המחברים מודים על תמיכתה של קרן משפחת תומאס א. ופמלה מ. מישל ל- S.S. וקרן הרולד ס. שוט למימון הקתדרה ע"ש הרולד ס. שוט, המכללה לרפואה של אוניברסיטת קליפורניה, ל- S.S.

1. תיוג חיסוני של תעלות יונים בתאים בתרבית
<ol><li>הכנת התאים ומערך הניסוי<ol><li>לשמור על התאים כתרבות גידול פעיל ב 75 ס"מ2 צלוחיות תרבית. עברו את התאים פעם אחת עד שהם הופכים ל-50%-90% נפגשים, תלוי בזמן ההכפלה של קו התא בו משתמשים. הערה: במחקר הנוכחי נעשה שימוש בתאי D283, קו תאי מדולובלסטומה מקבוצ?...

מיקוד פרמקולוגי של תעלות יונים לטיפול בגידולים מוצקים

<ol>
	<li>Prevarskaya, N., Skryma, R., Shuba, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ion+channels+in+cancer:+Are+cancer+hallmarks+oncochannelopathies.">Ion channels in cancer: Are cancer hallmarks oncochannelopathies.</a> Physiological Reviews. 98 (2), 559-621 (2018).</li><li>Rao, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ligand-gated+neurotransmitter+receptors+as+targets+for+treatment+and+management+of+cancers.">Ligand-gated neurotransmitter receptors as targets for treatment and management of cancers.</a> Frontiers in Physiology. 13, 839437 (2022).</li><li>Mohr, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer-associated+intermediate+conductance+Ca2+-activated+K++channel+KCa3.1.">Cancer-associated intermediate conductance Ca2+-activated K+ channel KCa3.1.</a> Cancers. 11 (1), 109 (2019).</li><li>Fels, B., Bulk, E., Petho, Z., Schwab, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+TRP+channels+in+the+metastatic+cascade.">The role of TRP channels in the metastatic cascade.</a> Pharmaceuticals. 11 (2), 48 (2018).</li><li>Eil, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ionic+immune+suppression+within+the+tumour+microenvironment+limits+T+cell+effector+function.">Ionic immune suppression within the tumour microenvironment limits T cell effector function.</a> Nature. 537 (7621), 539-543 (2016).</li><li>Haustrate, A., Hantute-Ghesquier, A., Prevarskaya, N., Lehen'kyi, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monoclonal+antibodies+targeting+ion+channels+and+their+therapeutic+potential.">Monoclonal antibodies targeting ion channels and their therapeutic potential.</a> Frontiers in Pharmacology. 10, 606 (2019).</li><li>Kischel, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ion+channels:+New+actors+playing+in+chemotherapeutic+resistance.">Ion channels: New actors playing in chemotherapeutic resistance.</a> Cancers. 11 (3), 376 (2019).</li><li>Tuszynski, J., Tilli, T. M., Levin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ion+channel+and+neurotransmitter+modulators+as+electroceutical+approaches+to+the+control+of+cancer.">Ion channel and neurotransmitter modulators as electroceutical approaches to the control of cancer.</a> Current Pharmaceutical Design. 23 (32), 4827-4841 (2017).</li><li>Kale, V. P., Amin, S. G., Pandey, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+ion+channels+for+cancer+therapy+by+repurposing+the+approved+drugs.">Targeting ion channels for cancer therapy by repurposing the approved drugs.</a> Biochimica Biophysica Acta. 1848 (10), 2747-2755 (2015).</li><li>Wickenden, A., Priest, B., Erdemli, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ion+channel+drug+discovery:+Challenges+and+future+directions.">Ion channel drug discovery: Challenges and future directions.</a> Future Medicinal Chemistry. 4 (5), 661-679 (2012).</li><li>Rocha, P. R. F., Elghajiji, A., Tosh, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasensitive+system+for+electrophysiology+of+cancer+cell+populations:+A+review.">Ultrasensitive system for electrophysiology of cancer cell populations: A review.</a> Bioelectricity. 1 (3), 131-138 (2019).</li><li>Sengupta, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#945;5-GABAA+receptors+negatively+regulate+MYC-amplified+medulloblastoma+growth.">&#945;5-GABAA receptors negatively regulate MYC-amplified medulloblastoma growth.</a> Acta Neuropathologica. 127 (4), 593-603 (2014).</li><li>Jonas, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=First+in+vivo+testing+of+compounds+targeting+Group+3+medulloblastomas+using+an+implantable+microdevice+as+a+new+paradigm+for+drug+development.">First in vivo testing of compounds targeting Group 3 medulloblastomas using an implantable microdevice as a new paradigm for drug development.</a> Journal of Biomedical Nanotechnology. 12 (6), 1297-1302 (2016).</li><li>Kallay, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulating+native+GABAA+receptors+in+medulloblastoma+with+positive+allosteric+benzodiazepine-derivatives+induces+cell+death.">Modulating native GABAA receptors in medulloblastoma with positive allosteric benzodiazepine-derivatives induces cell death.</a> Journal of Neurooncology. 142 (3), 411-422 (2019).</li><li>Pomeranz Krummel, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Melanoma+cell+intrinsic+GABAA+receptor+enhancement+potentiates+radiation+and+immune+checkpoint+response+by+promoting+direct+and+T+cell-mediated+anti-tumor+activity.">Melanoma cell intrinsic GABAA receptor enhancement potentiates radiation and immune checkpoint response by promoting direct and T cell-mediated anti-tumor activity.</a> International Journal of Radiation Oncology, Biology, Physics. 109 (4), P1040-P1053 (2021).</li><li>Bhattacharya, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutically+leveraging+GABAA+receptors+in+cancer.">Therapeutically leveraging GABAA receptors in cancer.</a> Experimental Biology and Medicine. 246 (19), 2128-2135 (2021).</li><li>Mazia, D., Schatten, G., Sale, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adhesion+of+cells+to+surfaces+coated+with+polylysine.+Applications+to+electron+microscopy.">Adhesion of cells to surfaces coated with polylysine. Applications to electron microscopy.</a> Journal of Cell Biology. 66 (1), 198-200 (1975).</li><li>Wiatrak, B., Kubis-Kubiak, A., Piwowar, A., Barg, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PC12+cell+line:+Cell+types,+coating+of+culture+vessels,+differentiation+and+other+culture+conditions.">PC12 cell line: Cell types, coating of culture vessels, differentiation and other culture conditions.</a> Cells. 9 (4), 958 (2020).</li><li>Baker, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fixation+in+cytochemistry+and+electron-microscopy.">Fixation in cytochemistry and electron-microscopy.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 6 (5), 303-308 (1958).</li><li>Chung, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histomorphological+and+molecular+assessments+of+the+fixation+times+comparing+formalin+and+ethanol-based+fixatives.">Histomorphological and molecular assessments of the fixation times comparing formalin and ethanol-based fixatives.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 66 (2), 121-135 (2018).</li><li>Crowley, L. C., Christensen, M. E., Waterhouse, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+mitochondrial+transmembrane+potential+by+TMRE+staining.">Measuring mitochondrial transmembrane potential by TMRE staining.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2016 (12), (2016).</li><li>Cory, A. H., Owen, T. C., Barltrop, J. A., Cory, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+an+aqueous+soluble+tetrazolium/formazan+assay+for+cell+growth+assays+in+culture.">Use of an aqueous soluble tetrazolium/formazan assay for cell growth assays in culture.</a> Cancer Communications. 3 (7), 207-212 (1991).</li><li>Maro, B., Marty, M. C., Bornens, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+and+in+vitro+effects+of+the+mitochondrial+uncoupler+FCCP+on+microtubules.">In vivo and in vitro effects of the mitochondrial uncoupler FCCP on microtubules.</a> EMBO Journal. 1 (11), 1347-1352 (1982).</li><li>Zheng, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+for+regulation+of+melanoma+cell+death+via+activation+of+thermo-TRPV4+and+TRPV.">Mechanism for regulation of melanoma cell death via activation of thermo-TRPV4 and TRPV.</a> Journal of Oncology. 2019, 7362875 (2019).</li><li>Konno, K., Watanabe, M., Luj&#225;n, R., Ciruela, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemistry+for+ion+channels+and+their+interacting+molecules:+Tips+for+improving+antibody+accessibility.">Immunohistochemistry for ion channels and their interacting molecules: Tips for improving antibody accessibility.</a> Receptor and Ion Channel Detection in the Brain. , (2016).</li><li>Mortensen, M., Smart, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-channel+recording+of+ligand-gated+ion+channels.">Single-channel recording of ligand-gated ion channels.</a> Nature Protocols. 2 (11), 2826-2841 (2007).</li><li>Franken, N. A., Rodermond, H. M., Stap, J., Haveman, J., van Bree, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonogenic+assay+of+cells+in+vitro.">Clonogenic assay of cells in vitro.</a> Nature Protocols. 1 (5), 2315-2319 (2006).</li><li>Rafehi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonogenic+assay:+Adherent+cells.">Clonogenic assay: Adherent cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (49), 2573 (2011).</li><li>Scudiero, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+a+soluble+tetrazolium/formazan+assay+for+cell+growth+and+drug+sensitivity+in+culture+using+human+and+other+tumor+cell+lines.">Evaluation of a soluble tetrazolium/formazan assay for cell growth and drug sensitivity in culture using human and other tumor cell lines.</a> Cancer Research. 48 (17), 4827-4833 (1988).</li><li>Wang, P., Henning, S. M., Heber, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limitations+of+MTT+and+MTS-based+assays+for+measurement+of+antiproliferative+activity+of+green+tea+polyphenols.">Limitations of MTT and MTS-based assays for measurement of antiproliferative activity of green tea polyphenols.</a> PLoS One. 5, e10202 (2010).</li><li>Berridge, M. V., Tan, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+cellular+reduction+of+3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium+bromide+(MTT):+subcellular+localization,+substrate+dependence,+and+involvement+of+mitochondrial+electron+transport+in+MTT+reduction.">Characterization of the cellular reduction of 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT): subcellular localization, substrate dependence, and involvement of mitochondrial electron transport in MTT reduction.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 303 (2), 474-482 (1993).</li><li>Plumb, J. A., Milroy, R., Kaye, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+the+pH+dependence+of+3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazolium+bromide-formazan+absorption+on+chemosensitivity+determined+by+a+novel+tetrazolium-based+assay.">Effects of the pH dependence of 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide-formazan absorption on chemosensitivity determined by a novel tetrazolium-based assay.</a> Cancer Research. 49 (16), 4435-4440 (1989).</li><li>Chakrabarti, R., Kundu, S., Kumar, S., Chakrabarti, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vitamin+A+as+an+enzyme+that+catalyzes+the+reduction+of+MTT+to+formazan+by+vitamin+C.">Vitamin A as an enzyme that catalyzes the reduction of MTT to formazan by vitamin C.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 80 (1), 133-138 (2000).</li><li>Dong, G. W., Preisler, H. D., Priore, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+limitations+of+in+vitro+clonogenic+drug+sensitivity+assays.">Potential limitations of in vitro clonogenic drug sensitivity assays.</a> Cancer Chemotherapy and Pharmacology. 13 (3), 206-210 (1984).</li><li>Sun, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STIM1-+and+Orai1-Mediated+Ca2+oscillation+orchestrates+invadopodium+formation+and+melanoma+invasion.">STIM1- and Orai1-Mediated Ca2+oscillation orchestrates invadopodium formation and melanoma invasion.</a> Journal of Cell Biology. 207 (4), 535-548 (2014).</li></ol>

שינויים בתפקוד תעלות היונים משנים את מפל האיתות התוך-תאי, מה שיכול להשפיע על התפקוד הכללי של התא. במהלך העשור האחרון, התברר יותר ויותר כי תעלות יונים חשובות לצמיחת תאים סרטניים וגרורות. חשוב לציין, תעלות יונים רבות הן מטרות עיקריות לטיפולים מאושרים המכוונים למגוון רחב של הפרעות24<...

חלבוני הובלת ממברנות הם קריטיים לתקשורת בין תאים, כמו גם לשמירה על הומאוסטזיס תאי. בין חלבוני הובלת הממברנה, תעלות יונים משמשות להנעת גדילה והתפתחות של תאים ולשמירה על מצב התאים בסביבות מאתגרות ומשתנות. כמו כן, דווח כי תעלות יונים מניעות ותומכות בהתפתחות גידולים מוצקים, הן מערכתית והן במערכת העצבים המרכזית (CNS)1,2. לדוגמה, תעלות KCa3.1 אחראיות על ויסות פוטנציאל הממברנה ובקרת נפח התא, דבר חשוב בוויסות מחזור התא. תעלות KCa3.1 פגומות דווחו כתורמות להתרבות חריגה של תאי גידול3. יתר על כן, תעלות יונים עשויות לתרום להפצה גרורתית של סרטן. ערוצי פוטנציאל קולטן חולף (TRP), למשל, מעורבים בזרם Ca 2+ ו- Mg2+; זרם זה מפעיל מספר קינאזות וחלבוני הלם חום שתפקידם לווסת את המטריצה החוץ תאית המקיפה גידול, שהיא, בתורה, חשובה להתחלת גרורות סרטניות4.
מאחר שתעלות יונים יכולות לתרום להתפתחות סרטן, הן עשויות גם להיות מטרות לטיפול תרופתי בסרטן. לדוגמה, עמידות לשיטות טיפול, כולל כימותרפיה ואימונותרפיה חדשנית, קשורה לתפקוד לקוי של תעלות יונים 5,6,7. בנוסף, תעלות יונים מתגלות כמטרות תרופתיות חשובות המעכבות צמיחה והתפתחות של סרטן, כאשר נבדקות תרופות למולקולות קטנות (מאושרות על ידי ה-FDA), כמו גם ביופולימרים, כולל נוגדנים חד-שבטיים 1,2,8,9. בעוד שחלה התקדמות רבה בחזית זו, גילוי תרופות לסרטן תעלות יונים נותר לא מפותח. זאת, בין היתר, בשל האתגרים הייחודיים של חקר תעלות יונים בתאים סרטניים. לדוגמה, ישנן מגבלות טכניות בהגדרת בדיקות אלקטרופיזיולוגיות עבור תרכובות בעלות פעולה איטית והבדלים זמניים בהפעלת ערוצים ובפעולת תרופות. יתר על כן, מסיסות התרכובות יכולה גם לעכב התקדמות, מכיוון שרוב מערכות האלקטרופיזיולוגיה האוטומטיות הנמצאות בשימוש כיום משתמשות במצעים הידרופוביים, אשר עשויים לתרום לממצאים כתוצאה מספיגת תרכובות. בנוסף, טיפולים מולקולריים ביו-אורגניים גדולים כגון מוצרים טבעיים, פפטידים ונוגדנים חד-שבטיים מאתגרים מבחינה טכנית לסינון באמצעות בדיקות אלקטרופיזיולוגיות קונבנציונליות10. לבסוף, התכונות הביו-חשמליות של תאים סרטניים עדיין אינן מובנות כראוי11.
בינתיים, צביעת האימונופלואורסנציה של תעלות יונים היא לעתים קרובות מאתגרת. זה נובע, בין השאר, מהמורכבות של המבנים שלהם וההקשר שלהם בקרום, המשפיעים על היכולת לייצר ולהשתמש בנוגדנים למחקרי מיקרוסקופיה. חשוב במיוחד שהנוגדנים המשמשים להכתמת תעלות יונים יאומתו עבור ספציפיות, אהדה ויכולת שחזור. יש לשקול נוגדנים מסחריים לתעלות יונים על סמך אסטרטגיית האימות שלהם והיסטוריית הפרסום שלהם. ניסויים צריכים לכלול בקרות שליליות כדי להדגים את היעדר קשירה לא ספציפית על ידי הפלה או נוקאאוט של חלבון המטרה. לחלופין, קווי תאים שבהם חלבון המטרה נעדר או בשפע נמוך בהתבסס על mRNA או קביעת חלבונים עשויים לשמש כבקרות שליליות. לדוגמה, מחקר זה מראה לוקליזציה של תת-יחידת קולטן (GABA) Gabra5 בקו תאי מדולובלסטומה (D283). תאי D283 עם הפלה של siRNA ותאי Daoy, קו תאי מדולובלסטומה צרבלרי נוסף, הוכתמו עבור Gabra5 ולא הראו צביעה ניכרת (הנתונים לא מוצגים).
כאן, שיטות מוצגות לנתח ולהעריך תפקוד ערוץ יונים, כמו גם את ההשפעה של אפנן ערוץ יונים על תאים סרטניים. פרוטוקולים מסופקים עבור (1) צביעת תאים עבור תעלת יונים, (2) בדיקת המצב המקוטב של מיטוכונדריה, (3) ביסוס תפקוד תעלת יונים באמצעות אלקטרופיזיולוגיה, ו (4) אימות תרופות במבחנה. פרוטוקולים אלה מדגישים מחקרים של קולטן חומצה גמא-אמינובוטירית מסוג A (GABAA) 2,12,13,14,15,16, תעלת אניון כלוריד וקולטן נוירוטרנסמיטר מעכב עיקרי. עם זאת, השיטות המוצגות כאן חלות על חקר תאים סרטניים רבים אחרים ותעלות יונים.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>ABS SpectraMax Plate Reader</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>ABS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>00-4555-56</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Flor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A32723</td>
			<td>Goat Anti-Rabbit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15240-062</td>
			<td>100x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 Supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12587-010</td>
			<td>Lacks vitamin A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosafety Cabinet</td>
			<td>LABCONCO</td>
			<td>302381101</td>
			<td>Class II, Type A2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1606-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Incubator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-998-211</td>
			<td>Heracell VIOS 160i</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C7902</td>
			<td>Dihydrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Dishes, 150 mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-600-004</td>
			<td>Cell culture treated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Flasks, 75 cm2</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>430641U</td>
			<td>Cell culture treated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Plates, 6 well</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>353046</td>
			<td>Cell culture treated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Plates, 96 well</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>353072</td>
			<td>Cell culture treated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>EP-5804R</td>
			<td>Refrigerated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning CoolCell</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-210-0006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips, 22 x 22 mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-553-450</td>
			<td>Corning brand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D283 Med</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>HTB-185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DABCO Mounting Media</td>
			<td>EMS</td>
			<td>17989-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose</td>
			<td>Sigma Life Sciences</td>
			<td>D9434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D2650</td>
			<td>Cell culture grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12, base media</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11330-032</td>
			<td>With phenol red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12, phenol red free</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>21041-025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E4378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epidermal Growth Factor</td>
			<td>STEMCELL</td>
			<td>78006.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCCP</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>AB120081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, Qualified</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10437-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibroblast Growth Factor, Basic</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>GF003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GARBA5 Antibody</td>
			<td>Aviva</td>
			<td>ARP30687_P050</td>
			<td>Rabbit Polyclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol Mounting Medium</td>
			<td>EMS</td>
			<td>17989-60</td>
			<td>With DAPI+DABCO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>STEMCELL</td>
			<td>7980</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH3023701</td>
			<td>Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP310-500</td>
			<td>Solid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>Open platform</td>
			<td></td>
			<td>With Fiji plugins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immuno Mount DAPI</td>
			<td>EMS</td>
			<td>17989-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KRM-II-08</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>experimental compounds not available from a commercial source</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Application Suite X</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leukemia Inhibitory Factor</td>
			<td>Novus</td>
			<td>N276314100U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M9272</td>
			<td>Hexahydrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope, Confocal</td>
			<td>Leica</td>
			<td>SP8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope, Light</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76382-982</td>
			<td>DMiL Inverted</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MTS - Promega One Step</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G3581</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-channel pipette, 0.5-10 &#181;L</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Z683914</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-channel pipette, 10-100 &#181;L</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Z683930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-channel pipette, 30-300 &#181;L</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Z683957</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nest-O-Patch</td>
			<td>Heka</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal-A Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10888022</td>
			<td>Without vitamin A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal-A Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12348-017</td>
			<td>Phenol red free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-Essential Amino Acids</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NOR-QH-II-66</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>experimental compounds not available from a commercial source</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-998-944</td>
			<td>4 inch width</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>EMS</td>
			<td>RT-15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PATHCHMASTER</td>
			<td>Heka</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfusion System</td>
			<td>Nanion</td>
			<td>4000120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PFA</td>
			<td>EMS</td>
			<td>RT-15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Bufered Saline</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AAJ75889K2</td>
			<td>Reagent grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-Lysine</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A3890401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-Lysine</td>
			<td>Sigma Life Sciences</td>
			<td>P4707</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Port-a-Patch</td>
			<td>Nanion</td>
			<td>21000072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Sigma Life Sciences</td>
			<td>P5405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary Antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>MA5-34653</td>
			<td>Rabbit Monoclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propofol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC0758676</td>
			<td>1 mL ampule</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QH-II-66</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>experimental compounds not available from a commercial source</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent Reservoirs</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89094-664</td>
			<td>Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slides, 75 x 25 mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-544-7</td>
			<td>Frosted one side</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-035-Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11360-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synth-a-Freeze Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>R00550</td>
			<td>Cryopreservation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMRE</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-196-4741</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMRE Kit</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>AB113852</td>
			<td>Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>NC0704309</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15-250-061</td>
			<td>Solution, 0.4%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin/EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200-072</td>
			<td>Solution, 0.25%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex Mixer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97043-562</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman Filter Paper</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>09-927-841</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

screening ion channels in cancer cells

תעלות יונים הן קריטיות להתפתחות התא ולשמירה על הומאוסטזיס התא. ההפרעה בתפקוד תעלת היונים תורמת להתפתחות מגוון רחב של הפרעות או תעלות. תאים סרטניים מנצלים תעלות יונים כדי להניע את התפתחותם, כמו גם כדי להשתפר כגידול ולהיטמע במיקרו-סביבה הכוללת תאים לא סרטניים שונים. יתר על כן, עלייה ברמות גורמי הגדילה וההורמונים בתוך המיקרו-סביבה של הגידול יכולה לגרום לביטוי משופר של תעלות יונים, מה שתורם להתרבות תאים סרטניים ולהישרדותם. לפיכך, מיקוד פרמקולוגי של תעלות יונים הוא גישה מבטיחה לטיפול בממאירויות מוצקות, כולל סרטן מוח ראשוני וגרורתי. להלן מתוארים פרוטוקולים לאפיון תפקודן של תעלות יונים בתאים סרטניים וגישות לניתוח מודולטורים של תעלות יונים כדי לקבוע את השפעתם על כדאיות הסרטן. אלה כוללים צביעת תא(ים) עבור תעלות יונים, בדיקת המצב המקוטב של מיטוכונדריה, ביסוס תפקוד תעלת יונים באמצעות אלקטרופיזיולוגיה, וביצוע בדיקות כדאיות כדי להעריך את עוצמת התרופה.

Membrane transport proteins are critical for communication between cells, as well as for maintaining cellular homeostasis. Amongst the membrane transport proteins, ion channels serve to drive the growth and development of cells and to maintain the state of cells in challenging and changing environments. Ion channels have also been reported to drive and support the development of solid tumors, both systemically and in the central nervous system (CNS)1,2. For example, KCa3.1 channels are responsible for regulating membrane potential and controlling cell volume, which is important in cell-cycle regulation. Defective KCa3.1 channels have been reported to contribute to the abnormal proliferation of tumor cells3. Further, ion channels may contribute to the metastatic dissemination of cancers. Transient receptor potential (TRP) channels, for example, are involved in Ca2+ and Mg2+ influx; this influx activates several kinases and heat shock proteins that function to regulate the extracellular matrix surrounding a tumor, which is, in turn, important for initiating cancer metastasis4.
Since ion channels can contribute to the development of cancers, they may also be targets for drug-related cancer treatment. For example, resistance to treatment modalities, including chemotherapy and novel immunotherapy, is related to ion channel function dysregulation5,6,7. In addition, ion channels are emerging as important drug targets to impede the growth and development of cancers, with repurposed small molecule (FDA-approved) drugs being examined, as well as biopolymers, including monoclonal antibodies1,2,8,9. While there has been much progress on this front, ion channel cancer drug discovery remains underdeveloped. This is partly due to the unique challenges of studying ion channels in cancer cells. For example, there are technical limitations in setting up electrophysiology assays for slow-acting compounds and temporal differences in channel activation and drug action. Further, the solubility of compounds can also impede progress, as most of the automated electrophysiology systems commonly in use today utilize hydrophobic substrates, which may contribute to artifacts as a result of compound adsorption. In addition, large bioorganic molecular therapeutics such as natural products, peptides, and monoclonal antibodies are technically challenging to screen using conventional electrophysiology assays10. Finally, the bioelectrical properties of cancer cells remain poorly understood11.
Meanwhile, the immunofluorescence staining of ion channels is often challenging. This is due, in part, to the complexity of their structures and their context in the membrane, which impact the ability to both generate and employ antibodies for microscopy studies. It is especially important that the antibodies used to stain ion channels are validated for specificity, affinity, and reproducibility. Commercial antibodies for ion channels should be considered based on their validation strategy and publication record. Experiments should include negative controls to demonstrate the lack of nonspecific binding by either knockdown or knockout of the target protein. Alternatively, cell lines in which the target protein is absent or in low abundance based on mRNA or protein determinations may serve as negative controls. For example, this study shows the localization of the (GABA) receptor&#160;subunit Gabra5 in a medulloblastoma cell line (D283). D283 cells with an siRNA knockdown and Daoy&#160;cells, another cerebellar medulloblastoma cell line, were stained for Gabra5 and showed no appreciatable staining (data not shown).
Here, methods are presented to analyze and assay ion channel function, as well as the effect of ion channel modulators on cancer cells. Protocols are provided for (1) staining cells for an ion channel, (2) testing the polarized state of mitochondria, (3) establishing ion channel function using electrophysiology, and (4) in vitro drug validation. These protocols emphasize studies of the type A gamma-aminobutyric acid (GABAA) receptor2,12,13,14,15,16, a chloride anion channel and major inhibitory neurotransmitter receptor. However, the methods presented here apply to studying many other cancer cells and ion channels.

מחבר זרקור: חקר תפקידן של תעלות יונים בסרטן: אפיון וגישות טיפול פוטנציאליות 

בדיקת תעלות יונים בתאים סרטניים

The function of ion channels is crucial in cell biology and significantly impacts cancer growth. Our team is focused on targeting ion channels to aid cancer treatments. The field has recently gained a greater understanding of the tumor microenvironment and how cancer cells take hold in healthy tissue, highlighting the importance of ion channels in cancer.One of the biggest challenges in current experiment is the availability of immune-competent animal model that can effectively test therapeutic treatments. We have established that GABA A receptor is a therapeutic vulnerability to disparate cancers and identified a new class of GABA A receptor activators that effectively impair cancer cells. Ion channels play a crucial role in regulating cancer cell behavior, and they hold great potential as target for cancer treatment.Our research has highlighted how an established class of drug can be employed to treat cancer effectively.

למעלה ישנם הליכים נבחרים שניתן להשתמש בהם כדי לאפיין תעלות יונים בתאים סרטניים. הפרוטוקול הראשון מדגיש את הצביעה של תעלת יונים. כפי שמפורט, ישנם אתגרים רבים בעת צביעת תעלת יונים או, לצורך העניין, כל חלבון שנמצא בקרום החוץ תאי. באיור 1 מוצגת צביעה עבור תת-יחידה של קולטן GABAA<...

Watch this Scientific Journal Video about Exploring the Role of Ion Channels in Cancer: Characterization and Potential Treatment Approaches at JoVE.com

המיקוד הפרמקולוגי של תעלות יונים הוא גישה מבטיחה לטיפול בגידולים מוצקים. פרוטוקולים מפורטים ניתנים לאפיון תפקוד תעלות היונים בתאים סרטניים ולהערכת ההשפעות של אפנון תעלות יונים על כדאיות הסרטן.

Ion channels are critical for cell development and maintaining cell homeostasis. The perturbation of ion channel function contributes to the development ...

תפקודן של תעלות היונים חיוני בביולוגיה של התא ומשפיע באופן משמעותי על צמיחת הסרטן. הצוות שלנו מתמקד במיקוד תעלות יונים כדי לסייע בטיפולים בסרטן. התחום רכש לאחרונה הבנה טובה יותר של מיקרו-סביבה של הגידול וכיצד תאים סרטניים תופסים אחיזה ברקמה בריאה, מה שמדגיש את חשיבותן של תעלות יונים בסרטן.אחד האתגרים הגדולים ביותר בניסוי הנוכחי הוא זמינותו של מודל בעלי חיים כשיר חיסון שיכול לבחון ביעילות טיפולים טיפוליים. קבענו כי קולטן GABA A הוא פגיעות טיפולית לסוגי סרטן שונים וזיהינו סוג חדש של מפעילי קולטן GABA A הפוגעים ביעילות בתאים סרטניים. תעלות יונים ממלאות תפקיד מכריע בוויסות התנהגות התאים הסרטניים, והן טומנות בחובן פוטנציאל רב כיעד לטיפול בסרטן.המחקר שלנו הדגיש כיצד ניתן להשתמש בסוג מבוסס של תרופות לטיפול יעיל בסרטן.

בדיקת תעלות יונים בתאים סרטניים

Abstract