De auteurs bedanken Katherine Filpo Lopez voor deskundige technische assistentie. Dit werk werd ondersteund door subsidies van de National Institutes of Health (NIH) (GM122589 en AG051047) aan LP.
Deze studies maakten gebruik van de confocale en gespecialiseerde microscopie Shared Resource van het Herbert Irving Comprehensive Cancer Center aan de Columbia University, gedeeltelijk gefinancierd door de NIH/NCI Cancer Center Support Grant P30CA013696.

Beeldvorming van mitochondriaal peroxide in levende gistcellen met behulp van mtHyper7

De auteurs verklaren dat ze geen belangenconflicten hebben.

In dit protocol wordt een methode beschreven voor het gebruik van mtHyPer7 als biosensor om mitochondriale H 2 O2in levende ontluikende gistcellen te beoordelen. De biosensor wordt geconstrueerd met behulp van een op CRISPR gebaseerde methode en geïntroduceerd in een geconserveerd genvrij gebied in het gistgenoom zonder het gebruik van selecteerbare markers. Vergeleken met door plasmiden overgedragen biosensoren, worden geïntegreerde biosensoren in alle cellen en op consistente niveaus tot expressie gebracht, wat betrouwbaardere kwantificeringsresultaten oplevert. Er worden geen selecteerbare markers gebruikt om mtHyPer7-expressieve cellen te genereren, wat het gebruik van een breder scala aan stamachtergronden mogelijk maakt en de genetische modificatie van cellen met biosensorexpressie vergemakkelijkt. Het mtHyPer7-eiwit is correct gericht op mitochondriën zonder merkbare effecten op de mitochondriale morfologie, functie, distributie of cellulaire groeisnelheid. mtHyPer7 vertoont een dosisafhankelijke respons op extern toegevoegde H 2 O2. Bovendien is mtHyPer7 in staat om te rapporteren over de heterogeniteit van mitochondriale kwaliteit met subcellulaire resolutie. Ten slotte veroorzaakt het gebruik van een confocale microscoop met draaiende schijf in tegenstelling tot breedveldmicroscopie voor het afbeelden van mitochondriale biosensoren minder fotobleken tot fluoroforen en genereert het beelden met een hoge resolutie voor het analyseren van subcellulaire verschillen.
Beperkingen en alternatieve benaderingen Deze methode is niet geschikt om cellen langer dan 10 minuten af te beelden, omdat de cellen onder het dekglaasje uitdrogen. Voor beeldvorming op langere termijn is het beter om de agarpadmethode46 te gebruiken of om cellen te immobiliseren in een kweekschaal met glazen bodem gevuld met SC-medium.
Bij de keuze van de biosensor moet rekening worden gehouden met de concentratie van het doelwit onder experimentele omstandigheden. Als de gevoeligheid van HyPer7 te hoog is, is een andere HyPer-versie aan te bevelen, zoals HyPer3 of HyPerRed47,48. Er moet echter worden opgemerkt dat andere HyPer-sondes pH-gevoeliger zijn. Voor een hogere gevoeligheid kan de op peroxiredoxine gebaseerde roGFP geschikter zijn (roGFP2Tsa2ΔCR)27.
De stabiele oxidatietoestand van de H2O2-sensoris gekoppeld aan zowel oxidatie- als reductiesnelheden. De oxidatiesnelheid van biosensoren wordt voornamelijk veroorzaakt door H 2 O2, maar de reductiesnelheid hangt af van de antioxidantreductiesystemen die actief zijn in de cel en het organel. Het is aangetoond dat HyPer7 voornamelijk wordt gereduceerd door het thioredoxinesysteem in gistcytosol, en dat de reductie ervan sneller is dan die van roGFP2Tsa2ΔCR27. Daarom moet bij het interpreteren van metingen vanH2O 2-biosensoren rekening worden gehouden met de verschillende reductiemechanismen en responsdynamiek van de sonde. In het bijzonder moet worden aangenomen dat het reductiesysteem tijdens het experiment een constante capaciteit handhaaft omH2O2-niveaus af te leiden uit de uitlezing van de biosensor. Als alternatief voor de hier beschreven scripts is een verscheidenheid aan andere software vrij beschikbaar gesteld voor de analyse van redoxsensoren49.
Kritische stappen Bij elke biosensor is het van cruciaal belang om aan te tonen dat de biosensor zelf geen invloed heeft op het proces dat wordt gemeten. Daarom is het belangrijk om de groei en mitochondriale morfologie van stammen onder elke experimentele omstandigheid te vergelijken. Hier wordt de mitochondriale morfologie beoordeeld met behulp van MitoTracker Red, dat mitochondriën kleurt op een membraanpotentiaalafhankelijke manier. Vergelijking van de mitochondriën in niet-getransformeerde en biosensor-getransformeerde cellen kan echter worden bereikt door kleuring met tetramethylrhodaminemethylester (TMRM), een alternatieve membraanpotentiaalgevoelige mitochondriale vitale kleurstof, of MitoTracker Green, die mitochondriën kleurt onafhankelijk van membraanpotentiaal. Als schadelijke effecten worden vermoed, kan het helpen om het expressieniveau te verlagen of de integratieplaats te wijzigen.
Het valideren van het dosis-responsgedrag van de sonde en de signaal-ruisverhouding van de beeldvormingstechniek zijn ook essentieel voor het verzamelen van robuuste resultaten. Als de variabiliteit binnen een groep groter is dan de variabiliteit tussen groepen, worden verschillen moeilijk te detecteren. Variabiliteit binnen de groep kan het gevolg zijn van echte populatievariatie of van ruis in het detectieproces. De belangrijkste stappen om de signaal:ruisverhouding te verhogen zijn beeldacquisitie (pixelwaardebereik en ruis), achtergrondaftrekking en drempelwaarden.
Geluidseffecten kunnen ook worden verminderd tijdens de berekeningsstappen. De meest eenvoudige benadering is het berekenen van de gewogen gemiddelde intensiteit op basis van de verhoudingsbeeldmetingen (Resultaten.csv), waarbij elke pixel de lokale verhouding tussen de excitatie-efficiëntie vertegenwoordigt. Dit levert een "pixelgewijze" verhouding op. Als de beeldsignaal:ruisverhouding echter laag is, kunnen robuustere resultaten worden verkregen door de gewogen gemiddelde intensiteit voor een ROI in zowel de teller- als de noemerkanalen te berekenen en vervolgens de verhouding tussen deze twee gewogen gemiddelden te berekenen ("regiogewijze" verhouding).
Als u een drempelmethode wilt selecteren, wordt de Fiji-opdracht Image | Aanpassen | Auto Threshold kan worden gebruikt om automatisch alle ingebouwde Fiji-methoden uit te proberen. Om segmentatie (drempelwaarden) te evalueren, wordt een opgeslagen masker omgezet in een selectie door te klikken op Bewerken | Selectie | Selectie maken, toegevoegd aan de ROI Manager (door op T te drukken) en vervolgens geactiveerd op het RAW-afbeeldingsbestand. Als mitochondriën niet adequaat worden gedetecteerd, moet een andere segmentatiemethode worden geprobeerd.
Bij het vergelijken van afbeeldingen is het essentieel om alle afbeeldingen met identieke beeldomstandigheden te verkrijgen en om alle afbeeldingen met identieke contrastverbetering weer te geven.
Bij het optimaliseren van de beeldvormingsomstandigheden moet rekening worden gehouden met mitochondriale beweging. Als de mitochondriën significant bewegen tussen excitatie bij 405 en 488 nm, zal het verhoudingsbeeld niet nauwkeurig zijn. Het wordt aanbevolen om de belichtingstijd <500 ms aan te houden en de excitatie te wijzigen met de snelst beschikbare methode (bijv. een triggerpuls of een akoestisch-optisch afstembaar filter). Bij het vastleggen van een Z-stapel moeten beide excitaties worden uitgevoerd voor elke Z-stap voordat naar de volgende Z-stap wordt gegaan.
Voor de weergave van de resultaten zijn veranderingen in tint (kleur) duidelijker voor het menselijk oog dan veranderingen in intensiteit. Daarom wordt de verhoudingswaarde geconverteerd naar een kleurenschaal voor eenvoudigere visuele interpretatie. Ingekleurde afbeeldingen kunnen ongemoduleerd zijn, waarbij alle mitochondriale pixels met dezelfde helderheid verschijnen, of intensiteitsgemoduleerd, waarbij de pixelintensiteit in de originele afbeelding wordt gebruikt om intensiteiten in de gekleurde afbeelding in te stellen.
Wijziging en probleemoplossing Als alternatief voor het bevestigen van de mitochondriale functie door provocatie met paraquat, kunnen cellen worden gerepliceerd of geïnoculeerd in fermenteerbare en niet-fermenteerbare koolstofbronnen.
Voor aftrekken op de achtergrond, aftrekken van rollende ballen (door te navigeren naar Verwerken | Achtergrond aftrekken...) kan ook worden gebruikt om niet-uniforme verlichting te verwijderen. Er moet voor worden gezorgd dat de aanwezigheid van cellen de achtergrond die wordt afgetrokken niet verandert (door de optie Achtergrond maken aan te vinken en het resultaat te bekijken).
Samenvattend biedt de mtHyPer7-sonde een consistente, minimaal invasieve methode om de morfologische en functionele status van gistmitochondriën in levende cellen te relateren, en maakt het de studie mogelijk van een belangrijke cellulaire stressor en signaalmolecuul in een genetisch handelbaar, gemakkelijk toegankelijk modelsysteem.

Mitochondriën zijn essentiële eukaryote cellulaire organellen die bekend staan om hun functie bij het produceren van ATP door oxidatieve fosforylering en elektronentransport. Bovendien zijn mitochondriën plaatsen voor calciumopslag, de synthese van lipiden, aminozuren, vetzuren en ijzer-zwavelclusters en signaaltransductie 2,3. Binnen cellen vormen mitochondriën een dynamisch netwerk met karakteristieke morfologie en distributie, die varieert afhankelijk van het celtype en de metabolische toestand. Bovendien, hoewel mitochondriën kunnen samensmelten en delen, zijn niet alle mitochondriën in een cel gelijkwaardig. Talrijke studies hebben de functionele heterogeniteit van mitochondriën binnen individuele cellen gedocumenteerd in attributen zoals membraanpotentiaal en oxidatieve toestand 4,5,6. Deze variatie in mitochondriale functie is gedeeltelijk te wijten aan schade aan het organel door mtDNA-mutaties (die sneller optreden dan in nucleair DNA) en aan oxidatieve schade door reactieve zuurstofsoorten (ROS) die zowel binnen als buiten het organel worden gegenereerd 7,8,9. Schade aan het organel wordt beperkt door mitochondriale kwaliteitscontrolemechanismen die de schade herstellen of mitochondriën elimineren die onherstelbaar beschadigd zijn10.
Waterstofperoxide (H 2O2) is een reactieve zuurstofsoort die een bron is van oxidatieve schade aan cellulaire eiwitten, nucleïnezuren en lipiden. H2O2 dient echter ook als een signaalmolecuul dat cellulaire activiteiten reguleert door de omkeerbare oxidatie van thiolen in doeleiwitten11,12. H 2 O2wordt geproduceerd uit elektronen die lekken uit de mitochondriale elektronentransportketen en door specifieke enzymen, zoals NADPH-oxidase en monoamine-oxidasen 13,14,15,16,17,18,19,20. Het wordt ook geïnactiveerd door antioxidantsystemen, waaronder die op basis van thioredoxine en glutathion21,22,23. Analyse van mitochondrialeH2O 2-spiegels is dus van cruciaal belang voor het begrijpen van de rol van deze metaboliet in de normale mitochondriale en cellulaire functie en onder omstandigheden van oxidatieve stress.
Het algemene doel van dit protocol is om mitochondriaal H 2 O 2 te detecteren met behulp van een genetisch gecodeerde ratiometrische H 2 O2 biosensor, HyPer7, die gericht is op het organel (mtHyPer7). mtHyPer7 is een chimaera die bestaat uit de mitochondriale signaalsequentie van ATP9 (de Su9-presequentie), een circulair gepermuteerde vorm van groen fluorescerend eiwit (GFP), en het H 2 O2-bindendedomein van het OxyR-eiwit van Neisseria meningitidis24 (Figuur 1). In circulair gepermuteerd GFP worden de N- en C-termini van native GFP gefuseerd en worden nieuwe termini gevormd in de buurt van de chromofoor, die een grotere mobiliteit aan het eiwit en een grotere labiliteit van zijn spectrale kenmerken geven in vergelijking met native GFP25. De interactie van het OxyR-domein van mtHyPer7 met H 2 O 2 is zeer affiniteit, H 2 O2-selectief en leidt tot omkeerbare oxidatie van de geconserveerde cysteïneresiduen en de vorming van disulfidebruggen. Conformatieveranderingen geassocieerd met de oxidatie van OxyR worden overgebracht naar het circulair gepermuteerde GFP in mtHyPer7, wat resulteert in een spectrale verschuiving in het excitatiemaximum van de mtHyPer7-chromofoor van 405 nm in gereduceerde toestand tot 488 nm in de H 2 O2-geoxideerde toestand26. De verhouding tussen fluorescentie van mtHyPer7 als reactie op excitatie bij 488 nm versus 405 nm weerspiegelt dus de oxidatie van de sonde door H 2 O2.
Idealiter zou een biosensor een real-time, absolute, kwantitatieve uitlezing van zijn doelmolecuul moeten geven. Helaas is dit echter niet altijd mogelijk in metingen in de praktijk. In het geval van oxidatiesensoren, zoals mtHyPer7, wordt de real-time uitlezing beïnvloed door de reductiesnelheid van de disulfidebrug. De reductiesystemen die door ROS-biosensoren worden gebruikt, verschillen, en deze kunnen de dynamiek van de sonderespons drastisch veranderen, zoals blijkt uit de vergelijking van HyPer7, gereduceerd door het thioredoxinesysteem, en roGFP2-Tsa2ΔCR, gereduceerd door glutathion-in gistcytosol27. Om een conclusie te trekken over de relatieve H2O2-concentratieuit mtHyPer7-verhoudingen, moet men dus aannemen dat het reductiesysteem tijdens het experiment een constante capaciteit handhaaft. Niettegenstaande deze overwegingen zijn HyPer7 en verwante sondes in verschillende contexten gebruikt om informatie te verkrijgen over H 2 O2in levende cellen25,28,29.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65428/65428fig01.jpg"> Figuur 1: Ontwerp, moleculair mechanisme en excitatie/emissiespectra vande H 2 O2 biosensor mtHyPer7. (A) De mtHyPer7-sonde wordt afgeleid door circulair gepermuteerd GFP in het OxyR-RD-domein in te brengen van Neisseria meningitidis. Het bevat de mitochondriale targetingsequentie van subeenheid 9 van de ATP-synthase van Neurospora crassa (Su9). (B) Illustratie van het H 2 O2-detectiemechanismevan mtHyPer7. Oxidatie van cysteïnen in het RD-domein verhoogt de fluorescentie-emissie bij excitatie bij 488 nm en vermindert de emissie geproduceerd door excitatie bij 405 nm. (C) Excitatie- en emissiespectra van HyPer7 in geoxideerde en gereduceerde vorm. Deze figuur is overgenomen met toestemming van Pak et al.24. Afkortingen: GFP = groen fluorescerend eiwit; cpGFP = circulair gepermuteerd GFP. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65428/65428fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
Deze ratiometrische beeldvorming van mtHyPer7 biedt belangrijke voordelen voor mitochondrialeH2O2 kwantificering24,27; Het biedt een interne controle voor de sondeconcentratie. Bovendien is de verschuiving van de excitatiepiek die wordt veroorzaaktdoor blootstelling aan H2 O2 niet volledig, zelfs niet bij verzadigingsconcentraties van H2O2. Ratio-beeldvorming kan dus de gevoeligheid verhogen door twee spectrale punten in de analyse op te nemen.
De mtHyPer7-sonde die hier wordt gebruikt, heeft een zeer hoge affiniteit voor H 2 O2en een relatief lage gevoeligheid voor pH24, en is met succes gericht op Caenorhabditis elegans mitochondriën30. Dit eiwit is ook gebruikt in gist27,31. Eerdere studies waren echter gebaseerd op plasmide-gedragen expressie van mtHyPer7, wat resulteert in cel-tot-cel variabiliteit in sonde-expressie27. Bovendien werd het construct dat in dit protocol wordt beschreven, geïntegreerd in een geconserveerd, genvrij gebied op chromosoom X32 met behulp van een op CRISPR gebaseerde benadering voor markervrije integratie. De expressie van het geïntegreerde biosensorgen wordt ook gecontroleerd door de sterke constitutieve TEF1-promotor (Figuur 2). Als gevolg hiervan is er een stabielere, consistentere expressie van de biosensor in gistcelpopulaties in vergelijking met die waargenomen met behulp van plasmide-gedragen biosensorexpressie, en kunnen cellen met de biosensor worden vermeerderd zonder dat selectieve media nodig zijn.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65428/65428fig02.jpg"> Figuur 2: Generatie van mtHyPer7-expressieve cellen door CRISPR. Het Cas9- en sgRNA-bevattende plasmide (YN2_1_LT58_X2site) en PCR-geamplificeerde mtHyPer7-bevattende biosensorconstruct worden in ontluikende gistcellen geïntroduceerd door transformatie van lithiumacetaat. De genvrije insertieplaats op chromosoom X (X2) wordt herkend en geknipt door Cas9-eiwit met het sgRNA, en de biosensor wordt geïntegreerd in het genoom door homologe recombinatie. Na identificatie van de succesvolle transformanten door microscopische screening, kolonie-PCR en sequencing, wordt het Cas9-plasmide verwijderd (genezen) door groei in niet-selectieve media. Afkortingen: sgRNA = single guide RNA; TEF = transcriptieversterker. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65428/65428fig02large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
Tot slot biedt mtHyPer7 voordelen ten opzichte van andere ROS-biosensoren. Organische kleurstoffen die worden gebruikt om ROS te detecteren (bijv. dihydroethidium [DHE]2 en MitoSOX3) kunnen bijvoorbeeld ongelijkmatige of niet-specifieke kleuring veroorzaken en worden vaak geleverd in oplosmiddelen zoals ethanol of dimethylsulfoxide, waarvoor aanvullende controles op oplosmiddeleffecten nodig zijn. Een andere klasse van ROS-biosensoren zijn biosensoren op basis van fluorescentieresonantie-energieoverdracht (FRET) (bijv. Redoxfluor voor cellulaire redoxtoestand4 en de peroxidesensoren HSP-FRET5, OxyFRET 6 en PerFRET6). Deze sondes zijn genetisch gecodeerd en in principe zeer gevoelig en kunnen kwantitatief worden gericht op mitochondriën met behulp van goed gekarakteriseerde mitochondriale signaalsequenties. Er zijn echter uitdagingen bij het gebruik van FRET-gebaseerde sondes, waaronder achtergrond als gevolg van cross-excitatie en bleed-through, en strenge eisen voor de nabijheid en oriëntatie van de fluoroforen om FRET te laten optreden33,34. Bovendien bestaan FRET-sondes uit twee fluorescerende eiwitten die grotere constructen nodig hebben voor expressie in cellen van belang in vergelijking met spectra-verschuivende sondes. Het hier beschreven protocol is ontwikkeld om te profiteren van de sterke punten van de op HyPer7 gebaseerde biosensor en om deze compacte, ratiometrische, genetisch gecodeerde sonde met hoge affiniteit te gebruiken voor kwantitatieve beeldvorming van peroxide in mitochondriën in levende gist.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100x/1.45 Plan Apo Lambda objective lens</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MRD01905</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenine sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#A9126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Agar</td>
			<td>BD Difco</td>
			<td>#DF0145170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Peptone</td>
			<td>BD Difco</td>
			<td>#DF0118170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Tryptone</td>
			<td>BD Difco</td>
			<td>#DF211705</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Yeast Extract</td>
			<td>BD Difco</td>
			<td>#DF0127179</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BamHI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0136S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BglII</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0144S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbenicilin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carl Zeiss Immersol Immersion Oil</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>444960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextrose (D-(+)-Glucose)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. cloni 10G chemical competent cell</td>
			<td>Bioserch Technologies</td>
			<td>60108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIJI</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td>Schindelin et al 2012</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G418 (Geneticin)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A1720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP emission filter</td>
			<td>Chroma</td>
			<td></td>
			<td>525/50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibson assembly</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E2611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphpad Prism 7</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td></td>
			<td>https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H2O2 (stable)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H1009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HO-pGPD-mito-roGFP-KanMX6-HO</td>
			<td>Pon Lab</td>
			<td>JYE057/EP41</td>
			<td>Liao et al 20201</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator Shaker</td>
			<td>New Brunswick Scientific</td>
			<td>E24</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KAPA HiFi PCR kit</td>
			<td>Roche Sequencing and Life Science, Kapa Biosystems, Wilmington, MA</td>
			<td>KK1006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-arginine hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#A8094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>laser</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>405 and 488 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-histidine hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#H5659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-leucine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#L8912</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-lysine hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#L8662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-methionine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#M9625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-phenylalanine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#P5482</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-tryptophan</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#T8941</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-tyrosine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#T8566</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mHyPer7 plasmid</td>
			<td>This study</td>
			<td>JYE116</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope coverslips</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>3406</td>
			<td>#1.5 (170 &#181;m thickness)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>3050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MitoTracker Red CM-H2Xros</td>
			<td>ThermoFisherScientific</td>
			<td>M7513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBuilder HiFi Assembly Master Mix</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E2621</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Elements</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Microscope acquisition software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Ti Eclipse inverted microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraquat (Methyl viologen dichloride hydrate)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat. #856177&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RStudio</td>
			<td>Posit.co</td>
			<td>Free desktop version</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>BU530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stagetop incubator</td>
			<td>Tokai Hit</td>
			<td>INU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uracil</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#U1128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast nitrogen base (YNB) containing ammonium sulfate without amino acids</td>
			<td>BD Difco</td>
			<td>#DF0919073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>YN2_1_LT58_X2site</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>177705</td>
			<td>Pianale et al 2021</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zyla 4.2 sCMOS camera</td>
			<td>Andor</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging of mthyper7, a ratiometric biosensor for mitochondrial peroxide, in living yeast cells

Mitochondriale disfunctie, of functionele verandering, wordt aangetroffen bij veel ziekten en aandoeningen, waaronder neurodegeneratieve en musculoskeletale aandoeningen, kanker en normale veroudering. Hier wordt een benadering beschreven om de mitochondriale functie in levende gistcellen te beoordelen bij cellulaire en subcellulaire resoluties met behulp van een genetisch gecodeerde, minimaal invasieve, ratiometrische biosensor. De biosensor, mitochondriëngericht HyPer7 (mtHyPer7), detecteert waterstofperoxide (H 2 O2) in mitochondriën. Het bestaat uit een mitochondriale signaalsequentie die is gefuseerd met een circulair gepermuteerd fluorescerend eiwit en het H2O2-responsieve domein van een bacterieel OxyR-eiwit. De biosensor wordt gegenereerd en geïntegreerd in het gistgenoom met behulp van een CRISPR-Cas9-markervrij systeem, voor een consistentere expressie in vergelijking met door plasmiden overgedragen constructies.
mtHyPer7 is kwantitatief gericht op mitochondriën, heeft geen detecteerbaar effect op de groeisnelheid van gist of mitochondriale morfologie, en biedt een kwantitatieve uitlezing voor mitochondriaal H 2 O2 onder normale groeiomstandigheden en bij blootstelling aan oxidatieve stress. Dit protocol legt uit hoe de beeldvormingsomstandigheden kunnen worden geoptimaliseerd met behulp van een confocaal microscoopsysteem met draaiende schijf en hoe kwantitatieve analyses kunnen worden uitgevoerd met behulp van vrij beschikbare software. Deze tools maken het mogelijk om rijke spatiotemporele informatie over mitochondriën te verzamelen, zowel binnen cellen als tussen cellen in een populatie. Bovendien kan de hier beschreven workflow worden gebruikt om andere biosensoren te valideren.

Mitochondria are essential eukaryotic cellular organelles that are well known for their function in producing ATP through oxidative phosphorylation and electron transport1. In addition, mitochondria are sites for calcium storage, the synthesis of lipids, amino acids, fatty acid and iron-sulfur clusters, and signal transduction2,3. Within cells, mitochondria form a dynamic network with characteristic morphology and distribution, which varies according to cell type and metabolic state. Furthermore, although mitochondria can fuse and divide, not all the mitochondria in a cell are equivalent. Numerous studies have documented the functional heterogeneity of mitochondria within individual cells in attributes such as membrane potential and oxidative state4,5,6. This variation in mitochondrial function is due in part to damage to the organelle from mtDNA mutations (which occur at a higher rate than in nuclear DNA) and to oxidative damage by reactive oxygen species (ROS) generated both within and outside the organelle7,8,9. Damage to the organelle is mitigated by mitochondrial quality control mechanisms that repair the damage or eliminate mitochondria that are damaged beyond repair10.
Hydrogen peroxide (H2O2) is a reactive oxygen species that is a source of oxidative damage to cellular proteins, nucleic acids, and lipids. However, H2O2 also serves as a signaling molecule that regulates cellular activities through the reversible oxidation of thiols in target proteins11,12. H2O2 is produced from electrons that leak from the mitochondrial electron transport chain and by specific enzymes, such as NADPH oxidase and monoamine oxidases13,14,15,16,17,18,19,20. It is also inactivated by antioxidant systems, including those based on thioredoxin and glutathione21,22,23. Thus, analysis of mitochondrial H2O2 levels is critical for understanding the role of this metabolite in normal mitochondrial and cellular function and under conditions of oxidative stress.
The overall goal of this protocol is to detect mitochondrial H2O2 using a genetically encoded ratiometric H2O2 biosensor, HyPer7, that is targeted to the organelle (mtHyPer7). mtHyPer7 is a chimera consisting of the mitochondrial signal sequence from ATP9 (the Su9 presequence), a circularly permuted form of green fluorescent protein (GFP), and the H2O2-binding domain of the OxyR protein from Neisseria meningitidis24 (Figure 1). In circularly permuted GFP, the N- and C-termini of native GFP are fused and new termini are formed near the chromophore, which impart greater mobility to the protein and greater lability of its spectral characteristics compared to native GFP25. The interaction of mtHyPer7&#39;s OxyR domain with H2O2 is high-affinity, H2O2-selective, and leads to reversible oxidation of the conserved cysteine residues and disulfide bridge formation. Conformational changes associated with the oxidation of OxyR are transferred to the circularly permuted GFP in mtHyPer7, which results in a spectral shift in the excitation maximum of the mtHyPer7 chromophore from 405 nm in the reduced state to&#160;488 nm in the H2O2-oxidized state26. Thus, the ratio of fluorescence from mtHyPer7 in response to excitation at 488 nm versus 405 nm reflects the oxidation of the probe by H2O2.
Ideally, a biosensor should provide a real-time, absolute, quantitative readout of its target molecule. Unfortunately, however, this is not always possible in real-world measurements. In the case of oxidation sensors, such as mtHyPer7, the real-time readout is affected by the rate of reduction of the disulfide bridge. The reduction systems used by ROS biosensors differ, and these can dramatically alter probe response dynamics-as shown by the comparison of HyPer7, reduced by the thioredoxin system, and roGFP2-Tsa2&#916;CR, reduced by glutathione-in yeast cytosol27. Thus, to draw a conclusion about the relative H2O2 concentration from mtHyPer7 ratios, one must assume that the reduction system maintains a constant capacity during the experiment. Notwithstanding these considerations, HyPer7 and related probes have been used in various contexts to obtain information about H2O2 in living cells25,28,29.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65428/65428fig01.jpg" /> 
Figure 1: Design, molecular mechanism, and excitation/emission spectra of the H2O2 biosensor mtHyPer7. (A) The mtHyPer7 probe is derived by inserting circularly permuted GFP into the OxyR-RD domain from Neisseria meningitidis. It contains the mitochondrial targeting sequence from subunit 9 of the ATP synthase from Neurospora crassa (Su9). (B) Illustration of the H2O2-sensing mechanism of mtHyPer7. Oxidation of cysteines in the RD domain increases fluorescence emission upon excitation at 488 nm and decreases emission produced by excitation at 405 nm. (C) Excitation and emission spectra of HyPer7 in oxidized and reduced forms. This figure is reprinted with permission from Pak et al.24. Abbreviations: GFP = green fluorescent protein; cpGFP = circularly permuted GFP. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65428/65428fig01large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
This ratiometric imaging of mtHyPer7 offers important benefits for mitochondrial H2O2 quantitation24,27; it provides an internal control for probe concentration. In addition, the shift in excitation peak produced by H2O2 exposure is not complete, even in saturating concentrations of H2O2. Thus, ratio imaging can increase the sensitivity by incorporating two spectral points in the analysis.
The mtHyPer7 probe used here has a very high affinity for H2O2 and relatively low sensitivity to pH24, and has been successfully targeted to Caenorhabditis elegans mitochondria30. This protein has also been used in yeast27,31. However, previous studies relied on plasmid-borne expression of mtHyPer7, which results in cell-to-cell variability in probe expression27. In addition, the construct described in this protocol was integrated into a conserved, gene-free region on chromosome X32 using a CRISPR-based approach for marker-free integration. Expression of the integrated biosensor gene is also controlled by the strong constitutive TEF1 promoter (Figure 2). As a result, there is more stable, consistent expression of the biosensor in yeast cell populations compared to that observed using plasmid-borne biosensor expression, and cells bearing the biosensor can be propagated without the need for selective media.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65428/65428fig02.jpg" /> 
Figure 2: Generation of mtHyPer7-expressing cells by CRISPR. The Cas9 and sgRNA-containing plasmid (YN2_1_LT58_X2site) and PCR-amplified mtHyPer7-containing biosensor construct are introduced into budding yeast cells by lithium acetate transformation. The gene-free insertion site on chromosome X (X2) is recognized and cut by Cas9 protein with the sgRNA, and the biosensor is integrated into the genome by homologous recombination. After identification of the successful transformants by microscopic screening, colony PCR, and sequencing, the Cas9 plasmid is removed (cured) by growth in non-selective media. Abbreviations: sgRNA = single guide RNA; TEF = transcription enhancer factor. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65428/65428fig02large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
Finally, mtHyPer7 offers advantages over other ROS biosensors. For example, organic dyes used to detect ROS (e.g., dihydroethidium [DHE]2 and MitoSOX3) can produce uneven or nonspecific staining and are often delivered in solvents such as ethanol or dimethyl sulfoxide, which require additional controls for solvent effects. Another class of ROS biosensors are fluorescence resonance energy transfer (FRET)-based biosensors (e.g., Redoxfluor for cellular redox state4, and the peroxide sensors HSP-FRET5, OxyFRET6, and PerFRET6). These probes are genetically encoded and highly sensitive in principle and can be quantitatively targeted to mitochondria using well-characterized mitochondrial signal sequences. However, there are challenges in the use of FRET-based probes, including background due to cross-excitation and bleed-through, and stringent requirements for the proximity and orientation of the fluorophores for FRET to occur33,34. In addition, FRET probes consist of two fluorescent proteins that require larger constructs for expression in cells of interest compared to spectra-shifting probes. The protocol described here was developed to take advantage of the strengths of the HyPer7-based biosensor, and to use this compact, ratiometric, high-affinity, genetically encoded probe for quantitative imaging of peroxide in mitochondria in living yeast.

Auteur in de schijnwerpers: voortschrijdend mitochondriaal onderzoek - mtHyper7 Biosensor voor subcellulaire analyse 

Beeldvorming van mtHyPer7, een ratiometrische biosensor voor mitochondriaal peroxide, in levende gistcellen

Mitochondria are organelles within cells that facilitate energy mobilization, central metabolism, production of vital macromolecules, calcium storage, and signal transduction. As a result, they play a crucial role in cellular function, fitness, and lifespan control. Our research focuses on investigating the impact of mitochondria on aging using the budding yeast Saccharomyces cerevisiae as a model organism.Live cell imaging is our best tool to observe variation in mitochondrial function. Here we describe a method that utilizes a genetically encoded ratio metric spectral shifting biosensor called mitochondrial HyPer7. mtHyPer7 detects hydrogen peroxide, a reactive oxygen species, that can damage cellular constituents, but also functions as a signaling molecule in mitochondria of live cells.mtHyPer7 has a high affinity for hydrogen peroxide and low sensitivity to pH. It is integrated into the yeast genome, which results in stable and consistent expression in yeast cell populations. Finally, it is quantitatively targeted to mitochondria and has no detectable effect on cellular or mitochondrial function or fitness.Biosensors like mtHyPer7 are critical for studying mitochondrial function at subcellular resolution, for finding mechanisms underlying mitochondrial quality control, and for examining how that process affects cell fitness, feed, and lifespan. The mtHyPer7 stain provides consistent laboring in contrast to organic dyes utilized for reactive oxygen species detection. Compared to FRET-based sensors, mtHyPer7 is more compact and avoids issues such as cross-excitation and bleed through, as well as the precise positioning and the orientation requirements for FRET.

Om te bevestigen dat mtHyPer7 een geschikte sonde is om mitochondriaal H 2 O2te beoordelen, werden de lokalisatie van mtHyPer7 en het effect ervan op gistmitochondriën en celgezondheid beoordeeld. Om de targeting van mtHyPer7 te beoordelen, werden mitochondriën gekleurd met de vitale mitochondriën-specifieke kleurstof MitoTracker Red in controlegistcellen en gist die mtHyPer7 tot expressie brengen. Met behulp van MitoTracker Red-kleuring werden mitochondriën opgelost als lange buisvormige structuren die langs de moeder-knop-as waren uitgelijnd en zich ophoopten in de punt van de knop en de punt van de moedercel distaal van de knop41. De mitochondriale morfologie was vergelijkbaar in de controlecellen en de mtHyPer7-expressiecellen. Bovendien is mtHyPer7 co-gelokaliseerd met MitoTracker Roodgekleurde mitochondriën (Figuur 3A). MtHyPer7 was dus efficiënt en kwantitatief gericht op mitochondriën zonder de normale mitochondriale morfologie of distributie te beïnvloeden.
Vervolgens werden aanvullende validatie-experimenten uitgevoerd om het effect van mtHyPer7 op cellulaire fitheid en gevoeligheid voor oxidatieve stress in mitochondriën te beoordelen. De groeisnelheden van mtHyPer7-expressiecellen in rijke of synthetische op glucose gebaseerde media (respectievelijk YPD of SC) zijn vergelijkbaar met die van niet-getransformeerde wildtypecellen (Figuur 3B,D). Om de mogelijke effecten op oxidatieve stress in mitochondriën te beoordelen, werden controle- en mtHyPer7-expressieve gist behandeld met lage niveaus van paraquat, een redox-actief klein molecuul dat zich ophoopt in mitochondriën en resulteert in verhoogde superoxideniveaus in het organel24,27. Als mtHyPer7-expressie oxidatieve stress in mitochondriën induceert of mitochondriën beschermt tegen oxidatieve stress, dan zouden mtHyPer7-expressiecellen respectievelijk een verhoogde of verlaagde gevoeligheid voor paraquatbehandeling moeten vertonen. Behandeling met lage niveaus van paraquat resulteerde in een afname van de gistgroeisnelheid. Bovendien waren de groeisnelheden van wildtype en mtHyPer7-expressieve cellen in aanwezigheid van paraquat vergelijkbaar (Figuur 3C,E). Daarom veroorzaakte de expressie van de biosensor geen significante cellulaire stress in ontluikende gistcellen of veranderde de gevoeligheid van gist voor mitochondriale oxidatieve stress.
Gezien het bewijs dat mtHyPer7 geschikt is voor het bestuderen van mitochondriaal H 2 O 2 in ontluikende gist, werd getest of mtHyPer7 mitochondriale H 2 O 2 kon detecteren in wildtype gist in het midden van de logfase en veranderingen in mitochondriaal H 2 O 2 geïnduceerd door extern toegevoegde H 2 O 2. Er werd een H2O2-titratie-experimentuitgevoerd en de gemiddelde geoxideerde:gereduceerde (O/R) mtHyPer7-verhouding werd gemeten in mitochondriën.
De geautomatiseerde analysescripts produceerden verschillende uitvoerbestanden.
De beeldverhouding (ratio.tif): Een Z-stapel die bestaat uit de verhouding van de achtergrondgecorrigeerde, drempelige 488 nm- en 405 nm-stapels. Deze stapel kan in Fiji worden bekeken zonder extra verwerking; Het wordt echter aanbevolen om het contrast te verbeteren en/of de afbeelding in te kleuren zoals beschreven in protocolstap 4.3 of 5.6 voordat u de afbeelding bekijkt.
Het maskerbeeld (mask.tif): een Z-stapel die bestaat uit de drempelige mitochondriale gebieden die voor analyse worden gebruikt. Deze afbeelding moet worden gebruikt om de nauwkeurigheid van de drempelwaarde te evalueren.
De ROI's die worden gebruikt voor analyse (ROI's.zip): Wanneer dit bestand wordt geopend in Fiji, samen met de bronafbeelding, worden de ROI's over de afbeelding heen gelegd om te verwijzen naar de resultatentabel en de bronafbeelding. Elke ROI wordt hernoemd met een celnummer en ROI-nummer.
Meettabellen (NumResults.csv, DenomResults.csv, Results.csv) met de oppervlakte, het gemiddelde en de geïntegreerde dichtheid van de gedrempelde mitochondriën voor elke plak in respectievelijk de teller-, noemer- en verhoudingsafbeeldingen. In plakjes waar mitochondriën afwezig of onscherp waren, wordt NaN geregistreerd.
Een logbestand (Log.txt) waarin de opties worden gedocumenteerd die worden gebruikt voor achtergrond- en ruiscorrectie, drempelwaarden en verhoudingsberekening.
De O/R-ratio van mtHyPer7 vertoonde een dosisafhankelijke respons op de H2 O2-concentratie, die een plateau bereikte bij 1-2 mM extern toegevoegde H2O2 (Figuur 7). Verrassend genoeg was de HyPer7-ratio lager in de cellen die werden blootgesteld aan 0,1 mM H 2O2 dan in de controlecellen, hoewel dit verschil niet statistisch significant was. Een verklaring voor dit fenomeen kan een hormesereactie zijn, waarbij blootstelling aan een laag niveau van stressor stressreacties kan veroorzaken, zoals antioxiderende mechanismen, die op hun beurt de hoeveelheid ROS verlagen die door de sonde kan worden gedetecteerd. Hogere niveaus van stressoren kunnen daarentegen de interne stressreacties overweldigen en resulteren in een hogere uitlezing van HyPer7.
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65428/65428fig07.jpg"> Figuur 7: Respons van mtHyPer7 op extern toegevoegde H 2 O 2. (A) Maximale projectie van 405 nm en 488 nm geëxciteerde beelden en projectie van gemiddelde intensiteit van ratiometrische beelden van mtHyPer7 in cellen in het midden van de logfase die zijn blootgesteld aan verschillende concentraties van H 2 O 2. Pseudocolor geeft de verhouding geoxideerd:gereduceerd mtHyPer7 aan (schaal onderaan). Schaalbalk = 1 μm. De celomtrek wordt in het wit weergegeven; n > 100 cellen per aandoening. (B) Kwantificering van de verhouding mtHyPer7 geoxideerd:gereduceerd in ontluikende gistcellen die met verschillende concentraties H 2 O2zijn behandeld. De gemiddelden van vijf onafhankelijke proeven worden getoond, met verschillend gevormde en gekleurde symbolen voor elke proef. Gemiddelde ± SEM van de verhouding geoxideerd:gereduceerd mtHyPer7: 1,794 ± 0,07627 (geen behandeling), 1,357 ± 0,03295 (0,1 mM), 2,571 ± 0,3186 (0,5 mM), 6,693 ± 0,5194 (1 mM), 7,017 ± 0,1197 (2 mM). p < 0,0001 (eenrichtings-ANOVA met Tukey's meervoudige vergelijkingstest). P-waarden worden aangeduid als: ****p < 0,0001. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65428/65428fig07large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
Ten slotte toonden eerdere studies aan dat fittere mitochondriën, die meer gereduceerd zijn en minder superoxide bevatten, bij voorkeur worden overgeërfd door gistdochtercellen4, en dat cytosolische catalasen worden getransporteerd naar en geactiveerd in gistdochtercellen42,43,44,45. Deze studies documenteren de asymmetrische overerving van mitochondriën tijdens de deling van gistcellen en een rol voor dit proces in de fitheid en levensduur van dochtercellen, evenals asymmetrie in de leeftijd van moeder en dochter. Om te testen of er verschillen inH 2 O2 bestaan tussen moeders en knoppen, werd mtHyPer7 gemeten in knoppen en moedercellen. Verschillen in mitochondrialeH2O 2 werden waargenomen in gistcellen, en een subtiele maar statistisch significante afname van de uitlezing van de H 2 O2biosensor werd gedetecteerd in mitochondriën in de knop in vergelijking met die in de moedercel (Figuur 8). Deze bevindingen komen overeen met eerdere bevindingen dat mitochondriën in de knop beter beschermd zijn tegen oxidatieve stress. Ze leveren ook documentatie dat mtHyPer7 een kwantitatieve uitlezing kan geven voor mitochondriaal H 2O2 met cellulaire en subcellulaire resolutie in ontluikende gist.
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65428/65428fig08.jpg"> Figuur 8: Het mitochondrialeH2O2-niveau is lager in de dochtercel. (A) Maximale projectie van een ratiometrisch beeld van mtHyPer7 in een representatieve cel. Pseudocolor geeft de verhouding geoxideerd:gereduceerd mtHyPer7 aan (schaal onderaan). Subcellulaire verschillen in de verhouding zijn duidelijk (pijlpunten). Schaalbalk = 1 μm. Celomtrek: wit. (B) Verschil tussen de mtHyPer7-verhouding in de knop en de moedercel. Voor elke individuele cel werd de waarde van de moederverhouding afgetrokken van de waarde van de knopverhouding en uitgezet als een punt. n = 193 cellen samengevoegd uit vijf onafhankelijke experimenten, weergegeven met verschillend gekleurde symbolen voor elk experiment. Gemiddelde ± SEM van het verschil tussen de mtHyPer7-verhouding in de knop en de moedercellen: -0,04297 ± 0,01266. p = 0,0008 ( gepaarde t-toets) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65428/65428fig08large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
Aanvullende tabel S1: Stammen die in dit onderzoek zijn gebruikt. Lijst van gebruikte giststammen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65428/65428_Supplemental%20Table%201%20Strains%20used%20in%20this%20study-R2.xls" target="_blank">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>
Aanvullende tabel S2: Plasmiden gebruikt in dit onderzoek. Lijst van gebruikte plasmiden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65428/Supplemental%20Table%202%20Plasmids%20used%20in%20this%20study-R2.xls" target="_blank">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>
Aanvullende tabel S3: Primers gebruikt in dit onderzoek. Lijst van gebruikte primers. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65428/65428_Supplemental%20Table%203%20Primers%20used%20in%20this%20study-R2.xls" target="_blank">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>
Aanvullend dossier 1: Protocol voor de bouw van biosensorplasmide. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65428/65428_Yang%20et%20al%20Supp%20Protocol%202023.docx" target="_blank">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>
Aanvullend bestand 2: Scripts voor geautomatiseerde analyse. Voor elk script worden voorbeeldinvoer- en uitvoerbestanden geleverd. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65428/biosensor-supplemental-coding-files.zip" target="_blank">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Advancing Mitochondrial Research  mtHyper7 Biosensor for Subcellular Analysis at JoVE.com

Waterstofperoxide (H2O2) is zowel een bron van oxidatieve schade als een signaalmolecuul. Dit protocol beschrijft hoe mitochondriale H 2 O2kan worden gemeten met behulp van mitochondriën-gerichte HyPer7 (mtHyPer7), een genetisch gecodeerde ratiometrische biosensor, in levende gist. Het beschrijft hoe beeldvormingsomstandigheden kunnen worden geoptimaliseerd en kwantitatieve cellulaire en subcellulaire analyses kunnen worden uitgevoerd met behulp van vrij beschikbare software.

Mitochondrial dysfunction, or functional alteration, is found in many diseases and conditions, including neurodegenerative and musculoskeletal disorders, ...

Mitochondriën zijn organellen in cellen die energiemobilisatie, centraal metabolisme, productie van vitale macromoleculen, calciumopslag en signaaltransductie vergemakkelijken. Als gevolg hiervan spelen ze een cruciale rol bij de cellulaire functie, fitheid en levensduurcontrole. Ons onderzoek richt zich op het onderzoeken van de impact van mitochondriën op veroudering met behulp van de ontluikende gist Saccharomyces cerevisiae als modelorganisme.Beeldvorming van levende cellen is ons beste hulpmiddel om variatie in de mitochondriale functie te observeren. Hier beschrijven we een methode die gebruik maakt van een genetisch gecodeerde metrische spectrale verschuivende biosensor genaamd mitochondriaal HyPer7. mtHyPer7 detecteert waterstofperoxide, een reactieve zuurstofsoort, die cellulaire bestanddelen kan beschadigen, maar ook functioneert als een signaalmolecuul in mitochondriën van levende cellen.mtHyPer7 heeft een hoge affiniteit voor waterstofperoxide en een lage gevoeligheid voor pH. Het is geïntegreerd in het gistgenoom, wat resulteert in een stabiele en consistente expressie in gistcelpopulaties. Ten slotte is het kwantitatief gericht op mitochondriën en heeft het geen detecteerbaar effect op de cellulaire of mitochondriale functie of fitheid.Biosensoren zoals mtHyPer7 zijn van cruciaal belang voor het bestuderen van de mitochondriale functie bij subcellulaire resolutie, voor het vinden van mechanismen die ten grondslag liggen aan de mitochondriale kwaliteitscontrole en voor het onderzoeken hoe dat proces de celconditie, voeding en levensduur beïnvloedt. De mtHyPer7-kleuring zorgt voor consistente arbeid in tegenstelling tot organische kleurstoffen die worden gebruikt voor de detectie van reactieve zuurstofsoorten. Vergeleken met FRET-gebaseerde sensoren is mtHyPer7 compacter en vermijdt het problemen zoals cross-excitatie en bleed through, evenals de precieze positionering en de oriëntatievereisten voor FRET.

Beeldvorming van mtHyPer7, een ratiometrische biosensor voor mitochondriaal peroxide, in levende gistcellen

Abstract