Screening dei canali ionici nelle cellule tumorali

Summary

Il targeting farmacologico dei canali ionici è un approccio promettente per il trattamento dei tumori solidi. Vengono forniti protocolli dettagliati per caratterizzare la funzione dei canali ionici nelle cellule tumorali e dosare gli effetti dei modulatori dei canali ionici sulla vitalità del cancro.

Abstract

I canali ionici sono fondamentali per lo sviluppo cellulare e il mantenimento dell'omeostasi cellulare. La perturbazione della funzione dei canali ionici contribuisce allo sviluppo di una vasta gamma di disturbi o canalopatie. Le cellule tumorali utilizzano canali ionici per guidare il proprio sviluppo, nonché per migliorare come tumore e assimilare in un microambiente che include varie cellule non cancerose. Inoltre, l'aumento dei livelli di fattori di crescita e ormoni all'interno del microambiente tumorale può comportare una maggiore espressione dei canali ionici, che contribuisce alla proliferazione e alla sopravvivenza delle cellule tumorali. Pertanto, il targeting farmacologico dei canali ionici è potenzialmente un approccio promettente per il trattamento di tumori maligni solidi, compresi i tumori cerebrali primari e metastatici. Qui vengono descritti i protocolli per caratterizzare la funzione dei canali ionici nelle cellule cancerose e gli approcci per analizzare i modulatori dei canali ionici per determinare il loro impatto sulla vitalità del cancro. Questi includono la colorazione di una cellula (s) per un canale ionico, testare lo stato polarizzato dei mitocondri, stabilire la funzione del canale ionico usando l'elettrofisiologia ed eseguire saggi di vitalità per valutare la potenza del farmaco.

Introduction

Le proteine di trasporto della membrana sono fondamentali per la comunicazione tra le cellule e per il mantenimento dell'omeostasi cellulare. Tra le proteine di trasporto di membrana, i canali ionici servono a guidare la crescita e lo sviluppo delle cellule e a mantenere lo stato delle cellule in ambienti difficili e mutevoli. È stato anche riportato che i canali ionici guidano e supportano lo sviluppo di tumori solidi, sia a livello sistemico che nel sistema nervoso centrale (SNC)^1,2. Ad esempio, i canali KCa3.1 sono responsabili della regolazione del potenziale di membrana e del controllo del volume cellular....

Protocol

1. Immunomarcatura dei canali ionici in cellule in coltura

1. Preparazione delle celle e set-up sperimentale
   1. Mantenere le cellule come una coltura in crescita attiva in boccette di coltura da 75 cm² . Far passare le cellule una volta fino a quando non diventano confluenti al 50% -90%, a seconda del tempo di raddoppio della linea cellulare utilizzata.
      NOTA: Per il presente studio sono state utilizzate cellule D283, una linea cellulare di medulloblastoma del gruppo 3.
   2. Raccogliere le c.......

Discussion

I cambiamenti nella funzione dei canali ionici alterano le cascate di segnalazione intracellulare, che possono influire sul funzionamento complessivo di una cellula. Negli ultimi dieci anni, è diventato sempre più chiaro che i canali ionici sono importanti per la crescita e le metastasi delle cellule tumorali. È importante sottolineare che molti canali ionici sono obiettivi primari per le terapie approvate mirate a una vasta gamma di disturbi²⁴. I ricercatori hanno sondato se i canali ionici po.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
ABS SpectraMax Plate Reader	Molecular Devices	ABS
Accutase	Invitrogen	00-4555-56
Alexa Flor 488	Invitrogen	A32723	Goat Anti-Rabbit
Antibiotic-Antimycotic	Gibco	15240-062	100x
B27 Supplement	Gibco	12587-010	Lacks vitamin A
Biosafety Cabinet	LABCONCO	302381101	Class II, Type A2
Bovine Serum Albumin	Fisher Scientific	BP1606-100
CO2 Incubator	Fisher Scientific	13-998-211	Heracell VIOS 160i
Calcium Chloride	Fisher Scientific	C7902	Dihydrate
Cell Culture Dishes, 150 mm	Fisher Scientific	12-600-004	Cell culture treated
Cell Culture Flasks, 75 cm2	Fisher Scientific	430641U	Cell culture treated
Cell Culture Plates, 6 well	Fisher Scientific	353046	Cell culture treated
Cell Culture Plates, 96 well	Fisher Scientific	353072	Cell culture treated
Centrifuge	Eppendorf	EP-5804R	Refrigerated
Corning CoolCell	Fisher Scientific	07-210-0006
Coverslips, 22 x 22 mm	Fisher Scientific	12-553-450	Corning brand
D283 Med	ATCC	HTB-185
DABCO Mounting Media	EMS	17989-97
D-Glucose	Sigma Life Sciences	D9434
Dimethyl Sulfoxide	Sigma Aldrich	D2650	Cell culture grade
DMEM/F12, base media	Fisher Scientific	11330-032	With phenol red
DMEM/F12, phenol red free	Fisher Scientific	21041-025
EGTA	Sigma Aldrich	E4378
Epidermal Growth Factor	STEMCELL	78006.1
FCCP	Abcam	AB120081
Fetal Bovine Serum, Qualified	Gibco	10437-028
Fibroblast Growth Factor, Basic	Millipore	GF003
GARBA5 Antibody	Aviva	ARP30687_P050	Rabbit Polyclonal
Glutamax	Gibco	35050-061
Glycerol Mounting Medium	EMS	17989-60	With DAPI+DABCO
Hemocytometer	Millipore Sigma
Heparin	STEMCELL	7980
HEPES	HyClone	SH3023701	Solution
HEPES	Fisher Scientific	BP310-500	Solid
ImageJ	Open platform		With Fiji plugins
Immuno Mount DAPI	EMS	17989-97
KRM-II-08			experimental compounds not available from a commercial source
Leica Application Suite X	Leica Microsystems
Leukemia Inhibitory Factor	Novus	N276314100U
L-Glutamine	Gibco	25030-081
Magnesium Chloride	Sigma Aldrich	M9272	Hexahydrate
Microscope, Confocal	Leica	SP8
Microscope, Light	VWR	76382-982	DMiL Inverted
MTS - Promega One Step	Promega	G3581
Multi-channel pipette, 0.5-10 µL	Eppendorf	Z683914
Multi-channel pipette, 10-100 µL	Eppendorf	Z683930
Multi-channel pipette, 30-300 µL	Eppendorf	Z683957
Nest-O-Patch	Heka
Neurobasal-A Medium	Gibco	10888022	Without vitamin A
Neurobasal-A Medium	Gibco	12348-017	Phenol red free
Non-Essential Amino Acids	Gibco	11140-050
NOR-QH-II-66			experimental compounds not available from a commercial source
Parafilm	Fisher Scientific	50-998-944	4 inch width
Paraformaldehyde	EMS	RT-15710
PATHCHMASTER	Heka
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140-122
Perfusion System	Nanion	4000120
PFA	EMS	RT-15710
Phosphate Bufered Saline	Fisher Scientific	AAJ75889K2	Reagent grade
Poly-D-Lysine	Fisher Scientific	A3890401
Poly-L-Lysine	Sigma Life Sciences	P4707
Port-a-Patch	Nanion	21000072
Potassium Chloride	Sigma Life Sciences	P5405
Primary Antibody	Invitrogen	MA5-34653	Rabbit Monoclonal
Prism	GraphPad
Propofol	Fisher Scientific	NC0758676	1 mL ampule
QH-II-66			experimental compounds not available from a commercial source
Reagent Reservoirs	VWR	89094-664	Sterile
Slides, 75 x 25 mm	Fisher Scientific	12-544-7	Frosted one side
Sodium Bicarbonate	Corning	25-035-Cl
Sodium Chloride	Fisher Scientific	S271-3
Sodium Pyruvate	Gibco	11360-070
Synth-a-Freeze Medium	Gibco	R00550	Cryopreservation
TMRE	Fisher Scientific	50-196-4741	Reagent
TMRE Kit	Abcam	AB113852	Kit
Triton X-100	Sigma Aldrich	NC0704309
Trypan Blue	Gibco	15-250-061	Solution, 0.4%
Trypsin/EDTA	Gibco	25200-072	Solution, 0.25%
Vortex Mixer	VWR	97043-562
Whatman Filter Paper	Fisher Scientific	09-927-841