Die Autoren danken Katherine Filpo Lopez für die fachkundige technische Unterstützung. Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse der National Institutes of Health (NIH) (GM122589 und AG051047) an LP unterstützt.
Für diese Studien wurde die gemeinsame Ressource für konfokale und spezialisierte Mikroskopie des Herbert Irving Comprehensive Cancer Center an der Columbia University verwendet, die zum Teil durch den NIH/NCI Cancer Center Support Grant P30CA013696 finanziert wurde.

Bildgebung von mitochondrialem Peroxid in lebenden Hefezellen mit mtHyper7

Die Autoren erklären, dass sie keine Interessenkonflikte haben.

In diesem Protokoll wird eine Methode zur Verwendung von mtHyPer7 als Biosensor zur Bestimmung von mitochondrialemH2O2in lebenden knospenden Hefezellen beschrieben. Der Biosensor wird mit einer CRISPR-basierten Methode konstruiert und ohne den Einsatz von selektierbaren Markern in eine konservierte genfreie Region im Hefegenom eingebracht. Im Vergleich zu plasmidgetragenen Biosensoren werden integrierte Biosensoren in allen Zellen und in konsistenten Konzentrationen exprimiert, was zuverlässigere Quantifizierungsergebnisse liefert. Es werden keine selektierbaren Marker verwendet, um mtHyPer7-exprimierende Zellen zu erzeugen, was die Verwendung eines breiteren Spektrums von Stammhintergründen ermöglicht und die genetische Modifikation von Biosensor-exprimierenden Zellen erleichtert. Das mtHyPer7-Protein ist korrekt auf die Mitochondrien ausgerichtet, ohne dass dies spürbare Auswirkungen auf die Morphologie, Funktion, Verteilung oder zelluläre Wachstumsraten der Mitochondrien hat. mtHyPer7 zeigt eine dosisabhängige Reaktion auf extern zugeführtesH2O2. Darüber hinaus ist mtHyPer7 in der Lage, über die Heterogenität der mitochondrialen Qualität mit subzellulärer Auflösung zu berichten. Schließlich führt die Verwendung eines konfokalen Spinning-Disk-Mikroskops im Gegensatz zur Weitfeldmikroskopie zur Abbildung von Biosensoren, die auf die Mitochondrien abzielen, zu einer geringeren Photobleichung der Fluorophore und erzeugt hochauflösende Bilder für die Analyse subzellulärer Unterschiede.
Grenzen und alternative Ansätze Diese Methode eignet sich nicht für die Bildgebung von Zellen für mehr als 10 Minuten, da die Zellen unter dem Deckglas austrocknen. Für eine längerfristige Bildgebung ist es besser, die Agar-Pad-Methode46 zu verwenden oder Zellen in einer mit SC-Medium gefüllten Kulturschale mit Glasboden zu immobilisieren.
Die Wahl des Biosensors sollte sich an der Konzentration des Ziels unter experimentellen Bedingungen orientieren. Wenn die Empfindlichkeit von HyPer7 zu hoch ist, würde eine andere HyPer-Version empfohlen werden, wie z.B. HyPer3 oder HyPerRed47,48. Es ist jedoch zu beachten, dass andere HyPer-Sonden pH-empfindlicher sind. Für eine höhere Sensitivität könnte das auf Peroxiredoxin basierende roGFP besser geeignet sein (roGFP2Tsa2ΔCR)27.
Der stationäre Oxidationszustand desH2O2-Sensorsist sowohl an die Oxidations- als auch an die Reduktionsrate gebunden. Die Oxidationsrate von Biosensoren wird hauptsächlich durchH2O2verursacht, aber die Reduktionsrate hängt von den antioxidativen Reduktionssystemen ab, die in der Zelle und im Organell aktiv sind. Es wurde gezeigt, dass HyPer7 überwiegend durch das Thioredoxin-System im Hefezytosol reduziert wird, und seine Reduktion ist schneller als die von roGFP2Tsa2ΔCR27. Daher sollten die unterschiedlichen Reduktionsmechanismen und Antwortdynamiken der Sonde bei der Interpretation von Messungen von H2O2-Biosensoren berücksichtigt werden. Insbesondere muss für die Ableitung vonH2O2-Wertenaus der Biosensorauslesung davon ausgegangen werden, dass das Reduktionssystem während des Versuchs eine konstante Kapazität aufrechterhält. Als Alternative zu den hier beschriebenen Skripten wurde eine Vielzahl anderer Software für die Analyse von Redoxsensoren49 frei zur Verfügung gestellt.
Kritische Schritte Bei jedem Biosensor ist es wichtig nachzuweisen, dass der Biosensor selbst den zu messenden Prozess nicht beeinflusst. Daher ist es wichtig, das Wachstum und die mitochondriale Morphologie von Stämmen unter jeder experimentellen Bedingung zu vergleichen. Hier wird die Morphologie der Mitochondrien mit dem MitoTracker Red beurteilt, der die Mitochondrien membranpotentialabhängig färbt. Der Vergleich der Mitochondrien in untransformierten und biosensortransformierten Zellen kann jedoch durch Färbung mit Tetramethylrhodaminmethylester (TMRM), einem alternativen mitochondrialen Vitalfarbstoff zur Messung des Membranpotenzials, oder MitoTracker Green, der Mitochondrien unabhängig vom Membranpotenzial färbt, durchgeführt werden. Wenn schädliche Auswirkungen vermutet werden, kann es hilfreich sein, das Expressionsniveau zu verringern oder die Integrationsstelle zu ändern.
Die Validierung des Dosis-Wirkungs-Verhaltens der Sonde und des Signal-Rausch-Verhältnisses der Bildgebungstechnik ist ebenfalls unerlässlich, um robuste Ergebnisse zu erhalten. Wenn die Variabilität innerhalb einer Gruppe die Variabilität zwischen den Gruppen übersteigt, werden Unterschiede schwer zu erkennen. Die Variabilität innerhalb der Gruppe kann sich aus tatsächlichen Populationsschwankungen oder aus Rauschen im Erkennungsprozess ergeben. Die wichtigsten Schritte zur Erhöhung des Signal-Rausch-Verhältnisses sind die Bilderfassung (Pixelwertbereich und Rauschen), die Hintergrundsubtraktion und die Schwellenwerte.
Auch Rauscheffekte können während der Berechnungsschritte reduziert werden. Der einfachste Ansatz besteht darin, die gewichtete mittlere Intensität aus den Verhältnisbildmessungen (Results.csv) zu berechnen, wobei jedes Pixel das lokale Verhältnis zwischen den Anregungseffizienzen darstellt. Dadurch entsteht ein "pixelweises" Verhältnis. Wenn das Bildsignal-Rausch-Verhältnis jedoch niedrig ist, können robustere Ergebnisse erzielt werden, indem die gewichtete mittlere Intensität für einen ROI sowohl im Zähler- als auch im Nennerkanal berechnet und dann das Verhältnis zwischen diesen beiden gewichteten Mittelwerten berechnet wird ("regionsweises" Verhältnis).
Um eine Schwellenwertmethode auszuwählen, müssen Sie mit dem Befehl Fiji Image | Anpassen | Auto Threshold kann verwendet werden, um alle integrierten Fiji-Methoden automatisch auszuprobieren. Um die Segmentierung (Thresholding) auszuwerten, wird eine gespeicherte Maske mit einem Klick auf Bearbeiten | Auswahl | Auswahl erstellen, dem ROI-Manager hinzufügen (durch Drücken von T) und dann für die RAW-Bilddatei aktiviert. Wenn Mitochondrien nicht ausreichend detektiert werden, sollte eine andere Segmentierungsmethode versucht werden.
Beim Vergleich von Bildern ist es wichtig, alle Bilder mit identischen Abbildungsbedingungen aufzunehmen und alle Bilder mit identischer Kontrastverstärkung anzuzeigen.
Die Bewegung der Mitochondrien muss bei der Optimierung der Bildgebungsbedingungen berücksichtigt werden. Wenn sich die Mitochondrien signifikant zwischen der Anregung bei 405 und 488 nm bewegen, ist das Verhältnisbild nicht genau. Es wird empfohlen, die Belichtungszeit <500 ms zu halten und die Anregung mit der schnellsten verfügbaren Methode (z. B. einem Triggerimpuls oder einem akusto-optischen abstimmbaren Filter) zu ändern. Beim Erfassen eines Z-Stapels sollten beide Anregungen für jeden Z-Schritt durchgeführt werden, bevor zum nächsten Z-Schritt übergegangen wird.
Für die Darstellung der Ergebnisse sind Änderungen des Farbtons (Farbe) für das menschliche Auge offensichtlicher als Änderungen der Intensität. Daher wird der Verhältniswert in eine Farbskala umgewandelt, um die visuelle Interpretation zu erleichtern. Kolorierte Bilder können unmoduliert sein, bei denen alle mitochondrialen Pixel mit der gleichen Helligkeit erscheinen, oder intensitätsmoduliert, bei denen die Pixelintensität im Originalbild verwendet wird, um die Intensitäten im kolorierten Bild festzulegen.
Modifikation und Fehlerbehebung Als Alternative zur Bestätigung der mitochondrialen Funktion durch Provokation mit Paraquat können Zellen repliziert oder in fermentierbare und nicht fermentierbare Kohlenstoffquellen inokuliert werden.
Für die Hintergrundsubtraktion ist die Rollballsubtraktion (durch Navigieren zu Verarbeiten | Hintergrund subtrahieren...) kann auch verwendet werden, um Ungleichmäßigkeit der Beleuchtung zu beseitigen. Es sollte sichergestellt werden, dass das Vorhandensein von Zellen den Hintergrund, der subtrahiert wird, nicht verändert (indem Sie die Option Hintergrund erstellen aktivieren und das Ergebnis untersuchen).
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die mtHyPer7-Sonde eine konsistente, minimal-invasive Methode zur Beziehung des morphologischen und funktionellen Status von Hefemitochondrien in lebenden Zellen darstellt und die Untersuchung eines wichtigen zellulären Stressor- und Signalmoleküls in einem genetisch behandelbaren, leicht zugänglichen Modellsystem ermöglicht.

Mitochondrien sind essentielle eukaryotische Zellorganellen, die für ihre Funktion bei der Produktion von ATP durch oxidative Phosphorylierung und Elektronentransport bekannt sind1. Darüber hinaus sind Mitochondrien Orte für die Kalziumspeicherung, die Synthese von Lipiden, Aminosäuren, Fettsäure- und Eisen-Schwefel-Clustern sowie die Signaltransduktion 2,3. Innerhalb von Zellen bilden Mitochondrien ein dynamisches Netzwerk mit charakteristischer Morphologie und Verteilung, die je nach Zelltyp und Stoffwechselzustand variiert. Obwohl Mitochondrien fusionieren und sich teilen können, sind nicht alle Mitochondrien in einer Zelle gleichwertig. Zahlreiche Studien haben die funktionelle Heterogenität von Mitochondrien innerhalb einzelner Zellen in Attributen wie Membranpotenzial und oxidativem Zustand dokumentiert 4,5,6. Diese Variation der mitochondrialen Funktion ist zum Teil auf eine Schädigung der Organelle durch mtDNA-Mutationen (die mit einer höheren Rate als in der Kern-DNA auftreten) und auf oxidative Schäden durch reaktive Sauerstoffspezies (ROS) zurückzuführen, die sowohl innerhalb als auch außerhalb der Organelle erzeugt werden 7,8,9. Die Schädigung der Organelle wird durch mitochondriale Qualitätskontrollmechanismen gemildert, die den Schaden reparieren oder unreparabel geschädigte Mitochondrien eliminieren10.
Wasserstoffperoxid (H2O2) ist eine reaktive Sauerstoffspezies, die eine Quelle oxidativer Schäden an zellulären Proteinen, Nukleinsäuren und Lipiden ist. H2O2dient jedoch auch als Signalmolekül, das zelluläre Aktivitäten durch die reversible Oxidation von Thiolen in Zielproteinenreguliert 11,12. H2O2 wird aus Elektronen hergestellt, die aus der mitochondrialen Elektronentransportkette austreten, und von spezifischen Enzymen wie der NADPH-Oxidase und den Monoaminoxidasen 13,14,15,16,17,18,19,20. Es wird auch durch antioxidative Systeme inaktiviert, einschließlich solcher, die auf Thioredoxin und Glutathion basieren21,22,23. Daher ist die Analyse der mitochondrialenH2O2-Spiegelvon entscheidender Bedeutung, um die Rolle dieses Metaboliten bei der normalen mitochondrialen und zellulären Funktion und unter Bedingungen von oxidativem Stress zu verstehen. 
Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist der Nachweis von mitochondrialemH2O2 mit einem genetisch kodierten ratiometrischenH2O2-Biosensor, HyPer7, der auf die Organelle (mtHyPer7) ausgerichtet ist. mtHyPer7 ist eine Chimäre, die aus der mitochondrialen Signalsequenz von ATP9 (der Su9-Vorsequenz), einer zirkulär permutierten Form des grün fluoreszierenden Proteins (GFP) und der H2O2-Bindungsdomäne des OxyR-Proteins aus Neisseria meningitidis24 besteht (Abbildung 1). In zirkulär permutiertem GFP werden die N- und C-Termini von nativem GFP fusioniert und neue Termini in der Nähe des Chromophors gebildet, die dem Protein eine größere Mobilität und eine größere Labilität seiner spektralen Eigenschaften im Vergleich zu nativem GFP25 verleihen. Die Wechselwirkung der OxyR-Domäne von mtHyPer7 mit H2O2 ist hochaffin, H2O2-selektivund führt zu einer reversiblen Oxidation der konservierten Cysteinreste und zur Bildung von Disulfidbrücken. Konformationsänderungen, die mit der Oxidation von OxyR assoziiert sind, werden auf das zirkulär permutierte GFP in mtHyPer7 übertragen, was zu einer spektralen Verschiebung des Anregungsmaximums des mtHyPer7-Chromophors von 405 nm im reduzierten Zustand auf 488 nm im H2O2-oxidierten Zustandführt 26. Somit spiegelt das Verhältnis der Fluoreszenz von mtHyPer7 als Reaktion auf die Anregung bei 488 nm gegenüber 405 nm die Oxidation der Sonde durchH2O2wider.
Im Idealfall sollte ein Biosensor eine absolute, quantitative Echtzeit-Ablesung seines Zielmoleküls liefern. Leider ist dies bei realen Messungen jedoch nicht immer möglich. Bei Oxidationssensoren, wie z. B. mtHyPer7, wird die Echtzeitanzeige durch die Reduktionsrate der Disulfidbrücke beeinflusst. Die von ROS-Biosensoren verwendeten Reduktionssysteme unterscheiden sich, und diese können die Dynamik der Sondenantwort dramatisch verändern - wie der Vergleich von HyPer7, das durch das Thioredoxin-System reduziert wurde, und roGFP2-Tsa2ΔCR, reduziert durch Glutathion in Hefezytosol27, zeigte. Um also aus den mtHyPer7-Verhältnisseneinen Rückschluss auf die relative H2O2-Konzentration zu ziehen, muss man davon ausgehen, dass das Reduktionssystem während des Experiments eine konstante Kapazität beibehält. Ungeachtet dieser Überlegungen wurden HyPer7 und verwandte Sonden in verschiedenen Zusammenhängen verwendet, um Informationen überH2O2in lebenden Zellen zu erhalten 25,28,29.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65428/65428fig01.jpg"> Abbildung 1: Design, molekularer Mechanismus und Anregungs-/Emissionsspektren des H2O2-Biosensors mtHyPer7. (A) Die mtHyPer7-Sonde wird durch Insertion von zirkulär permutiertem GFP in die OxyR-RD-Domäne von Neisseria meningitidis abgeleitet. Es enthält die mitochondriale Targeting-Sequenz aus der Untereinheit 9 der ATP-Synthase aus Neurospora crassa (Su9). (B) Illustration des H2O2-Sensormechanismus von mtHyPer7. Die Oxidation von Cysteinen in der RD-Domäne erhöht die Fluoreszenzemission bei Anregung bei 488 nm und verringert die durch Anregung bei 405 nm erzeugte Emission. (C) Anregungs- und Emissionsspektren von HyPer7 in oxidierter und reduzierter Form. Diese Abbildung wurde mit freundlicher Genehmigung von Pak et al.24 abgedruckt. Abkürzungen: GFP = grün fluoreszierendes Protein; cpGFP = zirkulär permutiertes GFP. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65428/65428fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
Diese ratiometrische Bildgebung von mtHyPer7 bietet wichtige Vorteile für die mitochondriale H2O2-Quantifizierung24,27; Es bietet eine interne Kontrolle für die Sondenkonzentration. Darüber hinaus ist die Verschiebung des Anregungspeaks, die durch dieH2O2-Expositionhervorgerufen wird, nicht vollständig, selbst bei Sättigungskonzentrationen vonH2O2. So kann das Ratio-Imaging die Empfindlichkeit erhöhen, indem zwei Spektralpunkte in die Analyse einbezogen werden.
Die hier verwendete mtHyPer7-Sonde hat eine sehr hohe Affinität zuH2O2und eine relativ geringe Empfindlichkeit gegenüber pH24 und wurde erfolgreich auf Caenorhabditis elegans-Mitochondrien 30 ausgerichtet. Dieses Protein wurde auch in Hefeverwendet 27,31. Frühere Studien stützten sich jedoch auf die plasmidgetragene Expression von mtHyPer7, was zu einer Variabilität der Sondenexpression von Zelle zu Zelle führt27. Darüber hinaus wurde das in diesem Protokoll beschriebene Konstrukt mit Hilfe eines CRISPR-basierten Ansatzes zur markerfreien Integration in eine konservierte, genfreie Region auf Chromosom X32 integriert. Die Expression des integrierten Biosensor-Gens wird ebenfalls durch den starken konstitutiven TEF1-Promotor gesteuert (Abbildung 2). Infolgedessen gibt es eine stabilere, konsistentere Expression des Biosensors in Hefezellpopulationen als bei der Plasmid-basierten Biosensorexpression, und Zellen, die den Biosensor tragen, können ohne die Notwendigkeit selektiver Medien vermehrt werden.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65428/65428fig02.jpg"> Abbildung 2: Generierung von mtHyPer7-exprimierenden Zellen mittels CRISPR. Das Cas9- und sgRNA-haltige Plasmid (YN2_1_LT58_X2site) und PCR-amplifizierte mtHyPer7-haltige Biosensorkonstrukt wird durch Lithiumacetat-Transformation in knospende Hefezellen eingebracht. Die genfreie Insertionsstelle auf Chromosom X (X2) wird vom Cas9-Protein mit der sgRNA erkannt und geschnitten, und der Biosensor wird durch homologe Rekombination in das Genom integriert. Nach der Identifizierung der erfolgreichen Transformanten durch mikroskopisches Screening, Kolonie-PCR und Sequenzierung wird das Cas9-Plasmid durch Wachstum in nicht-selektiven Medien entfernt (ausgehärtet). Abkürzungen: sgRNA = Single guide RNA; TEF = Transkriptionsverstärker-Faktor. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65428/65428fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
Schließlich bietet mtHyPer7 Vorteile gegenüber anderen ROS-Biosensoren. Beispielsweise können organische Farbstoffe, die zum Nachweis von ROS verwendet werden (z. B. Dihydroethidium [DHE]2 und MitoSOX3), eine ungleichmäßige oder unspezifische Färbung verursachen und werden häufig in Lösungsmitteln wie Ethanol oder Dimethylsulfoxid geliefert, die zusätzliche Kontrollen für Lösungsmitteleffekte erfordern. Eine weitere Klasse von ROS-Biosensoren sind Biosensoren auf Basis von Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfer (FRET) (z. B. Redoxfluor für den zellulären Redoxzustand4 und die Peroxidsensoren HSP-FRET5, OxyFRET 6 und PerFRET6). Diese Sonden sind genetisch kodiert und prinzipiell hochempfindlich und können mit Hilfe gut charakterisierter mitochondrialer Signalsequenzen quantitativ auf Mitochondrien ausgerichtet werden. Es gibt jedoch Herausforderungen bei der Verwendung von FRET-basierten Sonden, einschließlich des Hintergrunds aufgrund von Kreuzanregung und Durchblutung sowie strenger Anforderungen an die Nähe und Ausrichtung der Fluorophore, damit FRET auftretenkann 33,34. Darüber hinaus bestehen FRET-Sonden aus zwei fluoreszierenden Proteinen, die im Vergleich zu spektrenverschiebenden Sonden größere Konstrukte für die Expression in den interessierenden Zellen benötigen. Das hier beschriebene Protokoll wurde entwickelt, um die Stärken des HyPer7-basierten Biosensors zu nutzen und diese kompakte, ratiometrische, hochaffine, genetisch kodierte Sonde für die quantitative Bildgebung von Peroxid in Mitochondrien in lebender Hefe zu verwenden.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100x/1.45 Plan Apo Lambda objective lens</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MRD01905</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenine sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#A9126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Agar</td>
			<td>BD Difco</td>
			<td>#DF0145170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Peptone</td>
			<td>BD Difco</td>
			<td>#DF0118170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Tryptone</td>
			<td>BD Difco</td>
			<td>#DF211705</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Yeast Extract</td>
			<td>BD Difco</td>
			<td>#DF0127179</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BamHI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0136S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BglII</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0144S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbenicilin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carl Zeiss Immersol Immersion Oil</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>444960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextrose (D-(+)-Glucose)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. cloni 10G chemical competent cell</td>
			<td>Bioserch Technologies</td>
			<td>60108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIJI</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td>Schindelin et al 2012</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G418 (Geneticin)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A1720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP emission filter</td>
			<td>Chroma</td>
			<td></td>
			<td>525/50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibson assembly</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E2611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphpad Prism 7</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td></td>
			<td>https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H2O2 (stable)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H1009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HO-pGPD-mito-roGFP-KanMX6-HO</td>
			<td>Pon Lab</td>
			<td>JYE057/EP41</td>
			<td>Liao et al 20201</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator Shaker</td>
			<td>New Brunswick Scientific</td>
			<td>E24</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KAPA HiFi PCR kit</td>
			<td>Roche Sequencing and Life Science, Kapa Biosystems, Wilmington, MA</td>
			<td>KK1006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-arginine hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#A8094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>laser</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>405 and 488 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-histidine hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#H5659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-leucine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#L8912</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-lysine hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#L8662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-methionine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#M9625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-phenylalanine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#P5482</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-tryptophan</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#T8941</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-tyrosine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#T8566</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mHyPer7 plasmid</td>
			<td>This study</td>
			<td>JYE116</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope coverslips</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>3406</td>
			<td>#1.5 (170 &#181;m thickness)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>3050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MitoTracker Red CM-H2Xros</td>
			<td>ThermoFisherScientific</td>
			<td>M7513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBuilder HiFi Assembly Master Mix</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E2621</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Elements</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Microscope acquisition software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Ti Eclipse inverted microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraquat (Methyl viologen dichloride hydrate)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat. #856177&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RStudio</td>
			<td>Posit.co</td>
			<td>Free desktop version</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>BU530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stagetop incubator</td>
			<td>Tokai Hit</td>
			<td>INU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uracil</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#U1128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast nitrogen base (YNB) containing ammonium sulfate without amino acids</td>
			<td>BD Difco</td>
			<td>#DF0919073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>YN2_1_LT58_X2site</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>177705</td>
			<td>Pianale et al 2021</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zyla 4.2 sCMOS camera</td>
			<td>Andor</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging of mthyper7, a ratiometric biosensor for mitochondrial peroxide, in living yeast cells

Mitochondriale Dysfunktion oder funktionelle Veränderung tritt bei vielen Krankheiten und Zuständen auf, darunter neurodegenerative und muskuloskelettale Erkrankungen, Krebs und normales Altern. Hier wird ein Ansatz beschrieben, um die mitochondriale Funktion in lebenden Hefezellen mit zellulärer und subzellulärer Auflösung mit Hilfe eines genetisch kodierten, minimalinvasiven, ratiometrischen Biosensors zu untersuchen. Der Biosensor, der auf Mitochondrien abzielende HyPer7 (mtHyPer7), weist Wasserstoffperoxid (H2O2) in Mitochondrien nach. Es besteht aus einer mitochondrialen Signalsequenz, die mit einem zirkulär permutierten fluoreszierenden Protein fusioniert ist, und derH2O2-responsivenDomäne eines bakteriellen OxyR-Proteins. Der Biosensor wird mit einem CRISPR-Cas9-markerfreien System generiert und in das Hefegenom integriert, um eine konsistentere Expression im Vergleich zu plasmidgetragenen Konstrukten zu erreichen.
mtHyPer7 ist quantitativ auf Mitochondrien ausgerichtet, hat keinen nachweisbaren Einfluss auf die Hefewachstumsrate oder die mitochondriale Morphologie und liefert einen quantitativen Messwert für mitochondrialesH2O2unter normalen Wachstumsbedingungen und bei Exposition gegenüber oxidativem Stress. In diesem Protokoll wird erläutert, wie die Bildgebungsbedingungen mit einem konfokalen Spinning-Disk-Mikroskopsystem optimiert und quantitative Analysen mit frei verfügbarer Software durchgeführt werden können. Diese Werkzeuge ermöglichen es, umfangreiche raumzeitliche Informationen über Mitochondrien sowohl innerhalb von Zellen als auch zwischen Zellen in einer Population zu sammeln. Darüber hinaus kann der hier beschriebene Arbeitsablauf zur Validierung anderer Biosensoren verwendet werden.

Mitochondria are essential eukaryotic cellular organelles that are well known for their function in producing ATP through oxidative phosphorylation and electron transport1. In addition, mitochondria are sites for calcium storage, the synthesis of lipids, amino acids, fatty acid and iron-sulfur clusters, and signal transduction2,3. Within cells, mitochondria form a dynamic network with characteristic morphology and distribution, which varies according to cell type and metabolic state. Furthermore, although mitochondria can fuse and divide, not all the mitochondria in a cell are equivalent. Numerous studies have documented the functional heterogeneity of mitochondria within individual cells in attributes such as membrane potential and oxidative state4,5,6. This variation in mitochondrial function is due in part to damage to the organelle from mtDNA mutations (which occur at a higher rate than in nuclear DNA) and to oxidative damage by reactive oxygen species (ROS) generated both within and outside the organelle7,8,9. Damage to the organelle is mitigated by mitochondrial quality control mechanisms that repair the damage or eliminate mitochondria that are damaged beyond repair10.
Hydrogen peroxide (H2O2) is a reactive oxygen species that is a source of oxidative damage to cellular proteins, nucleic acids, and lipids. However, H2O2 also serves as a signaling molecule that regulates cellular activities through the reversible oxidation of thiols in target proteins11,12. H2O2 is produced from electrons that leak from the mitochondrial electron transport chain and by specific enzymes, such as NADPH oxidase and monoamine oxidases13,14,15,16,17,18,19,20. It is also inactivated by antioxidant systems, including those based on thioredoxin and glutathione21,22,23. Thus, analysis of mitochondrial H2O2 levels is critical for understanding the role of this metabolite in normal mitochondrial and cellular function and under conditions of oxidative stress.
The overall goal of this protocol is to detect mitochondrial H2O2 using a genetically encoded ratiometric H2O2 biosensor, HyPer7, that is targeted to the organelle (mtHyPer7). mtHyPer7 is a chimera consisting of the mitochondrial signal sequence from ATP9 (the Su9 presequence), a circularly permuted form of green fluorescent protein (GFP), and the H2O2-binding domain of the OxyR protein from Neisseria meningitidis24 (Figure 1). In circularly permuted GFP, the N- and C-termini of native GFP are fused and new termini are formed near the chromophore, which impart greater mobility to the protein and greater lability of its spectral characteristics compared to native GFP25. The interaction of mtHyPer7&#39;s OxyR domain with H2O2 is high-affinity, H2O2-selective, and leads to reversible oxidation of the conserved cysteine residues and disulfide bridge formation. Conformational changes associated with the oxidation of OxyR are transferred to the circularly permuted GFP in mtHyPer7, which results in a spectral shift in the excitation maximum of the mtHyPer7 chromophore from 405 nm in the reduced state to&#160;488 nm in the H2O2-oxidized state26. Thus, the ratio of fluorescence from mtHyPer7 in response to excitation at 488 nm versus 405 nm reflects the oxidation of the probe by H2O2.
Ideally, a biosensor should provide a real-time, absolute, quantitative readout of its target molecule. Unfortunately, however, this is not always possible in real-world measurements. In the case of oxidation sensors, such as mtHyPer7, the real-time readout is affected by the rate of reduction of the disulfide bridge. The reduction systems used by ROS biosensors differ, and these can dramatically alter probe response dynamics-as shown by the comparison of HyPer7, reduced by the thioredoxin system, and roGFP2-Tsa2&#916;CR, reduced by glutathione-in yeast cytosol27. Thus, to draw a conclusion about the relative H2O2 concentration from mtHyPer7 ratios, one must assume that the reduction system maintains a constant capacity during the experiment. Notwithstanding these considerations, HyPer7 and related probes have been used in various contexts to obtain information about H2O2 in living cells25,28,29.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65428/65428fig01.jpg" /> 
Figure 1: Design, molecular mechanism, and excitation/emission spectra of the H2O2 biosensor mtHyPer7. (A) The mtHyPer7 probe is derived by inserting circularly permuted GFP into the OxyR-RD domain from Neisseria meningitidis. It contains the mitochondrial targeting sequence from subunit 9 of the ATP synthase from Neurospora crassa (Su9). (B) Illustration of the H2O2-sensing mechanism of mtHyPer7. Oxidation of cysteines in the RD domain increases fluorescence emission upon excitation at 488 nm and decreases emission produced by excitation at 405 nm. (C) Excitation and emission spectra of HyPer7 in oxidized and reduced forms. This figure is reprinted with permission from Pak et al.24. Abbreviations: GFP = green fluorescent protein; cpGFP = circularly permuted GFP. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65428/65428fig01large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
This ratiometric imaging of mtHyPer7 offers important benefits for mitochondrial H2O2 quantitation24,27; it provides an internal control for probe concentration. In addition, the shift in excitation peak produced by H2O2 exposure is not complete, even in saturating concentrations of H2O2. Thus, ratio imaging can increase the sensitivity by incorporating two spectral points in the analysis.
The mtHyPer7 probe used here has a very high affinity for H2O2 and relatively low sensitivity to pH24, and has been successfully targeted to Caenorhabditis elegans mitochondria30. This protein has also been used in yeast27,31. However, previous studies relied on plasmid-borne expression of mtHyPer7, which results in cell-to-cell variability in probe expression27. In addition, the construct described in this protocol was integrated into a conserved, gene-free region on chromosome X32 using a CRISPR-based approach for marker-free integration. Expression of the integrated biosensor gene is also controlled by the strong constitutive TEF1 promoter (Figure 2). As a result, there is more stable, consistent expression of the biosensor in yeast cell populations compared to that observed using plasmid-borne biosensor expression, and cells bearing the biosensor can be propagated without the need for selective media.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65428/65428fig02.jpg" /> 
Figure 2: Generation of mtHyPer7-expressing cells by CRISPR. The Cas9 and sgRNA-containing plasmid (YN2_1_LT58_X2site) and PCR-amplified mtHyPer7-containing biosensor construct are introduced into budding yeast cells by lithium acetate transformation. The gene-free insertion site on chromosome X (X2) is recognized and cut by Cas9 protein with the sgRNA, and the biosensor is integrated into the genome by homologous recombination. After identification of the successful transformants by microscopic screening, colony PCR, and sequencing, the Cas9 plasmid is removed (cured) by growth in non-selective media. Abbreviations: sgRNA = single guide RNA; TEF = transcription enhancer factor. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65428/65428fig02large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
Finally, mtHyPer7 offers advantages over other ROS biosensors. For example, organic dyes used to detect ROS (e.g., dihydroethidium [DHE]2 and MitoSOX3) can produce uneven or nonspecific staining and are often delivered in solvents such as ethanol or dimethyl sulfoxide, which require additional controls for solvent effects. Another class of ROS biosensors are fluorescence resonance energy transfer (FRET)-based biosensors (e.g., Redoxfluor for cellular redox state4, and the peroxide sensors HSP-FRET5, OxyFRET6, and PerFRET6). These probes are genetically encoded and highly sensitive in principle and can be quantitatively targeted to mitochondria using well-characterized mitochondrial signal sequences. However, there are challenges in the use of FRET-based probes, including background due to cross-excitation and bleed-through, and stringent requirements for the proximity and orientation of the fluorophores for FRET to occur33,34. In addition, FRET probes consist of two fluorescent proteins that require larger constructs for expression in cells of interest compared to spectra-shifting probes. The protocol described here was developed to take advantage of the strengths of the HyPer7-based biosensor, and to use this compact, ratiometric, high-affinity, genetically encoded probe for quantitative imaging of peroxide in mitochondria in living yeast.

Autor im Rampenlicht: Advancing Mitochondrial Research - mtHyper7 Biosensor für die subzelluläre Analyse 

Bildgebung von mtHyPer7, einem ratiometrischen Biosensor für mitochondriales Peroxid, in lebenden Hefezellen

Mitochondria are organelles within cells that facilitate energy mobilization, central metabolism, production of vital macromolecules, calcium storage, and signal transduction. As a result, they play a crucial role in cellular function, fitness, and lifespan control. Our research focuses on investigating the impact of mitochondria on aging using the budding yeast Saccharomyces cerevisiae as a model organism.Live cell imaging is our best tool to observe variation in mitochondrial function. Here we describe a method that utilizes a genetically encoded ratio metric spectral shifting biosensor called mitochondrial HyPer7. mtHyPer7 detects hydrogen peroxide, a reactive oxygen species, that can damage cellular constituents, but also functions as a signaling molecule in mitochondria of live cells.mtHyPer7 has a high affinity for hydrogen peroxide and low sensitivity to pH. It is integrated into the yeast genome, which results in stable and consistent expression in yeast cell populations. Finally, it is quantitatively targeted to mitochondria and has no detectable effect on cellular or mitochondrial function or fitness.Biosensors like mtHyPer7 are critical for studying mitochondrial function at subcellular resolution, for finding mechanisms underlying mitochondrial quality control, and for examining how that process affects cell fitness, feed, and lifespan. The mtHyPer7 stain provides consistent laboring in contrast to organic dyes utilized for reactive oxygen species detection. Compared to FRET-based sensors, mtHyPer7 is more compact and avoids issues such as cross-excitation and bleed through, as well as the precise positioning and the orientation requirements for FRET.

Um zu bestätigen, dass mtHyPer7 eine geeignete Sonde zur Beurteilung des mitochondrialenH2O2ist, wurde die Lokalisation von mtHyPer7 und seine Wirkung auf die Hefemitochondrien und die Zellgesundheit untersucht. Um das Targeting von mtHyPer7 zu untersuchen, wurden Mitochondrien mit dem lebenswichtigen Mitochondrien-spezifischen Farbstoff MitoTracker Red in Kontrollhefezellen und Hefen, die mtHyPer7 exprimieren, gefärbt. Mit Hilfe der MitoTracker Red-Färbung wurden Mitochondrien als lange röhrenförmige Strukturen aufgelöst, die entlang der Mutter-Knospen-Achse ausgerichtet waren und sich in der Spitze der Knospe und der Spitze der Mutterzelle distal der Knospe ansammelten41. Die mitochondriale Morphologie war in den Kontroll- und mtHyPer7-exprimierenden Zellen ähnlich. Darüber hinaus kolokalisierte mtHyPer7 mit MitoTracker Rot-gefärbten Mitochondrien (Abbildung 3A). Auf diese Weise wurde mtHyPer7 effizient und quantitativ auf Mitochondrien ausgerichtet, ohne die normale Morphologie oder Verteilung der Mitochondrien zu beeinträchtigen.
Als nächstes wurden zusätzliche Validierungsexperimente durchgeführt, um die Wirkung von mtHyPer7 auf die zelluläre Fitness und die Empfindlichkeit gegenüber oxidativem Stress in den Mitochondrien zu bewerten. Die Wachstumsraten von mtHyPer7-exprimierenden Zellen in reichhaltigen oder synthetischen glukosebasierten Medien (YPD bzw. SC) ähneln denen von untransformierten Wildtyp-Zellen (Abbildung 3B,D). Um die möglichen Auswirkungen auf oxidativen Stress in den Mitochondrien zu untersuchen, wurden Kontroll- und mtHyPer7-exprimierende Hefe mit niedrigen Konzentrationen von Paraquat behandelt, einem redoxaktiven kleinen Molekül, das sich in den Mitochondrien anreichert und zu erhöhten Superoxidspiegeln in der Organelle führt24,27. Wenn die mtHyPer7-Expression entweder oxidativen Stress in den Mitochondrien induziert oder die Mitochondrien vor oxidativem Stress schützt, dann sollten mtHyPer7-exprimierende Zellen eine erhöhte bzw. verminderte Empfindlichkeit gegenüber der Behandlung mit Paraquat aufweisen. Die Behandlung mit niedrigen Paraquat-Konzentrationen führte zu einer Abnahme der Hefewachstumsraten. Darüber hinaus waren die Wachstumsraten von Wildtyp- und mtHyPer7-exprimierenden Zellen in Gegenwart von Paraquat ähnlich (Abbildung 3C,E). Daher erzeugte die Expression des Biosensors keinen signifikanten zellulären Stress in knospenden Hefezellen oder veränderte die Empfindlichkeit der Hefe gegenüber mitochondrialem oxidativem Stress.
Angesichts der Evidenz, dass mtHyPer7 für die Untersuchung von mitochondrialem H2O2 in knospender Hefe geeignet ist, wurde getestet, ob mtHyPer7 mitochondriales H2O2 in Wildtyp-Hefen in der mittleren logarithmischen Phase und Veränderungen des mitochondrialen H2O2 nachweisen kann, die durch extern zugesetztesH2O2 induziert werden. Es wurde einH2O2-Titrationsexperiment durchgeführt und das mittlere Verhältnis von oxidiertem zu reduziertem (O/R) mtHyPer7 in Mitochondrien gemessen.
Die automatisierten Analyseskripte erzeugten mehrere Ausgabedateien.
Das Verhältnisbild (ratio.tif): Ein Z-Stapel, der aus dem Verhältnis der hintergrundkorrigierten, schwelligen 488-nm- und 405-nm-Stapel besteht. Dieser Stapel kann in Fidschi ohne zusätzliche Verarbeitung angezeigt werden. Es wird jedoch empfohlen, den Kontrast zu verstärken und/oder das Bild vor dem Betrachten zu kolorieren, wie in Protokollschritt 4.3 oder 5.6 beschrieben.
Das Maskenbild (mask.tif): Ein Z-Stapel, der aus den für die Analyse verwendeten mitochondrialen Bereichen mit Schwellenwerten besteht. Dieses Bild muss verwendet werden, um die Genauigkeit des Schwellenwerts zu bewerten.
Die für die Analyse verwendeten ROIs (ROIs.zip): Wenn diese Datei zusammen mit dem Quellbild in Fidschi geöffnet wird, werden die ROIs dem Bild überlagert, um Querverweise auf die Ergebnistabelle und das Quellbild zu erstellen. Jeder ROI wird mit einer Zellennummer und einer ROI-Nummer umbenannt.
Messtabellen (NumResults.csv, DenomResults.csv, Results.csv), die die Fläche, den Mittelwert und die integrierte Dichte der Mitochondrien mit Schwellenwert für jede Schicht in den Zähler-, Nenner- bzw. Verhältnisbildern enthalten. In Schichten, in denen Mitochondrien fehlten oder unscharf waren, wird NaN aufgezeichnet.
Eine Protokolldatei (Log.txt), in der die Optionen für die Hintergrund- und Rauschkorrektur, die Schwellenwerte und die Verhältnisberechnung dokumentiert sind.
Das O/R-Verhältnis von mtHyPer7 zeigte eine dosisabhängige Reaktion auf dieH2O2-Konzentration, die bei 1-2 mM extern zugegebenem H2O2 ein Plateau erreichte (Abbildung 7). Überraschenderweise war das HyPer7-Verhältnis in den Zellen, die bei 0,1 mMH2O2exponiert wurden, niedriger als in den Kontrollzellen, obwohl dieser Unterschied statistisch nicht signifikant war. Eine Erklärung für dieses Phänomen könnte eine Hormesis-Reaktion sein, bei der die Exposition gegenüber einem niedrigen Stressorniveau Stressreaktionen hervorrufen kann, wie z. B. antioxidative Mechanismen, die wiederum die Menge an ROS senken, die von der Sonde nachgewiesen werden kann. Im Gegensatz dazu können höhere Stressoren die internen Stressreaktionen überwältigen und zu einem höheren Messwert von HyPer7 führen.
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65428/65428fig07.jpg"> Abbildung 7: Reaktion von mtHyPer7 auf extern zugesetztesH2O2. (A) Maximale Projektion von 405 nm und 488 nm angeregten Bildern und durchschnittliche Intensitätsprojektion von ratiometrischen Bildern von mtHyPer7 in Zellen der mittleren logarithmischen Phase, die bei unterschiedlichen Konzentrationen von H2O2 exponiert wurden. Die Pseudofarbe zeigt das Verhältnis von oxidiertem zu reduziertem mtHyPer7 an (Skala unten). Maßstabsleiste = 1 μm. Der Zellenumriss wird in Weiß dargestellt. n > 100 Zellen pro Bedingung. (B) Quantifizierung des Verhältnisses von mtHyPer7 oxidiert zu reduziert in knospenden Hefezellen, die mit unterschiedlichen Konzentrationen vonH2O2 behandelt wurden. Die Mittelwerte von fünf unabhängigen Versuchen werden gezeigt, mit unterschiedlich geformten und farbigen Symbolen für jeden Versuch. Mittlerer ± SEM des Verhältnisses von oxidiertem:reduziertem mtHyPer7: 1,794 ± 0,07627 (keine Behandlung), 1,357 ± 0,03295 (0,1 mM), 2,571 ± 0,3186 (0,5 mM), 6,693 ± 0,5194 (1 mM), 7,017 ± 0,1197 (2 mM). p < 0,0001 (unidirektionale ANOVA mit dem Tukey-Mehrfachvergleichstest). p-Werte werden wie folgt bezeichnet: ****p < 0,0001. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65428/65428fig07large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
Schließlich zeigten frühere Studien, dass fittere Mitochondrien, die reduzierter sind und weniger Superoxid enthalten, bevorzugt von Hefe-Tochterzellen vererbt werden4 und dass zytosolische Katalasen zu Hefe-Tochterzellen transportiert und dort aktiviert werden42,43,44,45. Diese Studien dokumentieren die asymmetrische Vererbung von Mitochondrien während der Hefezellteilung und eine Rolle dieses Prozesses bei der Fitness und Lebensdauer von Tochterzellen sowie bei der Altersasymmetrie zwischen Mutter und Tochter. Um zu testen, ob Unterschiede inH2O2zwischen Müttern und Knospen bestehen, wurde mtHyPer7 in Knospen und Mutterzellen gemessen. Innerhalb der Hefezellenwurden Unterschiede in der mitochondrialen H2O2-Ablesung beobachtet, und eine subtile, aber statistisch signifikante Abnahme derH2O2-Biosensor-Ablesungwurde in den Mitochondrien in der Knospe im Vergleich zu denen in der Mutterzelle festgestellt (Abbildung 8). Diese Ergebnisse stimmen mit früheren Erkenntnissen überein, dass Mitochondrien in der Knospe besser vor oxidativem Stress geschützt sind. Sie dokumentieren auch, dass mtHyPer7 eine quantitative Ablesung für mitochondriales H2O2 mit zellulärer und subzellulärer Auflösung in knospenden Hefen liefern kann.
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65428/65428fig08.jpg"> Abbildung 8: Der mitochondrialeH2O2-Spiegelist in der Tochterzelle niedriger. (A) Maximale Projektion eines ratiometrischen Bildes von mtHyPer7 in einer repräsentativen Zelle. Die Pseudofarbe zeigt das Verhältnis von oxidiertem zu reduziertem mtHyPer7 an (Skala unten). Subzelluläre Unterschiede im Verhältnis sind erkennbar (Pfeilspitzen). Maßstabsleiste = 1 μm. Zellenumriss: weiß. (B) Differenz zwischen dem mtHyPer7-Verhältnis in der Knospe und der Mutterzelle. Für jede einzelne Zelle wurde der Wert des Mutterverhältnisses vom Wert des Knospenverhältnisses subtrahiert und als Punkt aufgetragen. n = 193 Zellen, die aus fünf unabhängigen Experimenten gepoolt wurden, dargestellt mit unterschiedlich farbigen Symbolen für jedes Experiment. Mittelwert ± SEM der Differenz zwischen dem mtHyPer7-Verhältnis in der Knospen- und Mutterzelle: -0,04297 ± 0,01266. p = 0,0008 (gepaarter t-Test) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65428/65428fig08large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
Ergänzende Tabelle S1: In dieser Studie verwendete Stämme. Liste der verwendeten Hefestämme. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65428/65428_Supplemental%20Table%201%20Strains%20used%20in%20this%20study-R2.xls" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>
Ergänzende Tabelle S2: In dieser Studie verwendete Plasmide. Liste der verwendeten Plasmide. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65428/Supplemental%20Table%202%20Plasmids%20used%20in%20this%20study-R2.xls" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>
Ergänzende Tabelle S3: In dieser Studie verwendete Primer. Liste der verwendeten Primer. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65428/65428_Supplemental%20Table%203%20Primers%20used%20in%20this%20study-R2.xls" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>
Ergänzende Datei 1: Protokoll für die Konstruktion von Biosensor-Plasmiden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65428/65428_Yang%20et%20al%20Supp%20Protocol%202023.docx" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>
Ergänzende Datei 2: Skripte für die automatisierte Analyse. Für jedes Skript werden Beispieleingabedateien und Ausgabedateien bereitgestellt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65428/biosensor-supplemental-coding-files.zip" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Advancing Mitochondrial Research  mtHyper7 Biosensor for Subcellular Analysis at JoVE.com

Wasserstoffperoxid (H2O2) ist sowohl eine Quelle oxidativer Schäden als auch ein Signalmolekül. Dieses Protokoll beschreibt, wie mitochondrialesH2O2mit Hilfe von HyPer7 (mtHyPer7), einem genetisch kodierten ratiometrischen Biosensor, in lebender Hefe gemessen werden kann. Es wird beschrieben, wie die Bildgebungsbedingungen optimiert und quantitative zelluläre und subzelluläre Analysen mit frei verfügbarer Software durchgeführt werden können.

Mitochondrial dysfunction, or functional alteration, is found in many diseases and conditions, including neurodegenerative and musculoskeletal disorders, ...

Mitochondrien sind Organellen innerhalb von Zellen, die die Energiemobilisierung, den zentralen Stoffwechsel, die Produktion lebenswichtiger Makromoleküle, die Kalziumspeicherung und die Signaltransduktion erleichtern. Infolgedessen spielen sie eine entscheidende Rolle bei der Zellfunktion, der Fitness und der Kontrolle der Lebensspanne. Unsere Forschung konzentriert sich auf die Untersuchung des Einflusses von Mitochondrien auf das Altern anhand der knospenden Hefe Saccharomyces cerevisiae als Modellorganismus.Die Bildgebung lebender Zellen ist unser bestes Werkzeug, um Variationen in der mitochondrialen Funktion zu beobachten. Hier beschreiben wir eine Methode, die einen genetisch kodierten metrischen Spektralverschiebungs-Biosensor namens mitochondrialer HyPer7 verwendet. mtHyPer7 detektiert Wasserstoffperoxid, eine reaktive Sauerstoffspezies, die zelluläre Bestandteile schädigen kann, aber auch als Signalmolekül in Mitochondrien lebender Zellen fungiert.mtHyPer7 hat eine hohe Affinität zu Wasserstoffperoxid und eine geringe Empfindlichkeit gegenüber dem pH-Wert. Es ist in das Hefegenom integriert, was zu einer stabilen und konsistenten Expression in Hefezellpopulationen führt. Schließlich ist es quantitativ auf die Mitochondrien ausgerichtet und hat keine nachweisbare Wirkung auf die zelluläre oder mitochondriale Funktion oder Fitness.Biosensoren wie mtHyPer7 sind entscheidend für die Untersuchung der mitochondrialen Funktion in subzellulärer Auflösung, für die Suche nach Mechanismen, die der mitochondrialen Qualitätskontrolle zugrunde liegen, und für die Untersuchung, wie sich dieser Prozess auf die Zellfitness, die Ernährung und die Lebensdauer auswirkt. Die mtHyPer7-Färbung bietet im Gegensatz zu organischen Farbstoffen, die für den Nachweis reaktiver Sauerstoffspezies verwendet werden, eine konsistente Arbeit. Im Vergleich zu FRET-basierten Sensoren ist mtHyPer7 kompakter und vermeidet Probleme wie Quererregung und Durchbluten sowie die präzise Positionierung und die Orientierungsanforderungen für FRET.

Bildgebung von mtHyPer7, einem ratiometrischen Biosensor für mitochondriales Peroxid, in lebenden Hefezellen

Abstract