Un modello di trapianto di cuore di ratto eterotopico neonatale per lo studio della transizione da endoteliale a mesenchimale

Riepilogo

Questo lavoro presenta un modello animale di fibrosi indotta da transizione endoteliale a mesenchimale, come si vede nei difetti cardiaci congeniti come la stenosi aortica critica o la sindrome del cuore sinistro ipoplasico, che consente una valutazione istologica dettagliata del tessuto, l'identificazione delle vie di segnalazione regolatorie e la verifica delle opzioni di trattamento.

Abstract

La fibroelastosi endocardica (EFE), definita dall'accumulo di tessuto subendocardico, ha un impatto importante sullo sviluppo del ventricolo sinistro (LV) e preclude ai pazienti con stenosi aortica critica congenita e sindrome del cuore sinistro ipoplasico (HLHS) la riparazione chirurgica biventricolare anatomica curativa. La resezione chirurgica è attualmente l'unica opzione terapeutica disponibile, ma l'EFE spesso si ripresenta, a volte con un pattern di crescita ancora più infiltrativo nel miocardio adiacente.

Per comprendere meglio i meccanismi alla base dell'EFE e per esplorare le strategie terapeutiche, è stato sviluppato un modello animale adatto alla sperimentazione preclinica. Il modello animale prende in considerazione che l'EFE è una malattia del cuore immaturo ed è associata a disturbi del flusso, come supportato dalle osservazioni cliniche. Pertanto, il trapianto di cuore eterotopico di cuori di donatori di ratti neonatali è la base di questo modello.

Il cuore di un ratto neonatale viene trapiantato nell'addome di un ratto adolescente e collegato all'aorta infrarenale e alla vena cava inferiore del ricevente. Mentre la perfusione delle arterie coronarie preserva la vitalità del cuore del donatore, il ristagno del flusso all'interno del ventricolo sinistro induce la crescita dell'EFE nel cuore molto immaturo. Il meccanismo alla base della formazione di EFE è la transizione delle cellule endoteliali endocardiche in cellule mesenchimali (EndMT), che è un meccanismo ben descritto dello sviluppo embrionale precoce delle valvole e dei setti, ma anche la principale causa di fibrosi nell'insufficienza cardiaca. La formazione di EFE può essere osservata macroscopicamente entro pochi giorni dal trapianto. L'ecocardiografia transaddominale viene utilizzata per monitorare la vitalità dell'innesto, la contrattilità e la pervietà delle anastomosi. Dopo l'eutanasia, il tessuto EFE viene raccolto e mostra le stesse caratteristiche istopatologiche del tessuto EFE umano di pazienti affetti da HLHS.

Questo modello in vivo consente di studiare i meccanismi di sviluppo dell'EFE nel cuore e di testare le opzioni di trattamento per prevenire la formazione di questo tessuto patologico e offre l'opportunità di un esame più generalizzato della fibrosi indotta da EndMT.

Introduzione

La fibroelastosi endocardica (EFE), definita dall'accumulo di collagene e fibre elastiche nel tessuto subendocardico, si presenta come un endocardio ispessito perlaceo o opaco; L'EFE subisce una crescita più attiva durante il periodo fetale e la prima infanzia¹. In uno studio autoptico, il 70% dei casi con sindrome del cuore sinistro ipoplasico (HLHS) è stato associato alla presenza di EFE².

Le cellule che esprimono marcatori per i fibroblasti sono la principale popolazione cellulare in EFE, ma queste cellule esprimono contemporaneamente anche marcatori endoteliali endocardici, che è un'indicazione dell'origine di queste cellule EFE. Il nostro gruppo ha precedentemente stabilito che il meccanismo alla base della formazione di EFE coinvolge un cambiamento fenotipico delle cellule endoteliali endocardiche in fibroblasti attraverso la transizione endoteliale a mesenchimale (EndMT)³. L'EndMT può essere rilevata utilizzando la doppia colorazione immunoistochimica per marcatori endoteliali come il cluster di differenziazione (CD) 31 o l'endotelio vascolare (VE)-caderina (CD144) e marcatori di fibroblasti (ad esempio, actina alfa-muscolare liscia, α-SMA). Inoltre, abbiamo anche precedentemente stabilito il ruolo regolatore della via TGF-ß in questo processo con l'attivazione dei fattori di trascrizione SLUG, SNAIL, e TWIST³.

L'EndMT è un processo fisiologico che si verifica durante lo sviluppo cardiaco embrionale e porta alla formazione dei setti e delle valvole dai cuscinetti endocardici⁴, ma provoca anche fibrosi d'organo nell'insufficienza cardiaca, nella fibrosi renale o nel cancro e svolge un ruolo chiave nell'aterosclerosi vascolare 5,6,7,8. L'EndMT nella fibrosi cardiaca è regolata principalmente attraverso la via TGF-β, come abbiamo riportato ^3,9. Sono stati descritti vari stimoli per indurre l'EndMT: infiammazione¹⁰, ipossia¹¹, alterazioni meccaniche¹² e disturbi del flusso, comprese le alterazioni del flusso sanguigno intracavitario¹³, e l'EndMT può anche essere una conseguenza di una malattia genetica¹⁴.

Questo modello animale è stato sviluppato utilizzando i componenti chiave dello sviluppo dell'EFE cardiaca, che sono l'immaturità e le alterazioni del flusso sanguigno intracavitario, in particolare il ristagno del flusso. L'immaturità è stata soddisfatta utilizzando cuori di ratto neonatale come donatori, poiché i ratti neonatali sono noti per essere immaturi dal punto di vista dello sviluppo subito dopo la nascita. Il trapianto di cuore eterotopico ha offerto la possibilità di limitare il flusso intracavitario¹⁵.

Da un punto di vista clinico, questo modello animale consente di studiare meglio l'impatto di EndMT sul ventricolo sinistro (LV) in crescita. La restrizione della crescita imposta al cuore fetale e neonatale attraverso la formazione di EFE indotta da EndMT¹⁶ preclude ai pazienti con ostruzioni del tratto di efflusso ventricolare sinistro (LVOTO) come la stenosi aortica critica congenita e la sindrome del cuore sinistro ipoplasico (HLHS) la riparazione chirurgica biventricolare anatomica curativa¹⁷. Questo modello animale facilita lo studio dei meccanismi cellulari e della regolazione della formazione tissutale attraverso l'EndMT e consente di testare le opzioni di trattamento farmacologico ^3,18.

L'ecocardiografia transaddominale viene utilizzata per monitorare la vitalità dell'innesto, la contrattilità e la pervietà delle anastomosi. Dopo l'eutanasia, la formazione di EFE può essere osservata macroscopicamente entro 3 giorni dal trapianto. Il tessuto EFE mostra le stesse caratteristiche istopatologiche del tessuto EFE umano di pazienti con LVOTO.

Quindi, questo modello animale, sebbene sviluppato per l'uso pediatrico nello spettro dell'HLHS, può essere applicato quando si studiano varie malattie basate sul meccanismo molecolare di EndMT.

Protocollo

Tutte le procedure sugli animali sono state condotte in accordo con il Consiglio Nazionale delle Ricerche. 2011. Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio: ottava edizione. I protocolli sugli animali sono stati esaminati e approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee del Boston Children's Hospital.

Prima dell'intervento chirurgico, tutti gli strumenti chirurgici vengono sterilizzati in autoclave a vapore e il tampone Krebs-Henseleit modificato, con una concentrazione finale di 22 mmol/L KCl, viene preparato come soluzione cardioplegica (Tabella 1). La soluzione viene sterilizzata con filtro e conservata a 4 °C per una notte. Un microscopio operatorio (12,5x) è necessario per la procedura di trapianto di cuore di ratto neonatale eterotopico.

1. Preparazione e anestesia

1. Utilizzare come riceventi ratti Lewis maschi/femmine con un peso di circa 150 g (5-6 settimane di età).
2. Per iniziare, radere generosamente l'addome del ratto con un rasoio.
3. Mettere il ratto in una camera di isoflurano e attivare il flusso di ossigeno a 2 L/min con isoflurano al 2% fino a quando l'animale non è adeguatamente sedato ma respira ancora spontaneamente. Iniettare 45 mg/kg di ketamina e 5 mg/kg di xilazina per via intraperitoneale (IP), oltre a 300 U/kg di eparina. Confermare la corretta anestesia con un test di pizzicamento delle dita dei piedi.
   NOTA: Monitorare attentamente la respirazione spontanea e la frequenza cardiaca attraverso la palpazione del torace per garantire uno stato emodinamico stabile durante l'intero processo.
4. Per l'intubazione, posizionare il ratto su un ripiano obliquo (Figura 1), fissare i denti anteriori con una corda e posizionare la testa rivolta verso il chirurgo.
5. Posizionare la luce all'esterno del collo sull'area delle corde vocali, afferrare la lingua con due dita e spingerla leggermente verso l'alto e verso sinistra per fornire una visione ottimale per l'intubazione. Utilizzare una cannula da 18 G, 2 in per un ratto da 100-150 g. Fissare il tubo intratracheale con del nastro adesivo.
   NOTA: Per l'intubazione si consigliano lenti chirurgiche con ingrandimento 3,5x.
6. Collegare la cannula per intubazione al ventilatore per animali di piccola taglia e regolare le impostazioni secondo le istruzioni del produttore in base alle dimensioni dell'animale.
   NOTA: Utilizzare le seguenti impostazioni per un ratto di 150 g: modalità volume; frequenza respiratoria, 55/min; volume corrente, 1,3 mL 50 % rapporto I/E, ma questo può essere regolato in modo appropriato secondo necessità. Assicurare un corretto movimento toracico bilaterale e uniforme e somministrare isoflurano in modo continuo allo 0,5%-2% attraverso il ventilatore.
7. Posizionare il ratto su un termoforo (per mantenere la normale temperatura corporea) in posizione supina con la coda rivolta verso il chirurgo. Sterilizzare l'addome tre volte con una soluzione di betadine e il 70% di etanolo alternativamente. Somministrare il lubrificante per gli occhi e coprire il ratto con un telo chirurgico sterile, lasciando scoperto l'addome.

2. Preparazione chirurgica e trapianto eterotopico del cuore del donatore neonatale nel ratto ricevente

1. Eseguire una laparotomia della linea mediana utilizzando un bisturi a 15 lame per l'incisione cutanea e utilizzare le forbici per aprire la parete addominale anteriore, seguita dall'esposizione smussata dell'aorta addominale retroperitoneale e della vena cava inferiore (IVC) con applicatori con punta di cotone.
2. Mobilizzare l'intestino (compreso il colon discendente) e posizionarlo verso il quadrante superiore destro. Coprire l'intestino con una garza calda imbevuta di soluzione salina. Utilizzare divaricatori per garantire un'esposizione ottimale dell'IVC e dell'aorta addominale.
3. Eseguire una dissezione smussata dell'IVC infrarenale e dell'aorta addominale verso la biforcazione. Legare tutte le arterie e le vene ramificate infrarenali (ad es. arteria mesenterica inferiore e arterie linfonodali) con una sutura di nylon 10-0.
   NOTA: C'è una grande variabilità nell'anatomia di questi rami laterali. Monitora visivamente il polso e la frequenza cardiaca dell'aorta quando non sono disponibili altri monitoraggi emodinamici. Valutare la corretta profondità dell'anestesia ogni 15 minuti attraverso un test di pizzicamento delle dita dei piedi. Regolare di conseguenza la concentrazione di isoflurano.
4. Dopo che il cuore del donatore è stato prelevato da un ratto neonatale, consegnare il cuore asportato in condizioni sterili in una vasca chirurgica contenente il tampone Krebs-Henseleit sul campo operatorio. Irrigare il cuore del donatore in modo intermittente con una soluzione cardioplegica ghiacciata.
   NOTA: Quando è disponibile un secondo chirurgo, il cuore deve essere preparato contemporaneamente, poiché un secondo chirurgo riduce il tempo di anestesia totale dell'animale ricevente e il tempo di ischemia del cuore del donatore. Quando non è disponibile un secondo chirurgo, coprire l'addome del ricevente con soluzione salina calda e monitorare l'animale durante la procedura di raccolta.
5. Applicare quattro piccole pinze vascolari atraumatiche ai segmenti distale e prossimale dell'aorta infrarenale e all'IVC. Se necessario, occludere temporaneamente un vaso renale sfavorevole con una sutura di seta 7-0 e rilasciare la sutura dopo la procedura. Posizionare una sutura di nylon 10-0 verticalmente sulla parete anteriore dell'aorta per facilitare l'aortotomia. Eseguire un'aortotomia con due piccoli tagli orizzontali (a forma di cuneo) con microforbici tirando leggermente verso l'alto la sutura.
   NOTA: Per rimuovere eventuali coaguli di sangue, si consiglia di lavare il lume aortico con soluzione fisiologica eparinizzata.
6. Posizionare il cuore del donatore sul lato sinistro (dal punto di vista dell'animale) dell'aorta e fissare l'aorta infrarenale del ricevente e l'aorta ascendente del donatore da un lato all'altro nelle posizioni delle ore 12 e delle ore 6 dell'aortotomia con punti di sutura. Continuare con la terza e la quarta sutura a ore 3 e a ore 9, capovolgendo delicatamente il cuore sul lato destro dell'aorta dopo la terza sutura. Completare l'anastomosi arteriosa aggiungendo da una a due suture ad ogni intercapedine.
   NOTA: È necessario prestare attenzione a evitare di toccare l'aorta ascendente del donatore o l'aorta addominale del ricevente con il forcipe durante la creazione dell'anastomosi per evitare danni ai tessuti.
7. Ruotare il ratto in senso antiorario, con la testa rivolta verso la mano sinistra del chirurgo. Spostare l'aorta del donatore sul lato sinistro dell'aorta addominale per consentire una visione ottimale dell'IVC.
8. Eseguire una venotomia sull'IVC, leggermente prossimale all'anastomosi aortica, utilizzando una lama 11 per la puntura e microforbici per un'adeguata regolazione dimensionale in base al diametro del tronco polmonare del donatore. Anche in questo caso, lavare il lume intracavale con soluzione fisiologica.
9. Iniziare con l'anastomosi venosa tra l'IVC del ricevente e il tronco polmonare del donatore, che si ottiene al meglio posizionando suture di nylon 11-0 interrotte sulla parete posteriore del vaso, a partire dalle posizioni delle ore 12 e delle ore 6 (relative all'IVC), quindi posizionare una sutura continua in nylon 11-0 sulla parete anteriore (dalle ore 6 verso la posizione delle ore 12).
10. Coprire le anastomosi con piccole strisce di una spugna di gelatina assorbibile e rimuovere le pinze microvascolari a partire da quella distale. Utilizzare un applicatore con punta di cotone per comprimere leggermente le spugne per ottenere un'emostasi ottimale.
11. Osservare il riempimento dei vasi coronarici dell'innesto al momento del rilascio delle pinze microvascolari distali e assicurarsi che il cuore del donatore inizi a battere immediatamente quando la pinza prossimale viene rilasciata.
    NOTA: La vitalità dell'innesto può essere valutata da 0 a 4 intraoperatoriamente secondo un punteggio di Stanford modificato¹⁹ per confermare un'adeguata funzione dell'innesto.
12. Riposizionare l'intestino nell'addome facendo attenzione a non distorcere l'anastomosi arteriosa e venosa.
13. Somministrare meloxicam (1 mg/kg) ed ethiqa XR (0,65 mg/kg) per via sottocutanea mentre l'animale è completamente anestetizzato per accertare l'analgesia postoperatoria. Quindi, chiudere la parete addominale con una sutura continua 5-0 riassorbibile in viryl prima di chiudere la pelle con una sutura in vicryl riassorbibile 6-0 per via intracutanea.
    NOTA: le linee guida relative agli errori comuni e alla risoluzione dei problemi sono presentate nella Tabella 2.

3. Prelievo del cuore del donatore neonatale

1. Collocare il ratto donatore neonatale in una camera insufflata con isoflurano (2%) per la sedazione. Somministrare ketamina (75 mg/kg) e xilazina (5 mg/kg), nonché eparina (300 U/kg) per via intraperitoneale.
2. Confermare la profondità dell'anestesia pizzicando le dita dei piedi e posizionare il ratto in posizione supina con la coda rivolta verso di te. Sterilizzare l'intero torace e la parete addominale con betadine ed etanolo al 70% tre volte alternativamente. Coprire il ratto con un telo chirurgico sterile.
3. Utilizzando un microscopio operatorio 12,5x, rimuovere l'intera parete toracica anteriore iniziando con un'incisione orizzontale utilizzando un bisturi a 15 lame in corrispondenza dell'ipfoide, seguita da incisioni verticali lateralmente fino alle ascelle su entrambi i lati con le forbici. La parete toracica anteriore può quindi essere rimossa continuando con un'altra incisione orizzontale proprio sotto il collo.
4. Sezionare l'IVC, la vena cava superiore destra e sinistra e i vasi polmonari con le forbici, quindi circondare e legare tutti i vasi con una sutura di seta 7-0. Somministrare 3 mL di soluzione di Krebs-Henseleit modificata ghiacciata e ad alto contenuto di potassio nell'atrio destro perforando l'IVC con un ago da 30 G e spingendo leggermente il diaframma verso il basso con una pinza.
5. Tagliare l'IVC, le SVC, i vasi polmonari e l'aorta con le forbici. Eseguire il transetto delle arterie polmonari il più lontano possibile e dell'aorta distale rispetto al tronco brachiocefalico per garantire una lunghezza adeguata utilizzando un bisturi a 11 lame.
6. Separare il tronco polmonare e l'aorta ascendente con microforbici e sciacquare il cuore con una soluzione cardioplegica ghiacciata utilizzando una siringa da 3 ml.

4. Recupero del ricevente e monitoraggio dell'innesto

1. Dopo l'intervento chirurgico, dai al ratto tutto il tempo per svegliarsi, che di solito si verifica in una finestra temporale di 15 minuti, e lascialo recuperare su un termoforo.
   NOTA: Non sono necessari antibiotici a causa del bassissimo rischio di infezione e per non compromettere il modello sperimentale, e non viene applicata alcuna restrizione al cibo o all'acqua.
2. Dopo il trapianto, monitorare quotidianamente la funzione dell'innesto mediante palpazione del cuore trapiantato, ma considerare che questo a volte può essere difficile da valutare a causa della sovrapposizione intestinale.
   NOTA: L'ecocardiografia addominale può misurare in modo più accurato la vitalità dell'innesto. Per l'ecocardiografia, sedare leggermente il ratto con isoflurano (1-2%) inalato attraverso un cono nasale e posizionarlo su un termoforo. L'ecocardiografia viene solitamente eseguita il giorno postoperatorio (POD) 1, POD 7 e POD 14. Per consentire la valutazione della frequenza cardiaca e della contrattilità, è possibile ottenere facilmente viste dell'asse lungo e dell'asse corto (Figura 2A, B). Per valutare le anastomosi, utilizzare l'ecocardiografia Doppler (Figura 3A) e confermare la formazione di tessuto EFE come uno strato endocardico eco-luminoso all'interno della cavità ventricolare sinistra (Figura 3B, C).

Risultati

Vitalità e battitura dell'innesto
In questo lavoro, la vitalità dell'innesto è stata valutata visivamente dopo che tutte le pinze erano state rimosse ed è stato consentito un tempo di riperfusione approssimativo di 10-15 minuti con un addome aperto per l'osservazione dell'innesto. Lo stesso sistema di punteggio per verificare oggettivamente la vitalità del trapianto è stato utilizzato per la valutazione visiva al termine dell'intervento chirurgico e per l'ecocardiografia su POD 1, POD 7 e POD 14...

Discussione

Questo modello animale di trapianto eterotopico di cuore di ratto donatore neonatale nell'addome del ricevente crea la possibilità di studiare la fibrosi derivata da EndMT attraverso una valutazione istologica dettagliata del tessuto, identificare le vie di segnalazione regolatorie e testare le opzioni di trattamento. Poiché l'EndMT è il meccanismo alla base delle malattie fibrotiche del cuore, questo modello ha un grande valore nel campo della cardiochirurgia pediatrica e non solo. In questo modello, molti fattori po...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Advanced Ventilator System For Rodents, SAR-1000	CWE, Inc.	12-03100	small animal ventilator
aSMA	Sigma	A2547	Antibody for Immunohistochemistry
Axio observer Z1	Carl Zeiss		inverted microscope
Betadine Solution	Avrio Health L.P.	367618150092
CD31	Invitrogen	MA1-80069	Antibody for Immunohistochemistry
DAPI	Invitrogen	D1306	Antibody for Immunohistochemistry
DemeLON Nylon black 10-0	DemeTECH	NL76100065F0P	10-0 Nylon suture
ETFE IV Catheter, 18G x 2	TERUMO SURFLO	SR-OX1851CA	intubation cannula
Micro Clip 8mm	Roboz Surgical Instrument Co.	RS-6471	microvascular clamps
Nylon black monofilament 11-0	SURGICAL SPECIALTIES CORP	AA0130	11-0 Nylon
O.C.T. Compound	Tissue-Tek	4583	Embedding medium for frozen tissue specimen
p-SMAD2/3	Invitrogen	PA5-110155	Antibody for Immunohistochemistry
Rodent, Tilting WorkStand	Hallowell EMC.	000A3467	oblique shelf for intubation
Silk Sutures, Non-absorbable, 7-0	Braintree Scientific	NC9201231	Silk suture
Slug/Snail	Abcam	ab180714	Antibody for Immunohistochemistry
Undyed Coated Vicryl 5-0 P-3 18"	Ethicon	J493G	5-0 Vicryl
Undyed Coated Vicryl 6-0 P-3 18"	Ethicon	J492G	6-0 Vicryl
VE-Cadherin	Abcam	ab231227	Antibody for Immunohistochemistry
Zeiss OPMI 6-SFR	Zeiss		Surgical microscope
Zen, Blue Edition, 3.6	Zen		inverted microscope software