作者感谢凯瑟琳·菲尔波·洛佩兹（Katherine Filpo Lopez）的专家技术援助。这项工作得到了美国国立卫生研究院（NIH）（GM122589和AG051047）对LP的资助。
这些研究使用了哥伦比亚大学赫伯特欧文综合癌症中心的共聚焦和专业显微镜共享资源，部分资金来自NIH/NCI癌症中心支持资助P30CA013696。

使用 mtHyper7 对活酵母细胞中的线粒体过氧化物进行成像

作者声明他们没有利益冲突。

在该协议中，描述了一种使用mtHyPer7作为生物传感器来评估活出芽酵母细胞中的线粒体H2 O2的方法。该生物传感器使用基于CRISPR的方法构建，并在不使用可选标记的情况下引入酵母基因组中的保守无基因区域。与质粒携带的生物传感器相比，集成的生物传感器在所有细胞中以一致的水平表达，从而提供更可靠的定量结果。没有选择的标记用于生成表达mtHyPer7的细胞，这允许使用更广泛的菌株背景，并促进生物传感器表达细胞的基因修饰。mtHyPer7 蛋白正确靶向线粒体，对线粒体形态、功能、分布或细胞生长速率没有明显影响。mtHyPer7 对外部添加的 H 2 O2 表现出剂量依赖性反应。此外，mtHyPer7 能够报告线粒体质量的异质性，并具有亚细胞分辨率。最后，与宽视场显微镜相比，使用转盘共聚焦显微镜对线粒体靶向生物传感器进行成像，可以减少对荧光团的光漂白，并生成用于分析亚细胞差异的高分辨率图像。
局限性和替代方法 这种方法不适用于超过10分钟的细胞成像，因为细胞会在盖玻片下变干。对于长期成像，最好使用琼脂垫方法46 或将细胞固定在充满SC培养基的玻璃底培养皿中。
生物传感器的选择应以实验条件下靶标的浓度为指导。如果 HyPer7 的灵敏度过高，建议使用其他 HyPer 版本，例如 HyPer3 或 HyPerRed47,48。但是，应该注意的是，其他HyPer探头对pH值更敏感。为了获得更高的灵敏度，基于过氧化物还蛋白的 roGFP 可能更合适 （roGFP2Tsa2ΔCR）27。
H 2 O2传感器的氧化稳态与氧化速率和还原速率有关。生物传感器的氧化速率主要由H 2 O2引起，但还原速率取决于细胞和细胞器中活跃的抗氧化还原系统。研究表明，HyPer7 在酵母胞质溶胶中主要被硫氧还蛋白系统还原，其还原速度快于 roGFP2Tsa2ΔCR27。因此，在解释 H 2 O2 生物传感器的测量值时，应考虑探针的不同还原机制和响应动力学。特别是，为了从生物传感器读数推断出 H 2 O2水平，必须假设还原系统在实验过程中保持恒定容量。作为这里描述的脚本的替代方法，已经免费提供了各种其它软件用于分析氧化还原传感器49。
关键步骤 对于任何生物传感器，证明生物传感器本身不会影响被测量的过程至关重要。因此，比较菌株在每种实验条件下的生长和线粒体形态是很重要的。在这里，使用MitoTracker Red评估线粒体形态，MitoTracker Red以膜电位依赖性方式染色线粒体。然而，未转化细胞和生物传感器转化细胞中线粒体的比较可以通过用四甲基罗丹明甲酯 （TMRM）（一种替代膜电位感应线粒体生命染料）或 MitoTracker Green 染色来完成，后者对线粒体进行染色，而线粒体不受膜电位的影响。如果怀疑有害影响，降低表达水平或改变整合位点可能会有所帮助。
验证探头的剂量反应行为和成像技术的信噪比对于收集可靠的结果也至关重要。如果组内的变异性超过组之间的变异性，则难以检测差异。组内变异性可能是由真实的种群变异引起的，也可能是由检测过程中的噪声引起的。提高信噪比的关键步骤是图像采集（像素值范围和噪声）、背景减法和阈值。
在计算步骤中也可以减少噪声影响。最直接的方法是根据图像测量值（Results.csv）计算加权平均强度，其中每个像素表示激发效率之间的局部比率。这会产生“像素”比率。但是，如果图像信号噪声比较低，则可以通过计算分子和分母通道中ROI的加权平均强度，然后计算这两个加权平均值之间的比率（“区域”比率）来获得更可靠的结果。
要选择阈值方法，斐济命令 Image |调整 |自动阈值可用于自动 尝试所有内置的斐济方法。要评估分割（阈值），通过单击 “编辑”|”甄选 |创建选区，添加到 ROI 管理器（按 T），然后在原始图像文件上激活。如果线粒体未被充分检测到，应尝试不同的分割方法。
在比较图像时，必须以相同的成像条件采集所有图像，并以相同的对比度增强显示所有图像。
优化成像条件时，必须考虑线粒体运动。如果线粒体在 405 和 488 nm 的激发之间显着移动，则比率图像将不准确。建议将曝光时间保持在 500 毫秒<，并通过最快的方法（例如触发脉冲或声光可调谐滤波器）改变激励。捕获 Z 堆栈时，在移动到下一个 Z 步骤之前，应对每个 Z 步骤执行两次激励。
为了显示结果，色调（颜色）的变化对人眼来说比强度的变化更明显。因此，比率值被转换为色标，以便于视觉解释。彩色图像可以是未调制的，其中所有线粒体像素都以相同的亮度出现，也可以是强度调制的，其中原始图像中的像素强度用于设置彩色图像中的强度。
修改和故障排除 除了使用百草枯激发试验来确认线粒体功能外，还可以将细胞复制接种或接种到可发酵和不可发酵的碳源中。
对于背景减法，滚动球减法（通过导航到 “处理”|”减去背景...）也可用于消除照明不均匀性。应确保单元格的存在不会改变被减去的背景（通过选中 “创建背景 ”选项并检查结果）。
总之，mtHyPer7探针提供了一种一致的微创方法来关联活细胞中酵母线粒体的形态和功能状态，并允许在遗传易处理、易于访问的模型系统中研究重要的细胞应激源和信号分子。

线粒体是必不可少的真核细胞器，以其通过氧化磷酸化和电子传递产生 ATP 的功能而闻名1。此外，线粒体是钙储存、脂质、氨基酸、脂肪酸和铁硫簇的合成以及信号转导的场所 2,3。在细胞内，线粒体形成一个具有特征形态和分布的动态网络，该网络根据细胞类型和代谢状态而变化。此外，尽管线粒体可以融合和分裂，但并非细胞中的所有线粒体都是等效的。大量研究记录了单个细胞内线粒体在膜电位和氧化态等属性方面的功能异质性 4,5,6。线粒体功能的这种变化部分是由于 mtDNA 突变对细胞器的损害（其发生率高于核 DNA）以及细胞器内外产生的活性氧 （ROS） 的氧化损伤 7,8,9。线粒体质量控制机制可修复损伤或消除损伤无法修复的线粒体，从而减轻对细胞器的损伤10。
过氧化氢 （H 2O2） 是一种活性氧，是细胞蛋白质、核酸和脂质氧化损伤的来源。然而，H2 O2 也是一种信号分子，通过靶蛋白中硫醇的可逆氧化来调节细胞活性11,12。H2 O2 由从线粒体电子传递链泄漏的电子和特定酶产生，例如 NADPH 氧化酶和单胺氧化酶 13、14、15、16、17、18、19、20。它还被抗氧化系统灭活，包括基于硫氧还蛋白和谷胱甘肽21、22、23 的抗氧化系统。因此，线粒体 H 2 O2水平的分析对于了解该代谢物在线粒体和细胞正常功能以及氧化应激条件下的作用至关重要。
该协议的总体目标是使用靶向细胞器（mtHyPer7）的遗传编码比率H 2 O 2生物传感器HyPer7检测线粒体H2O2。mtHyPer7 是一种嵌合体，由来自 ATP9 的线粒体信号序列（Su9 前序列）、绿色荧光蛋白 （GFP） 的环状置换形式和来自脑膜炎奈瑟菌24 的 OxyR 蛋白的 H 2 O2结合域组成（图 1）。在圆形置换 GFP 中，天然 GFP 的 N 端和 C 端融合，并在发色团附近形成新的末端，与天然 GFP25 相比，这赋予蛋白质更大的迁移率和更大的光谱特性的不稳定性。mtHyPer7 的 OxyR 结构域与 H 2 O 2 的相互作用是高亲和力的，H 2 O 2选择性，并导致保守的半胱氨酸残基的可逆氧化和二硫键的形成。与 OxyR 氧化相关的构象变化转移到 mtHyPer7 中的圆形置换 GFP，这导致 mtHyPer7 发色团的最大激发波长从还原态的 405 nm 到 H 2 O2-氧化态的 488 nm26。因此，mtHyPer7 响应 488 nm 与 405 nm 激发的荧光比反映了探针被 H 2 O2氧化。
理想情况下，生物传感器应提供其目标分子的实时、绝对、定量读数。然而，不幸的是，这在实际测量中并不总是可行的。对于氧化传感器，如mtHyPer7，实时读数受二硫键还原速率的影响。ROS生物传感器使用的还原系统不同，它们可以显着改变探针响应动态 - 如被硫氧还蛋白系统还原的HyPer7和被酵母胞质溶胶中的谷胱甘肽还原的roGFP2-Tsa2ΔCR的比较所示27。因此，要从 mtHyPer7 比率得出关于相对 H 2 O2浓度的结论，必须假设还原系统在实验过程中保持恒定的容量。尽管有这些考虑，HyPer7 和相关探针已在各种情况下用于获取有关活细胞中 H 2 O2 的信息25,28,29。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65428/65428fig01.jpg"> 图 1：H 2 O2生物传感器 mtHyPer7 的设计、分子机制和激发/发射光谱。 （A） mtHyPer7 探针是通过将环状置换的 GFP 插入脑膜炎奈瑟菌的 OxyR-RD 结构域而获得的。它包含来自 Neurospora crassa （Su9） 的 ATP 合酶亚基 9 的线粒体靶向序列。 （B） mtHyPer7 的 H 2 O2 感应机制图示。RD结构域中半胱氨酸的氧化增加了488 nm激发时的荧光发射，并减少了405 nm激发产生的发射。（C） HyPer7氧化和还原形式的激发和发射光谱。本图经 Pak et al.24 许可转载。缩写：GFP=绿色荧光蛋白;cpGFP = 循环置换 GFP。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65428/65428fig01large.jpg" target="_blank">请点击这里查看此图的较大版本.</a>
mtHyPer7 的这种比例成像为线粒体 H 2 O2 定量提供了重要益处24,27;它为探针浓度提供内部控制。此外，即使在H 2 O2的饱和浓度下，H 2 O2暴露产生的激发峰的偏移也不完全。因此，比率成像可以通过在分析中加入两个光谱点来提高灵敏度。
这里使用的mtHyPer7探针对H 2 O2具有非常高的亲和力，对pH24的敏感性相对较低，并已成功靶向秀丽隐杆线虫线粒体30。这种蛋白质也已用于酵母27,31。然而，以前的研究依赖于 mtHyPer7 的质粒表达，这导致探针表达的细胞间变异性27。此外，使用基于CRISPR的无标记整合方法将该协议中描述的构建体整合到X32染色体上保守的无基因区域中。整合的生物传感器基因的表达也受强组成型TEF1启动子的控制（图2）。因此，与使用质粒携带的生物传感器表达观察到的生物传感器在酵母细胞群中的表达更稳定、更一致，并且携带生物传感器的细胞可以在不需要选择性培养基的情况下繁殖。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65428/65428fig02.jpg"> 图 2：通过 CRISPR 生成表达 mtHyPer7 的细胞。 通过醋酸锂转化将含有 Cas9 和 sgRNA 的质粒 （YN2_1_LT58_X2site） 和 PCR 扩增的含有 mtHyPer7 的生物传感器构建体引入出芽酵母细胞中。X染色体（X2）上的无基因插入位点被Cas9蛋白与sgRNA识别切割，生物传感器通过同源重组整合到基因组中。在通过显微镜筛选、菌落PCR和测序鉴定成功的转化体后，通过在非选择性培养基中生长去除（固化）Cas9质粒。缩写：sgRNA = 单向导 RNA;TEF = 转录增强因子。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65428/65428fig02large.jpg" target="_blank">请点击这里查看此图的较大版本.</a>
最后，mtHyPer7 与其他 ROS 生物传感器相比具有优势。例如，用于检测 ROS 的有机染料（例如二氢乙锭 [DHE]2 和 MitoSOX3）会产生不均匀或非特异性染色，并且通常在乙醇或二甲基亚砜等溶剂中递送，这需要额外的溶剂效应控制。另一类 ROS 生物传感器是基于荧光共振能量转移 （FRET） 的生物传感器（例如，用于细胞氧化还原态4 的 Redoxfluor，以及过氧化物传感器 HSP-FRET5、OxyFRET 6 和 PerFRET6）。这些探针是基因编码的，原则上是高度敏感的，可以使用表征良好的线粒体信号序列定量靶向线粒体。然而，使用基于 FRET 的探针存在挑战，包括交叉激发和渗漏导致的背景，以及对发生 FRET 的荧光基团的接近度和方向的严格要求33,34。此外，FRET探针由两种荧光蛋白组成，与光谱偏移探针相比，它们需要更大的构建体才能在目标细胞中表达。这里描述的方案是为了利用基于HyPer7的生物传感器的优势而开发的，并使用这种紧凑的、比例的、高亲和力的、遗传编码的探针对活酵母中线粒体中的过氧化物进行定量成像。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100x/1.45 Plan Apo Lambda objective lens</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MRD01905</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenine sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#A9126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Agar</td>
			<td>BD Difco</td>
			<td>#DF0145170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Peptone</td>
			<td>BD Difco</td>
			<td>#DF0118170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Tryptone</td>
			<td>BD Difco</td>
			<td>#DF211705</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Yeast Extract</td>
			<td>BD Difco</td>
			<td>#DF0127179</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BamHI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0136S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BglII</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0144S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbenicilin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carl Zeiss Immersol Immersion Oil</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>444960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextrose (D-(+)-Glucose)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. cloni 10G chemical competent cell</td>
			<td>Bioserch Technologies</td>
			<td>60108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIJI</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td>Schindelin et al 2012</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G418 (Geneticin)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A1720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP emission filter</td>
			<td>Chroma</td>
			<td></td>
			<td>525/50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibson assembly</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E2611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphpad Prism 7</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td></td>
			<td>https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H2O2 (stable)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H1009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HO-pGPD-mito-roGFP-KanMX6-HO</td>
			<td>Pon Lab</td>
			<td>JYE057/EP41</td>
			<td>Liao et al 20201</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator Shaker</td>
			<td>New Brunswick Scientific</td>
			<td>E24</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KAPA HiFi PCR kit</td>
			<td>Roche Sequencing and Life Science, Kapa Biosystems, Wilmington, MA</td>
			<td>KK1006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-arginine hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#A8094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>laser</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>405 and 488 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-histidine hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#H5659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-leucine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#L8912</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-lysine hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#L8662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-methionine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#M9625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-phenylalanine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#P5482</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-tryptophan</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#T8941</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-tyrosine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#T8566</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mHyPer7 plasmid</td>
			<td>This study</td>
			<td>JYE116</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope coverslips</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>3406</td>
			<td>#1.5 (170 &#181;m thickness)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>3050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MitoTracker Red CM-H2Xros</td>
			<td>ThermoFisherScientific</td>
			<td>M7513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBuilder HiFi Assembly Master Mix</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E2621</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Elements</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Microscope acquisition software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Ti Eclipse inverted microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraquat (Methyl viologen dichloride hydrate)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat. #856177&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RStudio</td>
			<td>Posit.co</td>
			<td>Free desktop version</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>BU530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stagetop incubator</td>
			<td>Tokai Hit</td>
			<td>INU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uracil</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#U1128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast nitrogen base (YNB) containing ammonium sulfate without amino acids</td>
			<td>BD Difco</td>
			<td>#DF0919073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>YN2_1_LT58_X2site</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>177705</td>
			<td>Pianale et al 2021</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zyla 4.2 sCMOS camera</td>
			<td>Andor</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging of mthyper7, a ratiometric biosensor for mitochondrial peroxide, in living yeast cells

线粒体功能障碍或功能改变存在于许多疾病和病症中，包括神经退行性疾病和肌肉骨骼疾病、癌症和正常衰老。在这里，描述了一种使用基因编码的微创比例生物传感器以细胞和亚细胞分辨率评估活酵母细胞中线粒体功能的方法。生物传感器，线粒体靶向HyPer7（mtHyPer7），检测线粒体中的过氧化氢（H 2O2）。它由融合到环状置换荧光蛋白的线粒体信号序列和细菌 OxyR 蛋白的 H 2 O2 响应结构域组成。该生物传感器使用无 CRISPR-Cas9 标记系统生成并整合到酵母基因组中，与质粒携带的构建体相比，表达更加一致。
mtHyPer7 定量靶向线粒体，对酵母生长速率或线粒体形态没有可检测的影响，并在正常生长条件下和暴露于氧化应激时提供线粒体 H 2 O2 的定量读数。该协议解释了如何使用转盘共聚焦显微镜系统优化成像条件，并使用免费提供的软件进行定量分析。这些工具可以收集细胞内和细胞群中细胞间线粒体的丰富时空信息。此外，这里描述的工作流程可用于验证其他生物传感器。

Mitochondria are essential eukaryotic cellular organelles that are well known for their function in producing ATP through oxidative phosphorylation and electron transport1. In addition, mitochondria are sites for calcium storage, the synthesis of lipids, amino acids, fatty acid and iron-sulfur clusters, and signal transduction2,3. Within cells, mitochondria form a dynamic network with characteristic morphology and distribution, which varies according to cell type and metabolic state. Furthermore, although mitochondria can fuse and divide, not all the mitochondria in a cell are equivalent. Numerous studies have documented the functional heterogeneity of mitochondria within individual cells in attributes such as membrane potential and oxidative state4,5,6. This variation in mitochondrial function is due in part to damage to the organelle from mtDNA mutations (which occur at a higher rate than in nuclear DNA) and to oxidative damage by reactive oxygen species (ROS) generated both within and outside the organelle7,8,9. Damage to the organelle is mitigated by mitochondrial quality control mechanisms that repair the damage or eliminate mitochondria that are damaged beyond repair10.
Hydrogen peroxide (H2O2) is a reactive oxygen species that is a source of oxidative damage to cellular proteins, nucleic acids, and lipids. However, H2O2 also serves as a signaling molecule that regulates cellular activities through the reversible oxidation of thiols in target proteins11,12. H2O2 is produced from electrons that leak from the mitochondrial electron transport chain and by specific enzymes, such as NADPH oxidase and monoamine oxidases13,14,15,16,17,18,19,20. It is also inactivated by antioxidant systems, including those based on thioredoxin and glutathione21,22,23. Thus, analysis of mitochondrial H2O2 levels is critical for understanding the role of this metabolite in normal mitochondrial and cellular function and under conditions of oxidative stress.
The overall goal of this protocol is to detect mitochondrial H2O2 using a genetically encoded ratiometric H2O2 biosensor, HyPer7, that is targeted to the organelle (mtHyPer7). mtHyPer7 is a chimera consisting of the mitochondrial signal sequence from ATP9 (the Su9 presequence), a circularly permuted form of green fluorescent protein (GFP), and the H2O2-binding domain of the OxyR protein from Neisseria meningitidis24 (Figure 1). In circularly permuted GFP, the N- and C-termini of native GFP are fused and new termini are formed near the chromophore, which impart greater mobility to the protein and greater lability of its spectral characteristics compared to native GFP25. The interaction of mtHyPer7&#39;s OxyR domain with H2O2 is high-affinity, H2O2-selective, and leads to reversible oxidation of the conserved cysteine residues and disulfide bridge formation. Conformational changes associated with the oxidation of OxyR are transferred to the circularly permuted GFP in mtHyPer7, which results in a spectral shift in the excitation maximum of the mtHyPer7 chromophore from 405 nm in the reduced state to&#160;488 nm in the H2O2-oxidized state26. Thus, the ratio of fluorescence from mtHyPer7 in response to excitation at 488 nm versus 405 nm reflects the oxidation of the probe by H2O2.
Ideally, a biosensor should provide a real-time, absolute, quantitative readout of its target molecule. Unfortunately, however, this is not always possible in real-world measurements. In the case of oxidation sensors, such as mtHyPer7, the real-time readout is affected by the rate of reduction of the disulfide bridge. The reduction systems used by ROS biosensors differ, and these can dramatically alter probe response dynamics-as shown by the comparison of HyPer7, reduced by the thioredoxin system, and roGFP2-Tsa2&#916;CR, reduced by glutathione-in yeast cytosol27. Thus, to draw a conclusion about the relative H2O2 concentration from mtHyPer7 ratios, one must assume that the reduction system maintains a constant capacity during the experiment. Notwithstanding these considerations, HyPer7 and related probes have been used in various contexts to obtain information about H2O2 in living cells25,28,29.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65428/65428fig01.jpg" /> 
Figure 1: Design, molecular mechanism, and excitation/emission spectra of the H2O2 biosensor mtHyPer7. (A) The mtHyPer7 probe is derived by inserting circularly permuted GFP into the OxyR-RD domain from Neisseria meningitidis. It contains the mitochondrial targeting sequence from subunit 9 of the ATP synthase from Neurospora crassa (Su9). (B) Illustration of the H2O2-sensing mechanism of mtHyPer7. Oxidation of cysteines in the RD domain increases fluorescence emission upon excitation at 488 nm and decreases emission produced by excitation at 405 nm. (C) Excitation and emission spectra of HyPer7 in oxidized and reduced forms. This figure is reprinted with permission from Pak et al.24. Abbreviations: GFP = green fluorescent protein; cpGFP = circularly permuted GFP. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65428/65428fig01large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
This ratiometric imaging of mtHyPer7 offers important benefits for mitochondrial H2O2 quantitation24,27; it provides an internal control for probe concentration. In addition, the shift in excitation peak produced by H2O2 exposure is not complete, even in saturating concentrations of H2O2. Thus, ratio imaging can increase the sensitivity by incorporating two spectral points in the analysis.
The mtHyPer7 probe used here has a very high affinity for H2O2 and relatively low sensitivity to pH24, and has been successfully targeted to Caenorhabditis elegans mitochondria30. This protein has also been used in yeast27,31. However, previous studies relied on plasmid-borne expression of mtHyPer7, which results in cell-to-cell variability in probe expression27. In addition, the construct described in this protocol was integrated into a conserved, gene-free region on chromosome X32 using a CRISPR-based approach for marker-free integration. Expression of the integrated biosensor gene is also controlled by the strong constitutive TEF1 promoter (Figure 2). As a result, there is more stable, consistent expression of the biosensor in yeast cell populations compared to that observed using plasmid-borne biosensor expression, and cells bearing the biosensor can be propagated without the need for selective media.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65428/65428fig02.jpg" /> 
Figure 2: Generation of mtHyPer7-expressing cells by CRISPR. The Cas9 and sgRNA-containing plasmid (YN2_1_LT58_X2site) and PCR-amplified mtHyPer7-containing biosensor construct are introduced into budding yeast cells by lithium acetate transformation. The gene-free insertion site on chromosome X (X2) is recognized and cut by Cas9 protein with the sgRNA, and the biosensor is integrated into the genome by homologous recombination. After identification of the successful transformants by microscopic screening, colony PCR, and sequencing, the Cas9 plasmid is removed (cured) by growth in non-selective media. Abbreviations: sgRNA = single guide RNA; TEF = transcription enhancer factor. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65428/65428fig02large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
Finally, mtHyPer7 offers advantages over other ROS biosensors. For example, organic dyes used to detect ROS (e.g., dihydroethidium [DHE]2 and MitoSOX3) can produce uneven or nonspecific staining and are often delivered in solvents such as ethanol or dimethyl sulfoxide, which require additional controls for solvent effects. Another class of ROS biosensors are fluorescence resonance energy transfer (FRET)-based biosensors (e.g., Redoxfluor for cellular redox state4, and the peroxide sensors HSP-FRET5, OxyFRET6, and PerFRET6). These probes are genetically encoded and highly sensitive in principle and can be quantitatively targeted to mitochondria using well-characterized mitochondrial signal sequences. However, there are challenges in the use of FRET-based probes, including background due to cross-excitation and bleed-through, and stringent requirements for the proximity and orientation of the fluorophores for FRET to occur33,34. In addition, FRET probes consist of two fluorescent proteins that require larger constructs for expression in cells of interest compared to spectra-shifting probes. The protocol described here was developed to take advantage of the strengths of the HyPer7-based biosensor, and to use this compact, ratiometric, high-affinity, genetically encoded probe for quantitative imaging of peroxide in mitochondria in living yeast.

作者聚焦：推进线粒体研究 - 用于亚细胞分析的 mtHyper7 生物传感器 

mtHyPer7（一种用于线粒体过氧化物的比例生物传感器）在活酵母细胞中的成像

Mitochondria are organelles within cells that facilitate energy mobilization, central metabolism, production of vital macromolecules, calcium storage, and signal transduction. As a result, they play a crucial role in cellular function, fitness, and lifespan control. Our research focuses on investigating the impact of mitochondria on aging using the budding yeast Saccharomyces cerevisiae as a model organism.Live cell imaging is our best tool to observe variation in mitochondrial function. Here we describe a method that utilizes a genetically encoded ratio metric spectral shifting biosensor called mitochondrial HyPer7. mtHyPer7 detects hydrogen peroxide, a reactive oxygen species, that can damage cellular constituents, but also functions as a signaling molecule in mitochondria of live cells.mtHyPer7 has a high affinity for hydrogen peroxide and low sensitivity to pH. It is integrated into the yeast genome, which results in stable and consistent expression in yeast cell populations. Finally, it is quantitatively targeted to mitochondria and has no detectable effect on cellular or mitochondrial function or fitness.Biosensors like mtHyPer7 are critical for studying mitochondrial function at subcellular resolution, for finding mechanisms underlying mitochondrial quality control, and for examining how that process affects cell fitness, feed, and lifespan. The mtHyPer7 stain provides consistent laboring in contrast to organic dyes utilized for reactive oxygen species detection. Compared to FRET-based sensors, mtHyPer7 is more compact and avoids issues such as cross-excitation and bleed through, as well as the precise positioning and the orientation requirements for FRET.

为了确认 mtHyPer7 是评估线粒体 H 2 O2 的合适探针，评估了 mtHyPer7 的定位及其对酵母线粒体和细胞健康的影响。为了评估 mtHyPer7 的靶向性，在表达 mtHyPer7 的对照酵母细胞和酵母中，用重要的线粒体特异性染料 MitoTracker Red 对线粒体进行染色。使用 MitoTracker Red 染色，线粒体被解析为沿母芽轴排列的长管状结构，并积聚在芽的尖端和芽远端的母细胞尖端41。对照细胞和表达mtHyPer7的细胞的线粒体形态相似。此外，mtHyPer7 与 MitoTracker 红色染色的线粒体共定位（图 3A）。因此，mtHyPer7 有效和定量地靶向线粒体，而不影响正常的线粒体形态或分布。
接下来，进行了额外的验证实验，以评估mtHyPer7对线粒体细胞适应性和氧化应激敏感性的影响。在富集或合成葡萄糖基培养基（分别为YPD或SC）中表达mtHyPer7的细胞的生长速率与未转化的野生型细胞的生长速率相似（图3B，D）。为了评估对线粒体氧化应激的可能影响，对照酵母和表达 mtHyPer7 的酵母采用低浓度百草枯处理，百草枯是一种具有氧化还原活性的小分子，在线粒体中积累，导致细胞器中的超氧化物水平升高24,27。如果 mtHyPer7 的表达诱导线粒体中的氧化应激或保护线粒体免受氧化应激，则表达 mtHyPer7 的细胞对百草枯处理的敏感性应分别增加或降低。使用低浓度百草枯处理可降低酵母菌的生长速度。此外，在百草枯存在下，野生型细胞和表达 mtHyPer7 的细胞的生长速率相似（图 3C、E）。因此，生物传感器的表达不会在出芽酵母细胞中产生显着的细胞应激，也不会改变酵母对线粒体氧化应激的敏感性。
鉴于mtHyPer7适用于研究出芽酵母中的线粒体H 2 O 2，测试了mtHyPer7是否能检测对数中期野生型酵母中的线粒体H 2 O 2和外加H 2 O 2诱导的线粒体H 2 O 2的变化。进行H2 O2滴定实验，测量线粒体中平均氧化：还原（O/R）mtHyPer7比值。
自动分析脚本生成了多个输出文件。
比率图像（ratio.tif）：由背景校正的阈值488 nm和405 nm堆栈的比率组成的Z堆栈。此堆栈可以在斐济查看，无需额外处理;但是，建议在查看之前按照协议步骤 4.3 或 5.6 中的描述增强对比度和/或对图像进行着色。
掩模图像（mask.tif）：由用于分析的阈值线粒体区域组成的Z堆栈。此图像必须用于评估阈值的准确性。
用于分析的 ROI （ROIs.zip）：在斐济打开此文件时，与源图像一起打开时，ROI 将叠加在图像上，以交叉引用结果表和源图像。每个 ROI 都使用单元格编号和 ROI 编号重命名。
测量表（NumResults.csv、DenomResults.csv、Results.csv）分别包含分子、分母和比率图像中每个切片的阈值线粒体的面积、平均值和积分密度。在线粒体缺失或失焦的切片中，记录NaN。
日志文件 （Log.txt），记录用于背景和噪声校正、阈值和比率计算的选项。
mtHyPer7 的 O/R 比显示出对 H 2 O 2 浓度的剂量依赖性反应，在 1-2 mM 外部添加 H 2 O 2 时达到平台期（图 7）。令人惊讶的是，暴露于0.1mM H 2 O2的细胞中的HyPer7比率低于对照细胞，尽管这种差异没有统计学意义。对这种现象的一种解释可能是激素反应，其中暴露于低水平的压力源可能会诱发应激反应，例如抗氧化机制，这反过来又降低了探针可检测到的ROS量。相反，较高水平的压力源可能会压倒内部应力反应，并导致 HyPer7 的读数更高。
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65428/65428fig07.jpg"> 图 7：mtHyPer7 对外部添加的 H 2 O 2 的响应。 （A） 405 nm 和 488 nm 激发图像的最大投影以及暴露于不同浓度 H 2 O 2 的中期对数期细胞中 mtHyPer7 比例图像的平均强度投影。伪彩表示氧化：还原的 mtHyPer7 比率（底部刻度）。比例尺 = 1 μm。单元格轮廓以白色显示;n >每种条件下 100 个细胞。（B） 用不同浓度的 H 2 O2处理的出芽酵母细胞中 mtHyPer7 氧化：还原比例的定量。图中显示了五个独立试验的手段，每个试验都有不同形状和颜色的符号。氧化：还原mtHyPer7比率的平均值±SEM：1.794±0.07627（未处理），1.357±0.03295（0.1mM），2.571±0.3186（0.5mM），6.693±0.5194（1mM），7.017±0.1197（2mM）。p < 0.0001（Tukey 多重比较检验的单因素方差分析）。 p 值表示为：****p < 0.0001。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65428/65428fig07large.jpg" target="_blank">请点击这里查看此图的较大版本.</a>
最后，先前的研究表明，更健康的线粒体，其还原度更高，含有更少的超氧化物，优先由酵母子细胞遗传 4，并且胞质过氧化氢酶被转运到酵母子细胞中并在酵母子细胞中激活42,43,44,45。这些研究记录了酵母细胞分裂过程中线粒体的不对称遗传，以及这一过程在子细胞健康和寿命中的作用，以及母女年龄不对称。为了测试母细胞和芽之间是否存在 H 2 O2的差异，在芽和母细胞中测量了 mtHyPer7。在酵母细胞内观察到线粒体 H 2 O 2 的差异，与母细胞中的线粒体相比，在芽中的线粒体中检测到 H 2 O 2 生物传感器读数的细微但具有统计学意义的降低（图 8）。这些发现与先前的研究结果一致，即芽中的线粒体可以更好地保护线粒体免受氧化应激的影响。他们还提供了 mtHyPer7 可以为出芽酵母中具有细胞和亚细胞分辨率的线粒体H 2 O2 提供定量读数的文件。
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65428/65428fig08.jpg"> 图 8：子细胞中的线粒体 H2 O2 水平较低。 （A） mtHyPer7 在代表性细胞中的比率图像的最大投影。伪彩表示氧化：还原的 mtHyPer7 比率（底部刻度）。该比率的亚细胞差异很明显（箭头）。比例尺 = 1 μm。单元格轮廓：白色。（B） 芽细胞和母细胞中 mtHyPer7 比率之间的差异。对于每个单独的细胞，从芽比值中减去母比值并绘制为一个点。n = 193 个细胞，这些细胞来自五个独立实验，每个实验都用不同颜色的符号显示。芽细胞和母细胞中mtHyPer7比率之间差异的平均±SEM：-0.04297±0.01266。p = 0.0008 （配对 t 检验） <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65428/65428fig08large.jpg" target="_blank">请点击这里查看此图的较大版本.</a>
补充表 S1：本研究中使用的菌株。 使用的酵母菌株列表。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65428/65428_Supplemental%20Table%201%20Strains%20used%20in%20this%20study-R2.xls" target="_blank">请点击这里下载此文件。</a>
补充表S2：本研究中使用的质粒。 使用的质粒列表。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65428/Supplemental%20Table%202%20Plasmids%20used%20in%20this%20study-R2.xls" target="_blank">请点击这里下载此文件。</a>
补充表 S3：本研究中使用的引物。 使用的引物列表。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65428/65428_Supplemental%20Table%203%20Primers%20used%20in%20this%20study-R2.xls" target="_blank">请点击这里下载此文件。</a>
补充文件1：生物传感器质粒构建方案。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65428/65428_Yang%20et%20al%20Supp%20Protocol%202023.docx" target="_blank">请点击这里下载此文件。</a>
补充文件 2：用于自动分析的脚本。 对于每个脚本，都提供了示例输入文件和输出文件。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65428/biosensor-supplemental-coding-files.zip" target="_blank">请点击这里下载此文件。</a>

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过氧化氢 （H 2O2） 既是氧化损伤的来源，也是信号分子。该协议描述了如何使用线粒体靶向HyPer7（mtHyPer7），一种遗传编码的比率生物传感器，在活酵母中测量线粒体H 2 O2。它详细介绍了如何使用免费软件优化成像条件并执行定量细胞和亚细胞分析。

Mitochondrial dysfunction, or functional alteration, is found in many diseases and conditions, including neurodegenerative and musculoskeletal disorders, ...

线粒体是细胞内的细胞器，可促进能量动员、中枢代谢、重要大分子的产生、钙储存和信号转导。因此，它们在细胞功能、健康和寿命控制中起着至关重要的作用。我们的研究重点是使用出芽酵母酿酒酵母作为模式生物来研究线粒体对衰老的影响。活细胞成像是我们观察线粒体功能变化的最佳工具。在这里，我们描述了一种利用称为线粒体HyPer7的遗传编码比率度量光谱位移生物传感器的方法。mtHyPer7 可检测过氧化氢（一种活性氧），可破坏细胞成分，但也可作为活细胞线粒体中的信号分子发挥作用。mtHyPer7 对过氧化氢具有高亲和力，对 pH 值的敏感性低。它被整合到酵母基因组中，从而在酵母细胞群中产生稳定和一致的表达。最后，它定量靶向线粒体，对细胞或线粒体功能或健康没有可检测的影响。像mtHyPer7这样的生物传感器对于研究亚细胞分辨率的线粒体功能、寻找线粒体质量控制的机制以及研究该过程如何影响细胞适应性、进料和寿命至关重要。与用于活性氧检测的有机染料相比，mtHyPer7 染色剂提供了一致的工作效果。与基于 FRET 的传感器相比，mtHyPer7 更紧凑，避免了交叉激励和渗漏等问题，也避免了 FRET 的精确定位和方向要求。

mtHyPer7（一种用于线粒体过氧化物的比例生物传感器）在活酵母细胞中的成像

Abstract