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Questo lavoro presenta un modello animale di fibrosi indotta da transizione endoteliale a mesenchimale, come si vede nei difetti cardiaci congeniti come la stenosi aortica critica o la sindrome del cuore sinistro ipoplasico, che consente una valutazione istologica dettagliata del tessuto, l'identificazione delle vie di segnalazione regolatorie e la verifica delle opzioni di trattamento.
La fibroelastosi endocardica (EFE), definita dall'accumulo di tessuto subendocardico, ha un impatto importante sullo sviluppo del ventricolo sinistro (LV) e preclude ai pazienti con stenosi aortica critica congenita e sindrome del cuore sinistro ipoplasico (HLHS) la riparazione chirurgica biventricolare anatomica curativa. La resezione chirurgica è attualmente l'unica opzione terapeutica disponibile, ma l'EFE spesso si ripresenta, a volte con un pattern di crescita ancora più infiltrativo nel miocardio adiacente.
Per comprendere meglio i meccanismi alla base dell'EFE e per esplorare le strategie terapeutiche, è stato sviluppato un modello animale adatto alla sperimentazione preclinica. Il modello animale prende in considerazione che l'EFE è una malattia del cuore immaturo ed è associata a disturbi del flusso, come supportato dalle osservazioni cliniche. Pertanto, il trapianto di cuore eterotopico di cuori di donatori di ratti neonatali è la base di questo modello.
Il cuore di un ratto neonatale viene trapiantato nell'addome di un ratto adolescente e collegato all'aorta infrarenale e alla vena cava inferiore del ricevente. Mentre la perfusione delle arterie coronarie preserva la vitalità del cuore del donatore, il ristagno del flusso all'interno del ventricolo sinistro induce la crescita dell'EFE nel cuore molto immaturo. Il meccanismo alla base della formazione di EFE è la transizione delle cellule endoteliali endocardiche in cellule mesenchimali (EndMT), che è un meccanismo ben descritto dello sviluppo embrionale precoce delle valvole e dei setti, ma anche la principale causa di fibrosi nell'insufficienza cardiaca. La formazione di EFE può essere osservata macroscopicamente entro pochi giorni dal trapianto. L'ecocardiografia transaddominale viene utilizzata per monitorare la vitalità dell'innesto, la contrattilità e la pervietà delle anastomosi. Dopo l'eutanasia, il tessuto EFE viene raccolto e mostra le stesse caratteristiche istopatologiche del tessuto EFE umano di pazienti affetti da HLHS.
Questo modello in vivo consente di studiare i meccanismi di sviluppo dell'EFE nel cuore e di testare le opzioni di trattamento per prevenire la formazione di questo tessuto patologico e offre l'opportunità di un esame più generalizzato della fibrosi indotta da EndMT.
La fibroelastosi endocardica (EFE), definita dall'accumulo di collagene e fibre elastiche nel tessuto subendocardico, si presenta come un endocardio ispessito perlaceo o opaco; L'EFE subisce una crescita più attiva durante il periodo fetale e la prima infanzia1. In uno studio autoptico, il 70% dei casi con sindrome del cuore sinistro ipoplasico (HLHS) è stato associato alla presenza di EFE2.
Le cellule che esprimono marcatori per i fibroblasti sono la principale popolazione cellulare in EFE, ma queste cellule esprimono contemporaneamente anche marcatori endoteliali endocardici, che è un'indicazione dell'origine di queste cellule EFE. Il nostro gruppo ha precedentemente stabilito che il meccanismo alla base della formazione di EFE coinvolge un cambiamento fenotipico delle cellule endoteliali endocardiche in fibroblasti attraverso la transizione endoteliale a mesenchimale (EndMT)3. L'EndMT può essere rilevata utilizzando la doppia colorazione immunoistochimica per marcatori endoteliali come il cluster di differenziazione (CD) 31 o l'endotelio vascolare (VE)-caderina (CD144) e marcatori di fibroblasti (ad esempio, actina alfa-muscolare liscia, α-SMA). Inoltre, abbiamo anche precedentemente stabilito il ruolo regolatore della via TGF-ß in questo processo con l'attivazione dei fattori di trascrizione SLUG, SNAIL, e TWIST3.
L'EndMT è un processo fisiologico che si verifica durante lo sviluppo cardiaco embrionale e porta alla formazione dei setti e delle valvole dai cuscinetti endocardici4, ma provoca anche fibrosi d'organo nell'insufficienza cardiaca, nella fibrosi renale o nel cancro e svolge un ruolo chiave nell'aterosclerosi vascolare 5,6,7,8. L'EndMT nella fibrosi cardiaca è regolata principalmente attraverso la via TGF-β, come abbiamo riportato 3,9. Sono stati descritti vari stimoli per indurre l'EndMT: infiammazione10, ipossia11, alterazioni meccaniche12 e disturbi del flusso, comprese le alterazioni del flusso sanguigno intracavitario13, e l'EndMT può anche essere una conseguenza di una malattia genetica14.
Questo modello animale è stato sviluppato utilizzando i componenti chiave dello sviluppo dell'EFE cardiaca, che sono l'immaturità e le alterazioni del flusso sanguigno intracavitario, in particolare il ristagno del flusso. L'immaturità è stata soddisfatta utilizzando cuori di ratto neonatale come donatori, poiché i ratti neonatali sono noti per essere immaturi dal punto di vista dello sviluppo subito dopo la nascita. Il trapianto di cuore eterotopico ha offerto la possibilità di limitare il flusso intracavitario15.
Da un punto di vista clinico, questo modello animale consente di studiare meglio l'impatto di EndMT sul ventricolo sinistro (LV) in crescita. La restrizione della crescita imposta al cuore fetale e neonatale attraverso la formazione di EFE indotta da EndMT16 preclude ai pazienti con ostruzioni del tratto di efflusso ventricolare sinistro (LVOTO) come la stenosi aortica critica congenita e la sindrome del cuore sinistro ipoplasico (HLHS) la riparazione chirurgica biventricolare anatomica curativa17. Questo modello animale facilita lo studio dei meccanismi cellulari e della regolazione della formazione tissutale attraverso l'EndMT e consente di testare le opzioni di trattamento farmacologico 3,18.
L'ecocardiografia transaddominale viene utilizzata per monitorare la vitalità dell'innesto, la contrattilità e la pervietà delle anastomosi. Dopo l'eutanasia, la formazione di EFE può essere osservata macroscopicamente entro 3 giorni dal trapianto. Il tessuto EFE mostra le stesse caratteristiche istopatologiche del tessuto EFE umano di pazienti con LVOTO.
Quindi, questo modello animale, sebbene sviluppato per l'uso pediatrico nello spettro dell'HLHS, può essere applicato quando si studiano varie malattie basate sul meccanismo molecolare di EndMT.
Tutte le procedure sugli animali sono state condotte in accordo con il Consiglio Nazionale delle Ricerche. 2011. Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio: ottava edizione. I protocolli sugli animali sono stati esaminati e approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee del Boston Children's Hospital.
Prima dell'intervento chirurgico, tutti gli strumenti chirurgici vengono sterilizzati in autoclave a vapore e il tampone Krebs-Henseleit modificato, con una concentrazione finale di 22 mmol/L KCl, viene preparato come soluzione cardioplegica (Tabella 1). La soluzione viene sterilizzata con filtro e conservata a 4 °C per una notte. Un microscopio operatorio (12,5x) è necessario per la procedura di trapianto di cuore di ratto neonatale eterotopico.
1. Preparazione e anestesia
2. Preparazione chirurgica e trapianto eterotopico del cuore del donatore neonatale nel ratto ricevente
3. Prelievo del cuore del donatore neonatale
4. Recupero del ricevente e monitoraggio dell'innesto
Vitalità e battitura dell'innesto
In questo lavoro, la vitalità dell'innesto è stata valutata visivamente dopo che tutte le pinze erano state rimosse ed è stato consentito un tempo di riperfusione approssimativo di 10-15 minuti con un addome aperto per l'osservazione dell'innesto. Lo stesso sistema di punteggio per verificare oggettivamente la vitalità del trapianto è stato utilizzato per la valutazione visiva al termine dell'intervento chirurgico e per l'ecocardiografia su POD 1, POD 7 e POD 14...
Questo modello animale di trapianto eterotopico di cuore di ratto donatore neonatale nell'addome del ricevente crea la possibilità di studiare la fibrosi derivata da EndMT attraverso una valutazione istologica dettagliata del tessuto, identificare le vie di segnalazione regolatorie e testare le opzioni di trattamento. Poiché l'EndMT è il meccanismo alla base delle malattie fibrotiche del cuore, questo modello ha un grande valore nel campo della cardiochirurgia pediatrica e non solo. In questo modello, molti fattori po...
Nessuno.
Questa ricerca è stata finanziata da Additional Ventures - Single Ventricle Research Fund (SVRF) e Single Ventricle Expansion Fund (a I.F.) e da una borsa di studio Marietta Blau della OeAD-GmbH da fondi forniti dal Ministero Federale Austriaco dell'Istruzione, della Scienza e della Ricerca BMBWFC (a G.G.).
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Advanced Ventilator System For Rodents, SAR-1000 | CWE, Inc. | 12-03100 | small animal ventilator |
aSMA | Sigma | A2547 | Antibody for Immunohistochemistry |
Axio observer Z1 | Carl Zeiss | inverted microscope | |
Betadine Solution | Avrio Health L.P. | 367618150092 | |
CD31 | Invitrogen | MA1-80069 | Antibody for Immunohistochemistry |
DAPI | Invitrogen | D1306 | Antibody for Immunohistochemistry |
DemeLON Nylon black 10-0 | DemeTECH | NL76100065F0P | 10-0 Nylon suture |
ETFE IV Catheter, 18G x 2 | TERUMO SURFLO | SR-OX1851CA | intubation cannula |
Micro Clip 8mm | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-6471 | microvascular clamps |
Nylon black monofilament 11-0 | SURGICAL SPECIALTIES CORP | AA0130 | 11-0 Nylon |
O.C.T. Compound | Tissue-Tek | 4583 | Embedding medium for frozen tissue specimen |
p-SMAD2/3 | Invitrogen | PA5-110155 | Antibody for Immunohistochemistry |
Rodent, Tilting WorkStand | Hallowell EMC. | 000A3467 | oblique shelf for intubation |
Silk Sutures, Non-absorbable, 7-0 | Braintree Scientific | NC9201231 | Silk suture |
Slug/Snail | Abcam | ab180714 | Antibody for Immunohistochemistry |
Undyed Coated Vicryl 5-0 P-3 18" | Ethicon | J493G | 5-0 Vicryl |
Undyed Coated Vicryl 6-0 P-3 18" | Ethicon | J492G | 6-0 Vicryl |
VE-Cadherin | Abcam | ab231227 | Antibody for Immunohistochemistry |
Zeiss OPMI 6-SFR | Zeiss | Surgical microscope | |
Zen, Blue Edition, 3.6 | Zen | inverted microscope software |
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