentrazione finale di 4 mg/ml.
3. Diluire il peptide MOG_35-55 in ddH 2 O ad una concentrazione finale di₂mg/ml e conservare a -20 °C.
4. Utilizzando un omogeneizzatore, mescolare la soluzione MOG_35-55 (2 mg/ml) con un volume uguale di adiuvante (4 mg/ml) dal punto 3.2 in un tubo da 5 mL fino a formare un'emulsione densa. Dopo ogni 10 secondi di miscelazione, posizionare la soluzione su ghiaccio per 20 s e ruotare il tubo per recuperare tutta la soluzione.
5. Trasferire l'emulsione in una siringa da 1 ml, rimuovere tutta l'aria e aggiungere un ago da 27 G. L'emulsione è ora pronta per l'iniezione.
   NOTA. Poiché durante la preparazione si verifica una certa perdita dell'emulsione viscosa di MOG_35-55 , è meglio preparare 1,5 volte la quantità necessaria.

4. Immunizzazione animale

1. Anestetizzare gli animali con inalazione di isoflurano per ridurre al minimo lo stress sugli animali.
2. Iniettare l'emulsione (200 μL contenenti 200 μg/topo di MOG_35-55) per via sottocutanea nella parte bassa della schiena.
3. Somministrare una dose di tossina della pertosse (100 μL contenenti 200 ng/topo) per via intraperitoneale nei giorni 0 e 2 dopo l'immunizzazione.
   ATTENZIONE: La tossina della pertosse ha un effetto soppressivo multiplo sul sistema immunitario; Evitare l'ingestione e il contatto con gli occhi e la pelle.

5. Valutazione clinica

1. Monitorare i topi quotidianamente per il peso e i segni clinici. Utilizzare il seguente sistema di punteggio: 0 = nessun segno clinico; 1 = coda flaccida; 2 = compromissione del riflesso raddrizzante e debolezza degli arti posteriori; 3 = paralisi completa degli arti posteriori; 4 = paralisi completa degli arti posteriori con paralisi parziale degli arti anteriori; 5 = moribondo.
   NOTA: Dopo l'osservazione iniziale dei segni clinici, agli animali viene fornito un maggiore accesso all'acqua e al cibo. Il chow del roditore viene ammorbidito e inumidito, quindi posto sul pavimento della gabbia dalla tramoggia del cibo. Nel caso di animali disidratati, viene somministrata un'integrazione di liquido sottocutaneo o viene somministrato un impasto di roditore tramite sonda orale. Se un topo ha bisogno di questo tipo di assistenza per più di 3 giorni, verrà condotta l'eutanasia.
2. Per evitare o ridurre al minimo il dolore e l'angoscia degli animali, utilizzare i seguenti endpoint umani: perdita di peso corporeo superiore al 20%, punteggio clinico ≥4,0, assenza del riflesso raddrizzante al punteggio 3 e quando l'animale non è in grado di accedere al mangime o all'acqua per 24 ore.
   NOTA: I topi sono stati sottoposti a eutanasia il giorno 30 dopo l'induzione di EAE mediante iniezioni intraperitoneali di pentobarbital (≥150 mg / kg).

Risultati

Gruppi di topi C57BL/6 (totale n = 15/gruppo) sono stati immunizzati con MOG_35-55 in un'emulsione contenente M. paratubercolosi o con il metodo comune con CFA. Tutti i gruppi di topi hanno manifestato una malattia monofasica acuta caratterizzata da un singolo picco di disabilità osservato a 14-17 giorni, seguito da un parziale recupero dei sintomi nei successivi 10 giorni (Figura 1A). I topi immunizzati con l'adiuvante contenente M. p...

Discussione

Abbiamo dimostrato un robusto protocollo alternativo per indurre attivamente EAE grave in topi C57BL / 6J utilizzando il peptide MOG_35-55 emulsionato in un adiuvante contenente M. paratuberculosis¹⁰. L'induzione di EAE con questo metodo ha provocato una malattia più grave di quella indotta dal protocollo comune con CFA. Questa differenza potrebbe essere dovuta alle diverse componenti lipidiche nella parete cellulare dei micobatteri¹¹. Infatti, a differe...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
anti-mouse CD115 antibody	Biolegend, USA	135505	for cytofluorimetry 1:1,000
anti-mouse CD11b antibody	Biolegend, USA	101215	for cytofluorimetry 1:1,000
anti-mouse CD11c antibody	Biolegend, USA	117313	for cytofluorimetry 1:1,000
anti-mouse CD16/32  antibody	Biolegend, USA	101302	for cytofluorimetry 1:1,000
anti-mouse CD4  antibody	Biolegend, USA	116004	for cytofluorimetry 1:1,000
anti-mouse CD8a  antibody	Biolegend, USA	100753	for cytofluorimetry 1:1,000
anti-mouse I-A/I-E antibody	Biolegend, USA	107635	for cytofluorimetry 1:1,000
anti-mouse Ly-6C  antibody	Biolegend, USA	128023	for cytofluorimetry 1:1,000
BBL Middlebrook OADC Enrichment	Thermo Fisher Scientific, USA	BD 211886	for isolation and cultivation of mycobacteria
C57BL/6J mice	Charles River Laboratory, Japan		3 weeks old, male and female
FBS 10279-106	Gibco Life Techologies, USA	42F9155K	for cell culture, warm at 37 °C before use
Freeze Dryer machine	Eyela, Tokyo, Japan	FDU-1200	for bacteria lyophilization
incomplete e Freund’s adjuvant	Difco Laboratories, MD, USA	263810	for use in adjuvant
Middlebrook 7H9 Broth	Difco Laboratories, MD, USA	90003-876	help in the growth of Mycobacteria
Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis K-10	ATCC, USA	BAA-968	bacteria from bovine origin
Mycobacterium tuberculosis H37 Ra, Desiccated	BD Biosciences, USA	743-26880-EA	for use in adjuvant
Mycobactin J	Allied Laboratory, MO, USA		growth promoter
Myelin Oligodendrocyte Glycolipid (MOG) 35-55	AnaSpec, USA	AS-60130-10	encephalotigenic peptide
Ovalbumin (257-264)	Sigma-Aldrich, USA	S7951-1MG	negative control antigen  for proliferative assay
pertussis toxin solution	Fujifilm Wako, Osaka Japan	168-22471	From gram-negative bacteria Bordetella pertussi, increases blood-brain barrier permeability
Polytron homogenizer PT 3100	Kinematica		for mixing the antigen with the adjuvant
RPMI 1640 with L-glutamine	Gibco Life Techologies, USA	11875093	For cell culture
Thymidine, [Methyl-3H], in 2% ethanol, 1 mCi	PerkinElmer, Waltham, MA, USA	NET027W001MC	for proliferation assay, use (1 μCi/well)
Zombie NIR Fixable Viability Kit	Biolegend, USA	423105	cytofluorimetry, for cell viability