Forfatterne takker Katherine Filpo Lopez for ekspert teknisk assistance. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra National Institutes of Health (NIH) (GM122589 og AG051047) til LP.
Disse undersøgelser brugte den konfokale og specialiserede mikroskopi delte ressource fra Herbert Irving Comprehensive Cancer Center ved Columbia University, delvist finansieret gennem NIH / NCI Cancer Center Support Grant P30CA013696.

Billeddannelse af mitokondrieperoxid i levende gærceller ved hjælp af mtHyper7

Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen interessekonflikter.

I denne protokol beskrives en metode til anvendelse af mtHyPer7 som biosensor til vurdering af mitokondrielH2O2i levende spirende gærceller. Biosensoren konstrueres ved hjælp af en CRISPR-baseret metode og indføres i en bevaret genfri region i gærgenomet uden brug af valgbare markører. Sammenlignet med plasmidbårne biosensorer udtrykkes integrerede sensorer i alle celler og på ensartede niveauer, hvilket giver mere pålidelige kvantificeringsresultater. Der anvendes ingen valgbare markører til at generere mtHyPer7-ekspressive celler, hvilket giver mulighed for anvendelse af en bredere vifte af stammebaggrunde og letter den genetiske modifikation af biosensorekspressive celler. mtHyPer7-proteinet er korrekt målrettet mod mitokondrier uden mærkbare virkninger på mitokondriemorfologi, funktion, distribution eller cellulære væksthastigheder. mtHyPer7 viser et dosisafhængigt respons på eksternt tilsatH2O2. Desuden er mtHyPer7 i stand til at rapportere om heterogeniteten af mitokondriekvalitet med subcellulær opløsning. Endelig forårsager brug af et spindediskkonfokalmikroskop i modsætning til vidvinkelmikroskopi til billeddannelse mitokondriemålrettede biosensorer mindre fotoblegning til fluoroforer og genererer billeder i høj opløsning til analyse af subcellulære forskelle.
Begrænsninger og alternative tilgange Denne metode er ikke egnet til billeddannelse af celler i mere end 10 minutter, da cellerne tørrer ud under dæksedlen. For længerevarende billeddannelse er det bedre at bruge agarpudemetoden46 eller at immobilisere celler i en glasbundet kulturskål fyldt med SC-medium.
Valget af biosensor bør styres af koncentrationen af målet under eksperimentelle betingelser. Hvis følsomheden af HyPer7 er for høj, anbefales en anden HyPer-version, såsom HyPer3 eller HyPerRed47,48. Det skal dog bemærkes, at andre HyPer-sonder er mere pH-følsomme. For højere følsomhed kan den peroxiredoxinbaserede roGFP være mere passende (roGFP2Tsa2ΔCR)27.
H2O2-sensorens oxidationssteady state er bundet til både oxidations- og reduktionshastigheder. Oxidationshastigheden af biosensorer skyldes hovedsageligtH2O2, men reduktionshastigheden afhænger af antioxidantreduktionssystemerne, der er aktive i cellen og organellen. Det har vist sig, at HyPer7 overvejende reduceres af thioredoxinsystemet i gærcytosol, og dets reduktion er hurtigere end for roGFP2Tsa2ΔCR27. Derfor bør sondens forskellige reduktionsmekanismer og responsdynamik tages i betragtning ved fortolkning af målinger af H2O2-biosensorer. For at udledeH2O2-niveauerfra biosensoraflæsningen må det antages, at reduktionssystemet opretholder en konstant kapacitet under forsøget. Som et alternativ til de scripts, der er beskrevet her, er en række andre software blevet stillet frit til rådighed til analyse af redoxsensorer49.
Kritiske trin Med enhver biosensor er det afgørende at demonstrere, at biosensoren i sig selv ikke påvirker den proces, der måles. Derfor er det vigtigt at sammenligne vækst og mitokondriel morfologi af stammer under hver eksperimentel tilstand. Her vurderes mitokondriemorfologi ved hjælp af MitoTracker Red, som pletter mitokondrier på en membranpotentialeafhængig måde. Imidlertid kan sammenligning af mitokondrier i utransformerede og biosensortransformerede celler opnås ved farvning med tetramethylrhodaminmethylester (TMRM), et alternativt membranpotentialefølende mitokondrielt vitalt farvestof, eller MitoTracker Green, som pletter mitokondrier uafhængigt af membranpotentiale. Hvis der er mistanke om skadelige virkninger, kan det hjælpe at reducere udtryksniveauet eller ændre integrationswebstedet.
Validering af sondens dosis-respons-adfærd og signal-støj-forholdet i billeddannelsesteknikken er også afgørende for at indsamle robuste resultater. Hvis variabiliteten inden for en gruppe overstiger variabiliteten mellem grupper, bliver forskelle vanskelige at opdage. Variabilitet inden for gruppen kan skyldes ægte populationsvariation eller støj i detektionsprocessen. De vigtigste trin til at øge signal: støjforholdet er billedoptagelse (pixelværdiområde og støj), baggrundssubtraktion og tærskelværdi.
Støjeffekter kan også reduceres under beregningstrinnene. Den mest enkle fremgangsmåde er at beregne den vægtede middelintensitet ud fra forholdsbilledmålingerne (Resultater.csv), hvor hver pixel repræsenterer det lokale forhold mellem excitationseffektiviteten. Dette giver et "pixelwise" forhold. Men hvis billedsignal:støj-forholdet er lavt, kan der opnås mere robuste resultater ved at beregne den vægtede gennemsnitsintensitet for et investeringsafkast i både tæller- og nævnerens kanaler og derefter beregne forholdet mellem disse to vægtede gennemsnit ("regionvis" forhold).
Hvis du vil vælge en tærskelmetode, skal Fiji-kommandoen Billede | Juster | Auto Threshold kan bruges til automatisk at prøve alle indbyggede Fiji-metoder. For at evaluere segmentering (tærskelværdi) konverteres en gemt maske til en markering ved at klikke på Rediger | Udvælgelse | Opret markering, føjet til ROI Manager (ved at trykke på T) og derefter aktiveret på den rå billedfil. Hvis mitokondrier ikke påvises tilstrækkeligt, skal en anden segmenteringsmetode forsøges.
Når du sammenligner billeder, er det vigtigt at erhverve alle billeder med identiske billedbehandlingsforhold samt at vise alle billederne med identisk kontrastforbedring.
Mitokondriebevægelse skal overvejes ved optimering af billeddannelsesforhold. Hvis mitokondrierne bevæger sig markant mellem excitation ved 405 og 488 nm, vil forholdsbilledet ikke være nøjagtigt. Det anbefales at holde eksponeringstiden <500 ms og ændre excitation ved hjælp af den hurtigste tilgængelige metode (f.eks. en triggerpuls eller akustooptisk justerbart filter). Når du fanger en Z-stak, skal begge excitationer udføres for hvert Z-trin, før du går videre til næste Z-trin.
Til visning af resultaterne er ændringer i nuance (farve) mere indlysende for det menneskelige øje end ændringer i intensitet. Derfor konverteres forholdsværdien til en farveskala for lettere visuel fortolkning. Farvelagte billeder kan være umodulerede, hvor alle mitokondriepixels vises med samme lysstyrke, eller intensitetsmoduleret, hvor pixelintensiteten i det originale billede bruges til at indstille intensiteter i det farvede billede.
Ændring og fejlfinding Som et alternativ til at bekræfte mitokondriefunktionen ved udfordring med paraquat kan celler replikeres eller podes i fermenterbare og ikke-fermenterbare kulstofkilder.
For baggrundssubtraktion, rullende boldsubtraktion (ved at navigere til Proces | Træk baggrund fra...) kan også anvendes til at fjerne uensartethed i belysningen. Det skal sikres, at tilstedeværelsen af celler ikke ændrer baggrunden, der trækkes fra (ved at markere muligheden for at oprette baggrund og undersøge resultatet).
Sammenfattende giver mtHyPer7-sonden en konsistent, minimalt invasiv metode til at relatere den morfologiske og funktionelle status for gærmitokondrier i levende celler og tillader undersøgelse af en vigtig cellulær stressor og signalmolekyle i et genetisk medgørligt, let tilgængeligt modelsystem.

Mitokondrier er essentielle eukaryote cellulære organeller, der er velkendte for deres funktion i at producere ATP gennem oxidativ phosphorylering og elektrontransport1. Derudover er mitokondrier steder til calciumopbevaring, syntese af lipider, aminosyrer, fedtsyre og jern-svovlklynger og signaltransduktion 2,3. Inden for celler danner mitokondrier et dynamisk netværk med karakteristisk morfologi og fordeling, som varierer alt efter celletype og metabolisk tilstand. Selvom mitokondrier kan smelte sammen og dele sig, er ikke alle mitokondrier i en celle ækvivalente. Talrige undersøgelser har dokumenteret mitokondriernes funktionelle heterogenitet i individuelle celler i attributter som membranpotentiale og oxidativ tilstand 4,5,6. Denne variation i mitokondriefunktionen skyldes dels beskadigelse af organellen fra mtDNA-mutationer (som forekommer med en højere hastighed end i nukleært DNA) og oxidativ skade forårsaget af reaktive oxygenarter (ROS), der genereres både inden for og uden for organellen 7,8,9. Skader på organellen afbødes af mitokondrie kvalitetskontrolmekanismer, der reparerer skaden eller eliminerer mitokondrier, der er beskadiget uden reparation10.
Hydrogenperoxid (H2O2) er en reaktiv oxygenart, der er en kilde til oxidativ skade på cellulære proteiner, nukleinsyrer og lipider. Imidlertid tjenerH2O2også som et signalmolekyle, der regulerer cellulære aktiviteter gennem reversibel oxidation af thioler i målproteiner11,12. H2O2 fremstilles af elektroner, der lækker fra mitokondrieelektrontransportkæden og af specifikke enzymer, såsom NADPH-oxidase og monoaminoxidaser 13,14,15,16,17,18,19,20. Det er også inaktiveret af antioxidant systemer, herunder dem, der er baseret på thioredoxin og glutathion21,22,23. Således er analyse af mitokondrie H2O2-niveauer afgørende for at forstå denne metabolits rolle i normal mitokondriel og cellulær funktion og under betingelser med oxidativ stress.
Det overordnede mål med denne protokol er at detektere mitokondrie H2O2 ved hjælp af en genetisk kodet ratiometriskH2O2biosensor, HyPer7, der er målrettet mod organellen (mtHyPer7). mtHyPer7 er en kimær bestående af mitokondriesignalsekvensen fra ATP9 (Su9-præsekvensen), en cirkulært permuteret form af grønt fluorescerende protein (GFP) og H2O2-bindingsdomænet for OxyR-proteinet fra Neisseria meningitidis24 (figur 1). I cirkulært permuteret GFP smeltes N- og C-termini af native GFP, og nye terminer dannes nær kromoforen, hvilket giver større mobilitet til proteinet og større labilitet af dets spektrale egenskaber sammenlignet med native GFP25. Interaktionen mellem mtHyPer7s OxyR-domæne og H2O2 er højaffinitet,H2O2-selektivog fører til reversibel oxidation af de konserverede cysteinrester og disulfidbrodannelse. Konformationsændringer forbundet med oxidationen af OxyR overføres til den cirkulært permuterede GFP i mtHyPer7, hvilket resulterer i et spektralskift i excitationsmaksimumet for mtHyPer7-kromoforen fra 405 nm i reduceret tilstand til 488 nm i H2O2-oxideret tilstand26. Således afspejler forholdet mellem fluorescens fra mtHyPer7 som reaktion på excitation ved 488 nm versus 405 nm oxidationen af sonden medH2O2.
Ideelt set bør en biosensor give en absolut, kvantitativ aflæsning i realtid af dets målmolekyle. Desværre er dette dog ikke altid muligt i målinger i den virkelige verden. I tilfælde af oxidationssensorer, såsom mtHyPer7, påvirkes realtidsaflæsningen af reduktionshastigheden for disulfidbroen. De reduktionssystemer, der anvendes af ROS-biosensorer, er forskellige, og disse kan dramatisk ændre sonderesponsdynamikken - som vist ved sammenligningen af HyPer7, reduceret med thioredoxinsystemet, og roGFP2-Tsa2ΔCR, reduceret med glutathion-in gærcytosol27. For at drage en konklusion om den relativeH2O2-koncentrationfra mtHyPer7-forhold må man således antage, at reduktionssystemet opretholder en konstant kapacitet under eksperimentet. Uanset disse overvejelser er HyPer7 og relaterede sonder blevet brugt i forskellige sammenhænge til at indhente oplysninger om H2O2i levende celler25,28,29.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65428/65428fig01.jpg"> Figur 1: Design, molekylær mekanisme og excitations-/emissionsspektre af H2O2-biosensoren mtHyPer7. (A) mtHyPer7-sonden er afledt ved at indsætte cirkulært permuteret GFP i OxyR-RD-domænet fra Neisseria meningitidis. Den indeholder mitokondriemålretningssekvensen fra underenhed 9 af ATP-syntase fra Neurospora crassa (Su9). (B) Illustration af H 2 O2-sensormekanismeni mtHyPer7. Oxidation af cysteiner i RD-domænet øger fluorescensemission ved excitation ved 488 nm og reducerer emission produceret ved excitation ved 405 nm. C) Excitations- og emissionsspektre for HyPer7 i oxideret og reduceret form. Denne figur er genoptrykt med tilladelse fra Pak et al.24. Forkortelser: GFP = grønt fluorescerende protein; cpGFP = cirkulært permuteret GFP. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65428/65428fig01large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
Denne ratiometriske billeddannelse af mtHyPer7 giver vigtige fordele for mitokondriel H2O2-kvantificering24,27; Det giver en intern kontrol for sondekoncentration. Desuden er skiftet i excitationstop produceret af H2O2-eksponering ikke fuldstændigt, selv i mættende koncentrationer afH2O2. Således kan forholdsbilleddannelse øge følsomheden ved at inkorporere to spektralpunkter i analysen.
Den mtHyPer7-sonde, der anvendes her, har en meget høj affinitet forH2O2og relativt lav følsomhed over for pH24 og er med succes blevet målrettet mod Caenorhabditis elegans mitokondrier30. Dette protein er også blevet brugt i gær27,31. Tidligere undersøgelser var imidlertid afhængige af plasmidbåren ekspression af mtHyPer7, hvilket resulterer i celle-til-celle-variabilitet i sondeekspression27. Derudover blev konstruktionen beskrevet i denne protokol integreret i en bevaret, genfri region på kromosom X32 ved hjælp af en CRISPR-baseret tilgang til markørfri integration. Ekspressionen af det integrerede biosensorgen styres også af den stærke konstitutive TEF1-promotor (figur 2). Som et resultat er der mere stabil, konsistent ekspression af biosensoren i gærcellepopulationer sammenlignet med den, der observeres ved hjælp af plasmidbåren biosensorekspression, og celler, der bærer biosensoren, kan formeres uden behov for selektive medier.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65428/65428fig02.jpg"> Figur 2: Generering af mtHyPer7-ekspressive celler ved hjælp af CRISPR. Den Cas9- og sgRNA-holdige plasmid- (YN2_1_LT58_X2site) og PCR-amplificerede mtHyPer7-holdige biosensorkonstruktion indføres i spirende gærceller ved lithiumacetattransformation. Det genfrie indsættelsessted på kromosom X (X2) genkendes og skæres af Cas9-protein med sgRNA'et, og biosensoren integreres i genomet ved homolog rekombination. Efter identifikation af de vellykkede transformanter ved mikroskopisk screening, koloni-PCR og sekventering fjernes Cas9-plasmidet (helbredes) ved vækst i ikke-selektive medier. Forkortelser: sgRNA = single guide RNA; TEF = transkriptionsforstærkerfaktor. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65428/65428fig02large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
Endelig tilbyder mtHyPer7 fordele i forhold til andre ROS-biosensorer. For eksempel kan organiske farvestoffer, der anvendes til at detektere ROS (f.eks. Dihydroethidium [DHE]2 og MitoSOX3), producere ujævn eller uspecifik farvning og leveres ofte i opløsningsmidler såsom ethanol eller dimethylsulfoxid, som kræver yderligere kontrol for opløsningsmiddelvirkninger. En anden klasse af ROS-biosensorer er fluorescensresonansenergioverførselsbaserede (FRET) -baserede biosensorer (f.eks. Redoxfluor til cellulær redoxtilstand4 og peroxidsensorerne HSP-FRET5, OxyFRET 6 og PerFRET6). Disse sonder er genetisk kodede og meget følsomme i princippet og kan kvantitativt målrettes mod mitokondrier ved hjælp af velkarakteriserede mitokondriesignalsekvenser. Der er dog udfordringer i brugen af FRET-baserede sonder, herunder baggrund på grund af krydsexcitation og gennemblødning, og strenge krav til fluoroforernes nærhed og orientering for FRET for at forekomme33,34. Derudover består FRET-sonder af to fluorescerende proteiner, der kræver større konstruktioner til ekspression i celler af interesse sammenlignet med spektra-skiftende sonder. Protokollen beskrevet her blev udviklet for at drage fordel af styrkerne ved den HyPer7-baserede biosensor og for at bruge denne kompakte, ratiometriske, højaffinitet, genetisk kodede sonde til kvantitativ billeddannelse af peroxid i mitokondrier i levende gær.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100x/1.45 Plan Apo Lambda objective lens</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MRD01905</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenine sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#A9126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Agar</td>
			<td>BD Difco</td>
			<td>#DF0145170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Peptone</td>
			<td>BD Difco</td>
			<td>#DF0118170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Tryptone</td>
			<td>BD Difco</td>
			<td>#DF211705</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Yeast Extract</td>
			<td>BD Difco</td>
			<td>#DF0127179</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BamHI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0136S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BglII</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0144S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbenicilin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carl Zeiss Immersol Immersion Oil</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>444960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextrose (D-(+)-Glucose)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. cloni 10G chemical competent cell</td>
			<td>Bioserch Technologies</td>
			<td>60108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIJI</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td>Schindelin et al 2012</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G418 (Geneticin)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A1720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP emission filter</td>
			<td>Chroma</td>
			<td></td>
			<td>525/50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibson assembly</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E2611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphpad Prism 7</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td></td>
			<td>https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H2O2 (stable)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H1009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HO-pGPD-mito-roGFP-KanMX6-HO</td>
			<td>Pon Lab</td>
			<td>JYE057/EP41</td>
			<td>Liao et al 20201</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator Shaker</td>
			<td>New Brunswick Scientific</td>
			<td>E24</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KAPA HiFi PCR kit</td>
			<td>Roche Sequencing and Life Science, Kapa Biosystems, Wilmington, MA</td>
			<td>KK1006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-arginine hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#A8094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>laser</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>405 and 488 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-histidine hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#H5659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-leucine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#L8912</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-lysine hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#L8662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-methionine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#M9625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-phenylalanine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#P5482</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-tryptophan</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#T8941</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-tyrosine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#T8566</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mHyPer7 plasmid</td>
			<td>This study</td>
			<td>JYE116</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope coverslips</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>3406</td>
			<td>#1.5 (170 &#181;m thickness)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>3050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MitoTracker Red CM-H2Xros</td>
			<td>ThermoFisherScientific</td>
			<td>M7513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBuilder HiFi Assembly Master Mix</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E2621</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Elements</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Microscope acquisition software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Ti Eclipse inverted microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraquat (Methyl viologen dichloride hydrate)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat. #856177&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RStudio</td>
			<td>Posit.co</td>
			<td>Free desktop version</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>BU530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stagetop incubator</td>
			<td>Tokai Hit</td>
			<td>INU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uracil</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#U1128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast nitrogen base (YNB) containing ammonium sulfate without amino acids</td>
			<td>BD Difco</td>
			<td>#DF0919073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>YN2_1_LT58_X2site</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>177705</td>
			<td>Pianale et al 2021</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zyla 4.2 sCMOS camera</td>
			<td>Andor</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging of mthyper7, a ratiometric biosensor for mitochondrial peroxide, in living yeast cells

Mitokondriel dysfunktion eller funktionel ændring findes i mange sygdomme og tilstande, herunder neurodegenerative og muskuloskeletale lidelser, kræft og normal aldring. Her beskrives en tilgang til vurdering af mitokondriefunktion i levende gærceller ved cellulære og subcellulære opløsninger ved hjælp af en genetisk kodet, minimalt invasiv, ratiometrisk biosensor. Biosensoren, mitokondrie-målrettet HyPer7 (mtHyPer7), detekterer hydrogenperoxid (H2O2) i mitokondrier. Den består af en mitokondriesignalsekvens smeltet sammen med et cirkulært permuteret fluorescerende protein og H2O2-responsivt domæne af et bakterielt OxyR-protein. Biosensoren genereres og integreres i gærgenomet ved hjælp af et CRISPR-Cas9 markørfrit system for mere konsistent ekspression sammenlignet med plasmidbårne konstruktioner.
mtHyPer7 er kvantitativt målrettet mod mitokondrier, har ingen påviselig effekt på gærvæksthastighed eller mitokondriemorfologi og giver en kvantitativ aflæsning for mitokondrielH2O2under normale vækstbetingelser og ved udsættelse for oxidativt stress. Denne protokol forklarer, hvordan man optimerer billeddannelsesforholdene ved hjælp af et spindeskivekonfokalmikroskopsystem og udfører kvantitativ analyse ved hjælp af frit tilgængelig software. Disse værktøjer gør det muligt at indsamle rig rumlig tidsmæssig information om mitokondrier både inden for celler og blandt celler i en population. Desuden kan arbejdsgangen beskrevet her bruges til at validere andre biosensorer.

Mitochondria are essential eukaryotic cellular organelles that are well known for their function in producing ATP through oxidative phosphorylation and electron transport1. In addition, mitochondria are sites for calcium storage, the synthesis of lipids, amino acids, fatty acid and iron-sulfur clusters, and signal transduction2,3. Within cells, mitochondria form a dynamic network with characteristic morphology and distribution, which varies according to cell type and metabolic state. Furthermore, although mitochondria can fuse and divide, not all the mitochondria in a cell are equivalent. Numerous studies have documented the functional heterogeneity of mitochondria within individual cells in attributes such as membrane potential and oxidative state4,5,6. This variation in mitochondrial function is due in part to damage to the organelle from mtDNA mutations (which occur at a higher rate than in nuclear DNA) and to oxidative damage by reactive oxygen species (ROS) generated both within and outside the organelle7,8,9. Damage to the organelle is mitigated by mitochondrial quality control mechanisms that repair the damage or eliminate mitochondria that are damaged beyond repair10.
Hydrogen peroxide (H2O2) is a reactive oxygen species that is a source of oxidative damage to cellular proteins, nucleic acids, and lipids. However, H2O2 also serves as a signaling molecule that regulates cellular activities through the reversible oxidation of thiols in target proteins11,12. H2O2 is produced from electrons that leak from the mitochondrial electron transport chain and by specific enzymes, such as NADPH oxidase and monoamine oxidases13,14,15,16,17,18,19,20. It is also inactivated by antioxidant systems, including those based on thioredoxin and glutathione21,22,23. Thus, analysis of mitochondrial H2O2 levels is critical for understanding the role of this metabolite in normal mitochondrial and cellular function and under conditions of oxidative stress.
The overall goal of this protocol is to detect mitochondrial H2O2 using a genetically encoded ratiometric H2O2 biosensor, HyPer7, that is targeted to the organelle (mtHyPer7). mtHyPer7 is a chimera consisting of the mitochondrial signal sequence from ATP9 (the Su9 presequence), a circularly permuted form of green fluorescent protein (GFP), and the H2O2-binding domain of the OxyR protein from Neisseria meningitidis24 (Figure 1). In circularly permuted GFP, the N- and C-termini of native GFP are fused and new termini are formed near the chromophore, which impart greater mobility to the protein and greater lability of its spectral characteristics compared to native GFP25. The interaction of mtHyPer7&#39;s OxyR domain with H2O2 is high-affinity, H2O2-selective, and leads to reversible oxidation of the conserved cysteine residues and disulfide bridge formation. Conformational changes associated with the oxidation of OxyR are transferred to the circularly permuted GFP in mtHyPer7, which results in a spectral shift in the excitation maximum of the mtHyPer7 chromophore from 405 nm in the reduced state to&#160;488 nm in the H2O2-oxidized state26. Thus, the ratio of fluorescence from mtHyPer7 in response to excitation at 488 nm versus 405 nm reflects the oxidation of the probe by H2O2.
Ideally, a biosensor should provide a real-time, absolute, quantitative readout of its target molecule. Unfortunately, however, this is not always possible in real-world measurements. In the case of oxidation sensors, such as mtHyPer7, the real-time readout is affected by the rate of reduction of the disulfide bridge. The reduction systems used by ROS biosensors differ, and these can dramatically alter probe response dynamics-as shown by the comparison of HyPer7, reduced by the thioredoxin system, and roGFP2-Tsa2&#916;CR, reduced by glutathione-in yeast cytosol27. Thus, to draw a conclusion about the relative H2O2 concentration from mtHyPer7 ratios, one must assume that the reduction system maintains a constant capacity during the experiment. Notwithstanding these considerations, HyPer7 and related probes have been used in various contexts to obtain information about H2O2 in living cells25,28,29.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65428/65428fig01.jpg" /> 
Figure 1: Design, molecular mechanism, and excitation/emission spectra of the H2O2 biosensor mtHyPer7. (A) The mtHyPer7 probe is derived by inserting circularly permuted GFP into the OxyR-RD domain from Neisseria meningitidis. It contains the mitochondrial targeting sequence from subunit 9 of the ATP synthase from Neurospora crassa (Su9). (B) Illustration of the H2O2-sensing mechanism of mtHyPer7. Oxidation of cysteines in the RD domain increases fluorescence emission upon excitation at 488 nm and decreases emission produced by excitation at 405 nm. (C) Excitation and emission spectra of HyPer7 in oxidized and reduced forms. This figure is reprinted with permission from Pak et al.24. Abbreviations: GFP = green fluorescent protein; cpGFP = circularly permuted GFP. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65428/65428fig01large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
This ratiometric imaging of mtHyPer7 offers important benefits for mitochondrial H2O2 quantitation24,27; it provides an internal control for probe concentration. In addition, the shift in excitation peak produced by H2O2 exposure is not complete, even in saturating concentrations of H2O2. Thus, ratio imaging can increase the sensitivity by incorporating two spectral points in the analysis.
The mtHyPer7 probe used here has a very high affinity for H2O2 and relatively low sensitivity to pH24, and has been successfully targeted to Caenorhabditis elegans mitochondria30. This protein has also been used in yeast27,31. However, previous studies relied on plasmid-borne expression of mtHyPer7, which results in cell-to-cell variability in probe expression27. In addition, the construct described in this protocol was integrated into a conserved, gene-free region on chromosome X32 using a CRISPR-based approach for marker-free integration. Expression of the integrated biosensor gene is also controlled by the strong constitutive TEF1 promoter (Figure 2). As a result, there is more stable, consistent expression of the biosensor in yeast cell populations compared to that observed using plasmid-borne biosensor expression, and cells bearing the biosensor can be propagated without the need for selective media.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65428/65428fig02.jpg" /> 
Figure 2: Generation of mtHyPer7-expressing cells by CRISPR. The Cas9 and sgRNA-containing plasmid (YN2_1_LT58_X2site) and PCR-amplified mtHyPer7-containing biosensor construct are introduced into budding yeast cells by lithium acetate transformation. The gene-free insertion site on chromosome X (X2) is recognized and cut by Cas9 protein with the sgRNA, and the biosensor is integrated into the genome by homologous recombination. After identification of the successful transformants by microscopic screening, colony PCR, and sequencing, the Cas9 plasmid is removed (cured) by growth in non-selective media. Abbreviations: sgRNA = single guide RNA; TEF = transcription enhancer factor. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65428/65428fig02large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
Finally, mtHyPer7 offers advantages over other ROS biosensors. For example, organic dyes used to detect ROS (e.g., dihydroethidium [DHE]2 and MitoSOX3) can produce uneven or nonspecific staining and are often delivered in solvents such as ethanol or dimethyl sulfoxide, which require additional controls for solvent effects. Another class of ROS biosensors are fluorescence resonance energy transfer (FRET)-based biosensors (e.g., Redoxfluor for cellular redox state4, and the peroxide sensors HSP-FRET5, OxyFRET6, and PerFRET6). These probes are genetically encoded and highly sensitive in principle and can be quantitatively targeted to mitochondria using well-characterized mitochondrial signal sequences. However, there are challenges in the use of FRET-based probes, including background due to cross-excitation and bleed-through, and stringent requirements for the proximity and orientation of the fluorophores for FRET to occur33,34. In addition, FRET probes consist of two fluorescent proteins that require larger constructs for expression in cells of interest compared to spectra-shifting probes. The protocol described here was developed to take advantage of the strengths of the HyPer7-based biosensor, and to use this compact, ratiometric, high-affinity, genetically encoded probe for quantitative imaging of peroxide in mitochondria in living yeast.

Forfatter Spotlight: Fremme af mitokondrieforskning - mtHyper7 Biosensor til subcellulær analyse 

Billeddannelse af mtHyPer7, en ratiometrisk biosensor for mitokondrieperoxid, i levende gærceller

Mitochondria are organelles within cells that facilitate energy mobilization, central metabolism, production of vital macromolecules, calcium storage, and signal transduction. As a result, they play a crucial role in cellular function, fitness, and lifespan control. Our research focuses on investigating the impact of mitochondria on aging using the budding yeast Saccharomyces cerevisiae as a model organism.Live cell imaging is our best tool to observe variation in mitochondrial function. Here we describe a method that utilizes a genetically encoded ratio metric spectral shifting biosensor called mitochondrial HyPer7. mtHyPer7 detects hydrogen peroxide, a reactive oxygen species, that can damage cellular constituents, but also functions as a signaling molecule in mitochondria of live cells.mtHyPer7 has a high affinity for hydrogen peroxide and low sensitivity to pH. It is integrated into the yeast genome, which results in stable and consistent expression in yeast cell populations. Finally, it is quantitatively targeted to mitochondria and has no detectable effect on cellular or mitochondrial function or fitness.Biosensors like mtHyPer7 are critical for studying mitochondrial function at subcellular resolution, for finding mechanisms underlying mitochondrial quality control, and for examining how that process affects cell fitness, feed, and lifespan. The mtHyPer7 stain provides consistent laboring in contrast to organic dyes utilized for reactive oxygen species detection. Compared to FRET-based sensors, mtHyPer7 is more compact and avoids issues such as cross-excitation and bleed through, as well as the precise positioning and the orientation requirements for FRET.

For at bekræfte, at mtHyPer7 er en egnet sonde til vurdering af mitokondrielH2O2, blev lokaliseringen af mtHyPer7 og dens virkning på gærmitokondrier og cellesundhed vurderet. For at vurdere målretningen af mtHyPer7 blev mitokondrier farvet med det vitale mitokondriespecifikke farvestof MitoTracker Red i kontrolgærceller og gær, der udtrykker mtHyPer7. Ved hjælp af MitoTracker Rødfarvning blev mitokondrier opløst som lange rørformede strukturer, der justerede langs moderknoppeaksen og akkumulerede i spidsen af knoppen og spidsen af modercellen distal til knoppen41. Mitokondriemorfologien var ens i kontrol- og mtHyPer7-ekspressive celler. Derudover er mtHyPer7 lokaliseret sammen med MitoTracker rødfarvede mitokondrier (figur 3A). Således blev mtHyPer7 effektivt og kvantitativt målrettet mod mitokondrier uden at påvirke normal mitokondriel morfologi eller distribution.
Dernæst blev der udført yderligere valideringseksperimenter for at vurdere effekten af mtHyPer7 på cellulær fitness og følsomhed over for oxidativt stress i mitokondrier. Væksthastighederne for mtHyPer7-ekspressive celler i rige eller syntetiske glukosebaserede medier (henholdsvis YPD eller SC) svarer til dem for utransformerede vildtypeceller (figur 3B, D). For at vurdere de mulige virkninger på oxidativt stress i mitokondrier blev kontrol- og mtHyPer7-ekspressionsgær behandlet med lave niveauer af paraquat, et redoxaktivt lille molekyle, der akkumuleres i mitokondrier og resulterer i forhøjede superoxidniveauer i organellen24,27. Hvis mtHyPer7-ekspression enten inducerer oxidativt stress i mitokondrier eller beskytter mitokondrier mod oxidativt stress, bør mtHyPer7-ekspressive celler udvise henholdsvis øget eller nedsat følsomhed over for paraquatbehandling. Behandling med lave niveauer af paraquat resulterede i et fald i gærvækstrater. Desuden var væksthastighederne for vildtype- og mtHyPer7-ekspressive celler i nærvær af paraquat ens (figur 3C, E). Derfor skabte ekspression af biosensoren ikke signifikante cellulære spændinger i spirende gærceller eller ændrede gærens følsomhed over for mitokondriel oxidativ stress.
I betragtning af beviserne for, at mtHyPer7 er egnet til at studere mitokondrie H2O2 i spirende gær, blev det testet, om mtHyPer7 kunne detektere mitokondriel H2O2 i vildtypegær i midten af logfasen og ændringer i mitokondriel H2O2 induceret af eksternt tilsatH2O2. Et H2O2-titreringseksperiment blev udført, og det gennemsnitlige oxiderede:reducerede (O/R) mtHyPer7-forhold blev målt i mitokondrier.
De automatiserede analysescripts producerede flere outputfiler.
Forholdsbilledet (forhold.tif): En Z-stak bestående af forholdet mellem de baggrundskorrigerede, tærskelstakke på 488 nm og 405 nm. Denne stak kan ses i Fiji uden yderligere behandling; Det anbefales dog at forbedre kontrasten og/eller farvelægge billedet som beskrevet i protokoltrin 4.3 eller 5.6 før visning.
Maskebilledet (maske.tif): En Z-stak, der består af de tærskelovertrukne mitokondrieområder, der bruges til analyse. Dette billede skal bruges til at evaluere nøjagtigheden af tærsklen.
De investeringsafkast, der bruges til analyse (ROI'er.zip): Når denne fil åbnes i Fiji sammen med kildebilledet, lægges ROI'erne oven på billedet for at krydshenvise resultattabellen og kildebilledet. Hvert investeringsafkast omdøbes med et cellenummer og et ROI-nummer.
Måletabeller (NumResults.csv, DenomResults.csv, Results.csv), der indeholder areal, gennemsnit og integreret tæthed af tærskelværdier mitokondrier for hvert udsnit i henholdsvis tæller-, nævner- og forholdsbillederne. I skiver, hvor mitokondrier var fraværende eller ude af fokus, registreres NaN.
En logfil (Log.txt), der dokumenterer de indstillinger, der bruges til baggrunds- og støjkorrektion, tærskelværdi og forholdsberegning.
O/R-forholdet mellem mtHyPer7 viste et dosisafhængigt respons på H2O2-koncentrationen, som nåede et plateau ved 1-2 mM eksternt tilsatH2O2(figur 7). Overraskende nok var HyPer7-forholdet lavere i cellerne udsat for 0,1 mMH2O2end i kontrolcellerne, selvom denne forskel ikke var statistisk signifikant. En forklaring på dette fænomen kan være et hormesisrespons, hvor eksponering for et lavt stressniveau kan fremkalde stressresponser, såsom antioxidantmekanismer, som igen sænker mængden af ROS, der kan påvises af sonden. Højere niveauer af stressorer kan derimod overvælde de interne stressresponser og resultere i en højere aflæsning fra HyPer7.
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65428/65428fig07.jpg"> Figur 7: mtHyPer7's respons på eksternt tilsatteH2O2. (A) Maksimal projektion på 405 nm og 488 nm exciterede billeder og gennemsnitlig intensitetsprojektion af ratiometriske billeder af mtHyPer7 i midterste logfaseceller, der udsættes for forskellige koncentrationer afH2O2. Pseudocolor angiver det oxiderede:reduceret mtHyPer7-forhold (skala nederst). Skalabjælke = 1 μm. Cellekonturen vises med hvidt; n > 100 celler pr. tilstand. (B) Kvantificering af mtHyPer7 oxideret: reduceret forhold i spirende gærceller behandlet med forskellige koncentrationer af H 2 O2. Midlerne til fem uafhængige forsøg er vist, med forskelligt formede og farvede symboler for hvert forsøg. Gennemsnitlig ± SEM af forholdet mellem oxideret:reduceret mtHyPer7: 1,794 ± 0,07627 (ingen behandling), 1,357 ± 0,03295 (0,1 mM), 2,571 ± 0,3186 (0,5 mM), 6,693 ± 0,5194 (1 mM), 7,017 ± 0,1197 (2 mM). p < 0,0001 (envejs ANOVA med Tukeys multiple sammenligningstest). P-værdier betegnes som: ****p < 0,0001. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65428/65428fig07large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
Endelig viste tidligere undersøgelser, at montørmitokondrier, som er mere reducerede og indeholder mindre superoxid, fortrinsvis arves af gærdatterceller4, og at cytosoliske katalaser transporteres til og aktiveres i gærdatterceller42,43,44,45. Disse undersøgelser dokumenterer den asymmetriske arv af mitokondrier under gærcelledeling og en rolle for denne proces i dattercelleegnethed og levetid samt mor-datter aldersasymmetri. For at teste, om der er forskelle iH2O2mellem mødre og knopper, blev mtHyPer7 målt i knopper og moderceller. Forskelle i mitokondrie H2O2 blev observeret i gærceller, og et subtilt, men statistisk signifikant fald iH2O2-biosensoraflæsningblev påvist i mitokondrier i knoppen sammenlignet med dem i modercellen (figur 8). Disse resultater er i overensstemmelse med tidligere resultater, at mitokondrier i knoppen er bedre beskyttet mod oxidativt stress. De giver også dokumentation for, at mtHyPer7 kan give en kvantitativ aflæsning for mitokondrieH2O2med cellulær og subcellulær opløsning i spirende gær.
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65428/65428fig08.jpg"> Figur 8: MitokondrieH2O2-niveauer lavere i dattercellen. (A) Maksimal projektion af et ratiometrisk billede af mtHyPer7 i en repræsentativ celle. Pseudocolor angiver det oxiderede:reduceret mtHyPer7-forhold (skala nederst). Subcellulære forskelle i forholdet er tydelige (pilespidser). Skalabjælke = 1 μm. Cellekontur: hvid. (B) Forskel mellem mtHyPer7-forholdet i knoppe- og modercellen. For hver enkelt celle blev moderforholdsværdien trukket fra knoppeforholdsværdien og plottet som et punkt. n = 193 celler samlet fra fem uafhængige eksperimenter, vist med forskelligt farvede symboler for hvert eksperiment. Gennemsnitlig ± SEM af forskellen mellem mtHyPer7-forholdet i knoppe- og modercellerne: -0,04297 ± 0,01266. p = 0,0008 (parret t-test) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65428/65428fig08large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
Supplerende tabel S1: Stammer anvendt i denne undersøgelse. Liste over anvendte gærstammer. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65428/65428_Supplemental%20Table%201%20Strains%20used%20in%20this%20study-R2.xls" target="_blank">Klik her for at downloade denne fil.</a>
Supplerende tabel S2: Plasmider anvendt i denne undersøgelse. Liste over anvendte plasmider. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65428/Supplemental%20Table%202%20Plasmids%20used%20in%20this%20study-R2.xls" target="_blank">Klik her for at downloade denne fil.</a>
Supplerende tabel S3: Primere anvendt i denne undersøgelse. Liste over anvendte primere. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65428/65428_Supplemental%20Table%203%20Primers%20used%20in%20this%20study-R2.xls" target="_blank">Klik her for at downloade denne fil.</a>
Supplerende fil 1: Protokol til biosensorplasmidkonstruktion. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65428/65428_Yang%20et%20al%20Supp%20Protocol%202023.docx" target="_blank">Klik her for at downloade denne fil.</a>
Supplerende fil 2: Scripts til automatiseret analyse. For hvert script leveres eksempelinputfiler og outputfiler. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65428/biosensor-supplemental-coding-files.zip" target="_blank">Klik her for at downloade denne fil.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Advancing Mitochondrial Research  mtHyper7 Biosensor for Subcellular Analysis at JoVE.com

Hydrogenperoxid (H2O2) er både en kilde til oxidativ skade og et signalmolekyle. Denne protokol beskriver, hvordan man måler mitokondriel H2 O2 ved hjælp af mitokondrie-målrettet HyPer7 (mtHyPer7), en genetisk kodet ratiometrisk biosensor, i levende gær. Det beskriver, hvordan man optimerer billeddannelsesforholdene og udfører kvantitativ cellulær og subcellulær analyse ved hjælp af frit tilgængelig software.

Mitochondrial dysfunction, or functional alteration, is found in many diseases and conditions, including neurodegenerative and musculoskeletal disorders, ...

Mitokondrier er organeller i celler, der letter energimobilisering, central metabolisme, produktion af vitale makromolekyler, calciumlagring og signaltransduktion. Som et resultat spiller de en afgørende rolle i cellulær funktion, fitness og levetidskontrol. Vores forskning fokuserer på at undersøge mitokondriers indvirkning på aldring ved hjælp af den spirende gær Saccharomyces cerevisiae som modelorganisme.Live cellebilleddannelse er vores bedste værktøj til at observere variation i mitokondriefunktionen. Her beskriver vi en metode, der anvender en genetisk kodet ratio metrisk spektralskiftende biosensor kaldet mitokondriel HyPer7. mtHyPer7 registrerer hydrogenperoxid, en reaktiv iltart, der kan skade cellulære bestanddele, men fungerer også som et signalmolekyle i mitokondrier af levende celler.mtHyPer7 har en høj affinitet for hydrogenperoxid og lav følsomhed over for pH. Det er integreret i gærgenomet, hvilket resulterer i stabil og konsistent ekspression i gærcellepopulationer. Endelig er det kvantitativt målrettet mod mitokondrier og har ingen påviselig effekt på cellulær eller mitokondriel funktion eller fitness.Biosensorer som mtHyPer7 er afgørende for at studere mitokondriefunktion ved subcellulær opløsning, for at finde mekanismer, der ligger til grund for mitokondriel kvalitetskontrol, og for at undersøge, hvordan denne proces påvirker cellekondition, foder og levetid. mtHyPer7-pletten giver ensartet arbejdskraft i modsætning til organiske farvestoffer, der anvendes til detektion af reaktive iltarter. Sammenlignet med FRET-baserede sensorer er mtHyPer7 mere kompakt og undgår problemer som krydsexcitation og gennemblødning samt den præcise positionering og orienteringskravene til FRET.

Billeddannelse af mtHyPer7, en ratiometrisk biosensor for mitokondrieperoxid, i levende gærceller

Abstract