Gli autori ringraziano Katherine Filpo Lopez per l'assistenza tecnica esperta. Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni del National Institutes of Health (NIH) (GM122589 e AG051047) a LP.
Questi studi hanno utilizzato la risorsa condivisa di microscopia confocale e specializzata dell'Herbert Irving Comprehensive Cancer Center della Columbia University, finanziata in parte attraverso il NIH/NCI Cancer Center Support Grant P30CA013696.

Imaging del perossido mitocondriale in cellule di lievito viventi utilizzando mtHyper7

Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.

In questo protocollo, viene descritto un metodo per l'utilizzo di mtHyPer7 come biosensore per valutare l'H 2O2 mitocondriale in cellule di lievito viventi in gemmazione. Il biosensore è costruito utilizzando un metodo basato su CRISPR e introdotto in una regione gene-free conservata nel genoma del lievito senza l'uso di marcatori selezionabili. Rispetto ai biosensori a base di plasmidi, quelli integrati sono espressi in tutte le cellule e a livelli coerenti, fornendo risultati di quantificazione più affidabili. Non vengono utilizzati marcatori selezionabili per generare cellule che esprimono mtHyPer7, il che consente l'uso di una gamma più ampia di background di ceppi e facilita la modificazione genetica delle cellule che esprimono biosensori. La proteina mtHyPer7 è correttamente indirizzata ai mitocondri senza effetti evidenti sulla morfologia mitocondriale, sulla funzione, sulla distribuzione o sui tassi di crescita cellulare. mtHyPer7 mostra una risposta dose-dipendente all'aggiunta esterna di H2 O2 . Inoltre, mtHyPer7 è in grado di riportare l'eterogeneità della qualità mitocondriale con risoluzione subcellulare. Infine, l'utilizzo di un microscopio confocale a disco rotante rispetto alla microscopia ad ampio campo per l'imaging di biosensori mirati ai mitocondri provoca meno fotosbiancamento dei fluorofori e genera immagini ad alta risoluzione per l'analisi delle differenze subcellulari.
Limiti e approcci alternativi Questo metodo non è adatto per l'imaging di cellule per più di 10 minuti, poiché le cellule si asciugheranno sotto il vetrino coprioggetto. Per l'imaging a lungo termine, è meglio utilizzare il metodo46 del tampone di agar o immobilizzare le cellule in una piastra di coltura con fondo di vetro riempita con terreno SC.
La scelta del biosensore deve essere guidata dalla concentrazione del bersaglio in condizioni sperimentali. Se la sensibilità di HyPer7 è troppo alta, si consiglia una versione diversa di HyPer, come HyPer3 o HyPerRed47,48. Tuttavia, va notato che altre sonde HyPer sono più sensibili al pH. Per una maggiore sensibilità, potrebbe essere più appropriata la roGFP a base di perossiredossina (roGFP2Tsa2ΔCR)27.
Lo stato stazionario di ossidazione del sensore H 2 O2è legato sia ai tassi di ossidazione che a quelli di riduzione. Il tasso di ossidazione dei biosensori è causato principalmente daH 2 O2 , ma il tasso di riduzione dipende dai sistemi di riduzione antiossidante attivi nella cellula e nell'organello. È stato dimostrato che HyPer7 è prevalentemente ridotto dal sistema della tioredossina nel citosol del lievito e la sua riduzione è più rapida di quella di roGFP2Tsa2ΔCR27. Pertanto, i diversi meccanismi di riduzione e le dinamiche di risposta della sonda dovrebbero essere presi in considerazione quando si interpretanole misurazioni dei biosensori H 2 O2. In particolare, per dedurre i livelli di H 2 O2dalla lettura del biosensore, si deve presumere che il sistema di riduzione mantenga una capacità costante durante l'esperimento. In alternativa agli script qui descritti, è stata resa disponibile gratuitamente una varietà di altri software per l'analisi dei sensori redox49.
Passaggi critici Con qualsiasi biosensore, è fondamentale dimostrare che il biosensore stesso non influisce sul processo misurato. Pertanto, è importante confrontare la crescita e la morfologia mitocondriale dei ceppi in ciascuna condizione sperimentale. In questo caso, la morfologia mitocondriale viene valutata utilizzando MitoTracker Red, che colora i mitocondri in modo dipendente dal potenziale di membrana. Tuttavia, il confronto dei mitocondri nelle cellule non trasformate e trasformate in biosensori può essere realizzato colorando con tetrametilrodammina estere metilico (TMRM), un colorante vitale mitocondriale alternativo sensibile al potenziale di membrana, o MitoTracker Green, che colora i mitocondri indipendentemente dal potenziale di membrana. Se si sospettano effetti deleteri, può essere utile ridurre il livello di espressione o modificare il sito di integrazione.
Anche la convalida del comportamento dose-risposta della sonda e il rapporto segnale/rumore della tecnica di imaging sono essenziali per raccogliere risultati affidabili. Se la variabilità all'interno di un gruppo supera la variabilità tra i gruppi, le differenze diventano difficili da rilevare. La variabilità intragruppo può derivare da una reale variazione della popolazione o dal rumore nel processo di rilevamento. I passaggi chiave per aumentare il rapporto segnale/rumore sono l'acquisizione dell'immagine (intervallo di valori dei pixel e rumore), la sottrazione dello sfondo e la soglia.
Gli effetti del rumore possono anche essere ridotti durante le fasi di calcolo. L'approccio più semplice consiste nel calcolare l'intensità media ponderata dalle misurazioni dell'immagine del rapporto (Risultati.csv), dove ogni pixel rappresenta il rapporto locale tra le efficienze di eccitazione. Questo produce un rapporto "pixelwise". Tuttavia, se il rapporto segnale/rumore dell'immagine è basso, è possibile ottenere risultati più affidabili calcolando l'intensità media ponderata per un ROI sia nel canale del numeratore che in quello del denominatore, e quindi calcolando il rapporto tra queste due medie ponderate (rapporto "regionwise").
Per selezionare un metodo di soglia, il comando Figi Immagine | Regola | Auto Threshold può essere utilizzato per provare automaticamente tutti i metodi Fiji incorporati. Per valutare la segmentazione (soglia), una maschera salvata viene convertita in una selezione facendo clic su Modifica | Selezione | Crea selezione, aggiunto a ROI Manager (premendo T) e quindi attivato sul file immagine raw. Se i mitocondri non vengono rilevati adeguatamente, è necessario tentare un metodo di segmentazione diverso.
Quando si confrontano le immagini, è essenziale acquisire tutte le immagini con condizioni di imaging identiche, nonché visualizzare tutte le immagini con un miglioramento del contrasto identico.
Il movimento mitocondriale deve essere preso in considerazione quando si ottimizzano le condizioni di imaging. Se i mitocondri si muovono in modo significativo tra l'eccitazione a 405 e 488 nm, l'immagine del rapporto non sarà accurata. Si consiglia di mantenere il tempo di esposizione <500 ms e di modificare l'eccitazione con il metodo più veloce disponibile (ad es. un impulso di trigger o un filtro sintonizzabile acusto-ottico). Quando si acquisisce una pila Z, entrambe le eccitazioni devono essere eseguite per ogni fase Z prima di passare alla fase Z successiva.
Per la visualizzazione dei risultati, i cambiamenti di tonalità (colore) sono più evidenti all'occhio umano rispetto ai cambiamenti di intensità. Pertanto, il valore del rapporto viene convertito in una scala di colori per facilitare l'interpretazione visiva. Le immagini colorate possono essere non modulate, in cui tutti i pixel mitocondriali appaiono alla stessa luminosità, o modulate in intensità, in cui l'intensità dei pixel nell'immagine originale viene utilizzata per impostare le intensità nell'immagine colorata.
Modifica e risoluzione dei problemi In alternativa alla conferma della funzione mitocondriale mediante la sfida con il paraquat, le cellule possono essere replicate o inoculate in fonti di carbonio fermentabili e non fermentabili.
Per la sottrazione di sfondo, la sottrazione di sfere rotolanti (passando a Elaborazione | Sottrai sfondo...) Può anche essere utilizzato per rimuovere la non uniformità dell'illuminazione. È necessario assicurarsi che la presenza di celle non alteri lo sfondo sottratto (selezionando l'opzione Crea sfondo ed esaminando il risultato).
In sintesi, la sonda mtHyPer7 fornisce un metodo coerente e minimamente invasivo per mettere in relazione lo stato morfologico e funzionale dei mitocondri del lievito nelle cellule viventi e consente lo studio di un importante fattore di stress cellulare e molecola di segnalazione in un sistema modello geneticamente trattabile e facilmente accessibile.

I mitocondri sono organelli cellulari eucariotici essenziali ben noti per la loro funzione nella produzione di ATP attraverso la fosforilazione ossidativa e il trasporto di elettroni1. Inoltre, i mitocondri sono siti per l'immagazzinamento del calcio, la sintesi di lipidi, amminoacidi, acidi grassi e cluster ferro-zolfo e la trasduzione del segnale 2,3. All'interno delle cellule, i mitocondri formano una rete dinamica con morfologia e distribuzione caratteristiche, che varia a seconda del tipo di cellula e dello stato metabolico. Inoltre, sebbene i mitocondri possano fondersi e dividersi, non tutti i mitocondri di una cellula sono equivalenti. Numerosi studi hanno documentato l'eterogeneità funzionale dei mitocondri all'interno delle singole cellule in attributi quali il potenziale di membrana e lo stato ossidativo 4,5,6. Questa variazione nella funzione mitocondriale è dovuta in parte al danno all'organello da mutazioni del mtDNA (che si verificano a un tasso più elevato rispetto al DNA nucleare) e al danno ossidativo da specie reattive dell'ossigeno (ROS) generate sia all'interno che all'esterno dell'organello 7,8,9. Il danno all'organello è mitigato da meccanismi di controllo della qualità mitocondriale che riparano il danno o eliminano i mitocondri danneggiati in modo irreparabile10.
Il perossido di idrogeno (H 2 O2 ) è una specie reattiva dell'ossigeno che è fonte di danno ossidativo alle proteine cellulari, agli acidi nucleici e ai lipidi. Tuttavia, H 2 O2funge anche da molecola di segnalazione che regola le attività cellulari attraverso l'ossidazione reversibile dei tioli nelle proteine bersaglio11,12. H2 O2 è prodotto da elettroni che fuoriescono dalla catena di trasporto degli elettroni mitocondriali e da enzimi specifici, come la NADPH ossidasi e le monoamino ossidasi 13,14,15,16,17,18,19,20. È anche inattivato da sistemi antiossidanti, compresi quelli a base di tioredossina e glutatione21,22,23. Pertanto, l'analisi dei livelli mitocondriali di H 2 O2è fondamentale per comprendere il ruolo di questo metabolita nella normale funzione mitocondriale e cellulare e in condizioni di stress ossidativo.
L'obiettivo generale di questo protocollo è quello di rilevare l'H 2O 2 mitocondriale utilizzando un biosensore raziometrico H2O2 geneticamente codificato, HyPer7, mirato all'organello (mtHyPer7). mtHyPer7 è una chimera costituita dalla sequenza del segnale mitocondriale di ATP9 (la presequenza Su9), una forma circolarmente permutata di proteina fluorescente verde (GFP), e dal dominio di legameH 2 O2 della proteina OxyR di Neisseria meningitidis24 (Figura 1). Nella GFP permutata circolarmente, i termini N e C della GFP nativa si fondono e si formano nuovi termini vicino al cromoforo, che conferiscono una maggiore mobilità alla proteina e una maggiore labilità delle sue caratteristiche spettrali rispetto alla GFP25 nativa. L'interazione del dominio OxyR di mtHyPer7 con H 2 O2 è ad alta affinità, H 2 O 2selettiva e porta all'ossidazione reversibile dei residui di cisteina conservati e alla formazione di ponti disolfuro. I cambiamenti conformazionali associati all'ossidazione di OxyR vengono trasferiti alla GFP permutata circolarmente in mtHyPer7, il che si traduce in uno spostamento spettrale nel massimo di eccitazione del cromoforo mtHyPer7 da 405 nm nello stato ridotto a 488 nm nello stato H 2 O2-ossidato 26. Pertanto, il rapporto di fluorescenza da mtHyPer7 in risposta all'eccitazione a 488 nm rispetto a 405 nm riflette l'ossidazione della sonda da parte di H 2 O2.
Idealmente, un biosensore dovrebbe fornire una lettura quantitativa in tempo reale, assoluta e quantitativa della sua molecola bersaglio. Purtroppo, però, questo non è sempre possibile nelle misurazioni del mondo reale. Nel caso di sensori di ossidazione, come mtHyPer7, la lettura in tempo reale è influenzata dalla velocità di riduzione del ponte disolfuro. I sistemi di riduzione utilizzati dai biosensori ROS differiscono e possono alterare drasticamente la dinamica di risposta della sonda, come dimostrato dal confronto tra HyPer7, ridotto dal sistema della tioredossina, e roGFP2-Tsa2ΔCR, ridotto dal glutatione nel citosol27 del lievito. Quindi, per trarre una conclusione sulla concentrazione relativa diH 2 O2 dai rapporti mtHyPer7, si deve assumere che il sistema di riduzione mantenga una capacità costante durante l'esperimento. Nonostante queste considerazioni, HyPer7 e le relative sonde sono state utilizzate in vari contesti per ottenere informazioni su H 2 O2nelle cellule viventi 25,28,29.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65428/65428fig01.jpg"> Figura 1: Progettazione, meccanismo molecolare e spettri di eccitazione/emissione del biosensore H 2 O2 mtHyPer7. (A) La sonda mtHyPer7 è derivata inserendo GFP permutata circolarmente nel dominio OxyR-RD di Neisseria meningitidis. Contiene la sequenza di targeting mitocondriale della subunità 9 dell'ATP sintasi di Neurospora crassa (Su9). (B) Illustrazione del meccanismo di rilevamento H 2 O2di mtHyPer7. L'ossidazione delle cisteine nel dominio RD aumenta l'emissione di fluorescenza all'eccitazione a 488 nm e diminuisce l'emissione prodotta dall'eccitazione a 405 nm. (C) Spettri di eccitazione e di emissione di HyPer7 in forme ossidate e ridotte. Questa figura è ristampata con il permesso di Pak et al.24. Abbreviazioni: GFP = proteina fluorescente verde; cpGFP = GFP permutata circolarmente. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65428/65428fig01large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Questo imaging raziometrico di mtHyPer7 offre importanti vantaggi per la quantificazione mitocondriale di H 2 O224,27; Fornisce un controllo interno per la concentrazione della sonda. Inoltre, lo spostamento del picco di eccitazione prodotto dall'esposizionea H 2 O 2 non è completo, anche in concentrazioni saturanti di H 2 O 2. Pertanto, l'imaging del rapporto può aumentare la sensibilità incorporando due punti spettrali nell'analisi.
La sonda mtHyPer7 utilizzata qui ha un'affinità molto elevata per H2 O2 e una sensibilità relativamente bassa al pH24 ed è stata indirizzata con successo ai mitocondri30 di Caenorhabditis elegans. Questa proteina è stata utilizzata anche nel lievito27,31. Tuttavia, studi precedenti si basavano sull'espressione plasmatica di mtHyPer7, che si traduce in variabilità da cellula a cellula nell'espressione della sonda27. Inoltre, il costrutto descritto in questo protocollo è stato integrato in una regione conservata e priva di geni sul cromosoma X32 utilizzando un approccio basato su CRISPR per l'integrazione senza marcatori. L'espressione del gene biosensore integrato è controllata anche dal forte promotore costitutivo di TEF1 (Figura 2). Di conseguenza, c'è un'espressione più stabile e coerente del biosensore nelle popolazioni di cellule di lievito rispetto a quella osservata utilizzando l'espressione del biosensore trasmessa da plasmidi e le cellule che portano il biosensore possono essere propagate senza la necessità di terreni selettivi.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65428/65428fig02.jpg"> Figura 2: Generazione di cellule che esprimono mtHyPer7 mediante CRISPR. Il costrutto del biosensore contenente Cas9 e plasmide contenente sgRNA (YN2_1_LT58_X2site) e mtHyPer7 amplificato con PCR viene introdotto nelle cellule di lievito in gemmazione mediante trasformazione in acetato di litio. Il sito di inserzione privo di geni sul cromosoma X (X2) viene riconosciuto e tagliato dalla proteina Cas9 con l'sgRNA e il biosensore viene integrato nel genoma mediante ricombinazione omologa. Dopo l'identificazione dei trasformanti di successo mediante screening microscopico, PCR delle colonie e sequenziamento, il plasmide Cas9 viene rimosso (curato) mediante crescita in terreni non selettivi. Abbreviazioni: sgRNA = RNA guida singola; TEF = fattore di potenziamento della trascrizione. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65428/65428fig02large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Infine, mtHyPer7 offre vantaggi rispetto ad altri biosensori ROS. Ad esempio, i coloranti organici utilizzati per rilevare i ROS (ad esempio, diidroetidio [DHE]2 e MitoSOX3) possono produrre colorazioni irregolari o non specifiche e sono spesso somministrati in solventi come etanolo o dimetilsolfossido, che richiedono controlli aggiuntivi per gli effetti del solvente. Un'altra classe di biosensori ROS sono i biosensori basati sul trasferimento di energia a risonanza di fluorescenza (FRET) (ad esempio, Redoxfluor per lo stato redox cellulare4 e i sensori di perossido HSP-FRET5, OxyFRET 6 e PerFRET6). Queste sonde sono geneticamente codificate e altamente sensibili in linea di principio e possono essere quantitativamente indirizzate ai mitocondri utilizzando sequenze di segnale mitocondriale ben caratterizzate. Tuttavia, ci sono sfide nell'uso di sonde basate su FRET, tra cui lo sfondo dovuto all'eccitazione incrociata e al bleed-through, e requisiti rigorosi per la vicinanza e l'orientamento dei fluorofori affinché si verifichi FRET33,34. Inoltre, le sonde FRET sono costituite da due proteine fluorescenti che richiedono costrutti più grandi per l'espressione nelle cellule di interesse rispetto alle sonde a spostamento spettrale. Il protocollo qui descritto è stato sviluppato per sfruttare i punti di forza del biosensore basato su HyPer7 e per utilizzare questa sonda compatta, raziometrica, ad alta affinità, geneticamente codificata per l'imaging quantitativo del perossido nei mitocondri nel lievito vivente.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100x/1.45 Plan Apo Lambda objective lens</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MRD01905</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenine sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#A9126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Agar</td>
			<td>BD Difco</td>
			<td>#DF0145170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Peptone</td>
			<td>BD Difco</td>
			<td>#DF0118170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Tryptone</td>
			<td>BD Difco</td>
			<td>#DF211705</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Yeast Extract</td>
			<td>BD Difco</td>
			<td>#DF0127179</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BamHI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0136S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BglII</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0144S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbenicilin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carl Zeiss Immersol Immersion Oil</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>444960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextrose (D-(+)-Glucose)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. cloni 10G chemical competent cell</td>
			<td>Bioserch Technologies</td>
			<td>60108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIJI</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td>Schindelin et al 2012</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G418 (Geneticin)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A1720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP emission filter</td>
			<td>Chroma</td>
			<td></td>
			<td>525/50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibson assembly</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E2611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphpad Prism 7</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td></td>
			<td>https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H2O2 (stable)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H1009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HO-pGPD-mito-roGFP-KanMX6-HO</td>
			<td>Pon Lab</td>
			<td>JYE057/EP41</td>
			<td>Liao et al 20201</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator Shaker</td>
			<td>New Brunswick Scientific</td>
			<td>E24</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KAPA HiFi PCR kit</td>
			<td>Roche Sequencing and Life Science, Kapa Biosystems, Wilmington, MA</td>
			<td>KK1006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-arginine hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#A8094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>laser</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>405 and 488 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-histidine hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#H5659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-leucine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#L8912</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-lysine hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#L8662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-methionine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#M9625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-phenylalanine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#P5482</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-tryptophan</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#T8941</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-tyrosine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#T8566</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mHyPer7 plasmid</td>
			<td>This study</td>
			<td>JYE116</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope coverslips</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>3406</td>
			<td>#1.5 (170 &#181;m thickness)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>3050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MitoTracker Red CM-H2Xros</td>
			<td>ThermoFisherScientific</td>
			<td>M7513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBuilder HiFi Assembly Master Mix</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E2621</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Elements</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Microscope acquisition software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Ti Eclipse inverted microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraquat (Methyl viologen dichloride hydrate)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat. #856177&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RStudio</td>
			<td>Posit.co</td>
			<td>Free desktop version</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>BU530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stagetop incubator</td>
			<td>Tokai Hit</td>
			<td>INU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uracil</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#U1128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast nitrogen base (YNB) containing ammonium sulfate without amino acids</td>
			<td>BD Difco</td>
			<td>#DF0919073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>YN2_1_LT58_X2site</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>177705</td>
			<td>Pianale et al 2021</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zyla 4.2 sCMOS camera</td>
			<td>Andor</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging of mthyper7, a ratiometric biosensor for mitochondrial peroxide, in living yeast cells

La disfunzione mitocondriale, o alterazione funzionale, si trova in molte malattie e condizioni, tra cui disturbi neurodegenerativi e muscoloscheletrici, cancro e normale invecchiamento. Qui, viene descritto un approccio per valutare la funzione mitocondriale nelle cellule di lievito viventi a risoluzioni cellulari e subcellulari utilizzando un biosensore raziometrico geneticamente codificato, minimamente invasivo. Il biosensore, HyPer7 mirato ai mitocondri (mtHyPer7), rileva il perossido di idrogeno(H 2 O2 ) nei mitocondri. È costituito da una sequenza di segnale mitocondriale fusa a una proteina fluorescente permutata circolarmente e dal dominio H 2 O2-responsivodi una proteina batterica OxyR. Il biosensore viene generato e integrato nel genoma del lievito utilizzando un sistema CRISPR-Cas9 marker-free, per un'espressione più coerente rispetto ai costrutti trasmessi da plasmidi.
mtHyPer7 è quantitativamente mirato ai mitocondri, non ha alcun effetto rilevabile sul tasso di crescita del lievito o sulla morfologia mitocondriale e fornisce una lettura quantitativa per H2 O2 mitocondriale in condizioni di crescita normali e dopo esposizione a stress ossidativo. Questo protocollo spiega come ottimizzare le condizioni di imaging utilizzando un sistema di microscopio confocale a disco rotante ed eseguire analisi quantitative utilizzando un software disponibile gratuitamente. Questi strumenti consentono di raccogliere ricche informazioni spazio-temporali sui mitocondri sia all'interno delle cellule che tra le cellule di una popolazione. Inoltre, il flusso di lavoro qui descritto può essere utilizzato per convalidare altri biosensori.

Mitochondria are essential eukaryotic cellular organelles that are well known for their function in producing ATP through oxidative phosphorylation and electron transport1. In addition, mitochondria are sites for calcium storage, the synthesis of lipids, amino acids, fatty acid and iron-sulfur clusters, and signal transduction2,3. Within cells, mitochondria form a dynamic network with characteristic morphology and distribution, which varies according to cell type and metabolic state. Furthermore, although mitochondria can fuse and divide, not all the mitochondria in a cell are equivalent. Numerous studies have documented the functional heterogeneity of mitochondria within individual cells in attributes such as membrane potential and oxidative state4,5,6. This variation in mitochondrial function is due in part to damage to the organelle from mtDNA mutations (which occur at a higher rate than in nuclear DNA) and to oxidative damage by reactive oxygen species (ROS) generated both within and outside the organelle7,8,9. Damage to the organelle is mitigated by mitochondrial quality control mechanisms that repair the damage or eliminate mitochondria that are damaged beyond repair10.
Hydrogen peroxide (H2O2) is a reactive oxygen species that is a source of oxidative damage to cellular proteins, nucleic acids, and lipids. However, H2O2 also serves as a signaling molecule that regulates cellular activities through the reversible oxidation of thiols in target proteins11,12. H2O2 is produced from electrons that leak from the mitochondrial electron transport chain and by specific enzymes, such as NADPH oxidase and monoamine oxidases13,14,15,16,17,18,19,20. It is also inactivated by antioxidant systems, including those based on thioredoxin and glutathione21,22,23. Thus, analysis of mitochondrial H2O2 levels is critical for understanding the role of this metabolite in normal mitochondrial and cellular function and under conditions of oxidative stress.
The overall goal of this protocol is to detect mitochondrial H2O2 using a genetically encoded ratiometric H2O2 biosensor, HyPer7, that is targeted to the organelle (mtHyPer7). mtHyPer7 is a chimera consisting of the mitochondrial signal sequence from ATP9 (the Su9 presequence), a circularly permuted form of green fluorescent protein (GFP), and the H2O2-binding domain of the OxyR protein from Neisseria meningitidis24 (Figure 1). In circularly permuted GFP, the N- and C-termini of native GFP are fused and new termini are formed near the chromophore, which impart greater mobility to the protein and greater lability of its spectral characteristics compared to native GFP25. The interaction of mtHyPer7&#39;s OxyR domain with H2O2 is high-affinity, H2O2-selective, and leads to reversible oxidation of the conserved cysteine residues and disulfide bridge formation. Conformational changes associated with the oxidation of OxyR are transferred to the circularly permuted GFP in mtHyPer7, which results in a spectral shift in the excitation maximum of the mtHyPer7 chromophore from 405 nm in the reduced state to&#160;488 nm in the H2O2-oxidized state26. Thus, the ratio of fluorescence from mtHyPer7 in response to excitation at 488 nm versus 405 nm reflects the oxidation of the probe by H2O2.
Ideally, a biosensor should provide a real-time, absolute, quantitative readout of its target molecule. Unfortunately, however, this is not always possible in real-world measurements. In the case of oxidation sensors, such as mtHyPer7, the real-time readout is affected by the rate of reduction of the disulfide bridge. The reduction systems used by ROS biosensors differ, and these can dramatically alter probe response dynamics-as shown by the comparison of HyPer7, reduced by the thioredoxin system, and roGFP2-Tsa2&#916;CR, reduced by glutathione-in yeast cytosol27. Thus, to draw a conclusion about the relative H2O2 concentration from mtHyPer7 ratios, one must assume that the reduction system maintains a constant capacity during the experiment. Notwithstanding these considerations, HyPer7 and related probes have been used in various contexts to obtain information about H2O2 in living cells25,28,29.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65428/65428fig01.jpg" /> 
Figure 1: Design, molecular mechanism, and excitation/emission spectra of the H2O2 biosensor mtHyPer7. (A) The mtHyPer7 probe is derived by inserting circularly permuted GFP into the OxyR-RD domain from Neisseria meningitidis. It contains the mitochondrial targeting sequence from subunit 9 of the ATP synthase from Neurospora crassa (Su9). (B) Illustration of the H2O2-sensing mechanism of mtHyPer7. Oxidation of cysteines in the RD domain increases fluorescence emission upon excitation at 488 nm and decreases emission produced by excitation at 405 nm. (C) Excitation and emission spectra of HyPer7 in oxidized and reduced forms. This figure is reprinted with permission from Pak et al.24. Abbreviations: GFP = green fluorescent protein; cpGFP = circularly permuted GFP. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65428/65428fig01large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
This ratiometric imaging of mtHyPer7 offers important benefits for mitochondrial H2O2 quantitation24,27; it provides an internal control for probe concentration. In addition, the shift in excitation peak produced by H2O2 exposure is not complete, even in saturating concentrations of H2O2. Thus, ratio imaging can increase the sensitivity by incorporating two spectral points in the analysis.
The mtHyPer7 probe used here has a very high affinity for H2O2 and relatively low sensitivity to pH24, and has been successfully targeted to Caenorhabditis elegans mitochondria30. This protein has also been used in yeast27,31. However, previous studies relied on plasmid-borne expression of mtHyPer7, which results in cell-to-cell variability in probe expression27. In addition, the construct described in this protocol was integrated into a conserved, gene-free region on chromosome X32 using a CRISPR-based approach for marker-free integration. Expression of the integrated biosensor gene is also controlled by the strong constitutive TEF1 promoter (Figure 2). As a result, there is more stable, consistent expression of the biosensor in yeast cell populations compared to that observed using plasmid-borne biosensor expression, and cells bearing the biosensor can be propagated without the need for selective media.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65428/65428fig02.jpg" /> 
Figure 2: Generation of mtHyPer7-expressing cells by CRISPR. The Cas9 and sgRNA-containing plasmid (YN2_1_LT58_X2site) and PCR-amplified mtHyPer7-containing biosensor construct are introduced into budding yeast cells by lithium acetate transformation. The gene-free insertion site on chromosome X (X2) is recognized and cut by Cas9 protein with the sgRNA, and the biosensor is integrated into the genome by homologous recombination. After identification of the successful transformants by microscopic screening, colony PCR, and sequencing, the Cas9 plasmid is removed (cured) by growth in non-selective media. Abbreviations: sgRNA = single guide RNA; TEF = transcription enhancer factor. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65428/65428fig02large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
Finally, mtHyPer7 offers advantages over other ROS biosensors. For example, organic dyes used to detect ROS (e.g., dihydroethidium [DHE]2 and MitoSOX3) can produce uneven or nonspecific staining and are often delivered in solvents such as ethanol or dimethyl sulfoxide, which require additional controls for solvent effects. Another class of ROS biosensors are fluorescence resonance energy transfer (FRET)-based biosensors (e.g., Redoxfluor for cellular redox state4, and the peroxide sensors HSP-FRET5, OxyFRET6, and PerFRET6). These probes are genetically encoded and highly sensitive in principle and can be quantitatively targeted to mitochondria using well-characterized mitochondrial signal sequences. However, there are challenges in the use of FRET-based probes, including background due to cross-excitation and bleed-through, and stringent requirements for the proximity and orientation of the fluorophores for FRET to occur33,34. In addition, FRET probes consist of two fluorescent proteins that require larger constructs for expression in cells of interest compared to spectra-shifting probes. The protocol described here was developed to take advantage of the strengths of the HyPer7-based biosensor, and to use this compact, ratiometric, high-affinity, genetically encoded probe for quantitative imaging of peroxide in mitochondria in living yeast.

Autore in primo piano: Avanzamento della ricerca mitocondriale - Biosensore mtHyper7 per l'analisi subcellulare 

Imaging di mtHyPer7, un biosensore raziometrico per il perossido mitocondriale, in cellule di lievito viventi

Mitochondria are organelles within cells that facilitate energy mobilization, central metabolism, production of vital macromolecules, calcium storage, and signal transduction. As a result, they play a crucial role in cellular function, fitness, and lifespan control. Our research focuses on investigating the impact of mitochondria on aging using the budding yeast Saccharomyces cerevisiae as a model organism.Live cell imaging is our best tool to observe variation in mitochondrial function. Here we describe a method that utilizes a genetically encoded ratio metric spectral shifting biosensor called mitochondrial HyPer7. mtHyPer7 detects hydrogen peroxide, a reactive oxygen species, that can damage cellular constituents, but also functions as a signaling molecule in mitochondria of live cells.mtHyPer7 has a high affinity for hydrogen peroxide and low sensitivity to pH. It is integrated into the yeast genome, which results in stable and consistent expression in yeast cell populations. Finally, it is quantitatively targeted to mitochondria and has no detectable effect on cellular or mitochondrial function or fitness.Biosensors like mtHyPer7 are critical for studying mitochondrial function at subcellular resolution, for finding mechanisms underlying mitochondrial quality control, and for examining how that process affects cell fitness, feed, and lifespan. The mtHyPer7 stain provides consistent laboring in contrast to organic dyes utilized for reactive oxygen species detection. Compared to FRET-based sensors, mtHyPer7 is more compact and avoids issues such as cross-excitation and bleed through, as well as the precise positioning and the orientation requirements for FRET.

Per confermare che mtHyPer7 è una sonda adatta per valutare l'H 2 O2mitocondriale, è stata valutata la localizzazione di mtHyPer7 e il suo effetto sui mitocondri del lievito e sulla salute delle cellule. Per valutare il targeting di mtHyPer7, i mitocondri sono stati colorati con il colorante vitale specifico per i mitocondri MitoTracker Red nelle cellule di lievito di controllo e nel lievito che esprime mtHyPer7. Utilizzando la colorazione MitoTracker Red, i mitocondri sono stati risolti come lunghe strutture tubolari che si allineavano lungo l'asse madre-gemma e si accumulavano nella punta della gemma e nella punta della cellula madre distale alla gemma41. La morfologia mitocondriale era simile nelle cellule di controllo e nelle cellule esprimenti mtHyPer7. Inoltre, mtHyPer7 è co-localizzato con i mitocondri colorati di rosso di MitoTracker (Figura 3A). Pertanto, mtHyPer7 è stato mirato in modo efficiente e quantitativo ai mitocondri senza influenzare la normale morfologia o distribuzione mitocondriale.
Successivamente, sono stati eseguiti ulteriori esperimenti di convalida per valutare l'effetto di mtHyPer7 sulla fitness cellulare e sulla sensibilità allo stress ossidativo nei mitocondri. I tassi di crescita delle cellule che esprimono mtHyPer7 in terreni ricchi o sintetici a base di glucosio (YPD o SC, rispettivamente) sono simili a quelli delle cellule wild-type non trasformate (Figura 3B,D). Per valutare i possibili effetti sullo stress ossidativo nei mitocondri, il lievito di controllo e che esprime mtHyPer7 è stato trattato con bassi livelli di paraquat, una piccola molecola redox-attiva che si accumula nei mitocondri e provoca elevati livelli di superossido nell'organello24,27. Se l'espressione di mtHyPer7 induce stress ossidativo nei mitocondri o protegge i mitocondri dallo stress ossidativo, allora le cellule che esprimono mtHyPer7 dovrebbero mostrare una maggiore o minore sensibilità al trattamento con paraquat, rispettivamente. Il trattamento con bassi livelli di paraquat ha portato a una diminuzione dei tassi di crescita del lievito. Inoltre, i tassi di crescita delle cellule wild-type e delle cellule che esprimono mtHyPer7 in presenza di paraquat erano simili (Figura 3C,E). Pertanto, l'espressione del biosensore non ha creato stress cellulari significativi nelle cellule di lievito in gemmazione né alterato la sensibilità del lievito allo stress ossidativo mitocondriale.
Data l'evidenza che mtHyPer7 è adatto per lo studio dell'H 2 O 2 mitocondriale nel lievito in gemmazione, è stato testato se mtHyPer7 potesse rilevare H 2 O 2 mitocondriale nel lievito wild-type in fase intermedia e i cambiamenti nell'H 2 O 2 mitocondriale indotti dall'aggiunta esterna di H 2 O 2. È stato eseguitoun esperimento di titolazione H 2 O2 ed è stato misurato il rapporto medio ossidato:ridotto (O/R) mtHyPer7 nei mitocondri.
Gli script di analisi automatizzata hanno prodotto diversi file di output.
L'immagine del rapporto (ratio.tif): una pila Z costituita dal rapporto delle pile corrette per lo sfondo a 488 nm e 405 nm. Questo stack può essere visualizzato nelle Figi senza ulteriori elaborazioni; Tuttavia, si consiglia di migliorare il contrasto e/o colorare l'immagine come descritto nei passaggi 4.3 o 5.6 del protocollo prima della visualizzazione.
L'immagine della maschera (mask.tif): una pila Z costituita dalle aree mitocondriali soglie utilizzate per l'analisi. Questa immagine deve essere utilizzata per valutare l'accuratezza della soglia.
I ROI utilizzati per l'analisi (ROIs.zip): quando questo file viene aperto nelle Figi, insieme all'immagine di origine, i ROI vengono sovrapposti all'immagine per incrociare la tabella dei risultati e l'immagine di origine. Ogni ROI viene rinominata con un numero di cella e un numero di ROI.
Tabelle di misurazione (NumResults.csv, DenomResults.csv, Results.csv) contenenti rispettivamente l'area, la media e la densità integrata dei mitocondri con soglia per ciascuna fetta nelle immagini del numeratore, del denominatore e del rapporto. Nelle sezioni in cui i mitocondri erano assenti o sfocati, viene registrato NaN.
Un file di log (Log.txt) che documenta le opzioni utilizzate per la correzione dello sfondo e del rumore, la soglia e il calcolo del rapporto.
Il rapporto O/R di mtHyPer7 ha mostrato una risposta dose-dipendente alla concentrazione di H 2 O 2, che ha raggiunto un plateau a 1-2 mM di H 2 O 2aggiunti esternamente (Figura 7). Sorprendentemente, il rapporto HyPer7 era più basso nelle cellule esposte a 0,1 mM H 2 O2rispetto alle cellule di controllo, sebbene questa differenza non fosse statisticamente significativa. Una spiegazione per questo fenomeno può essere una risposta all'ormesi, in cui l'esposizione a un basso livello di stressor può indurre risposte allo stress, come meccanismi antiossidanti, che a loro volta riducono la quantità di ROS rilevabili dalla sonda. Livelli più elevati di fattori di stress, al contrario, possono sopraffare le risposte interne allo stress e comportare una lettura più elevata di HyPer7.
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65428/65428fig07.jpg"> Figura 7: Risposta di mtHyPer7 all'aggiunta esterna di H 2 O 2. (A) Proiezione massima di immagini eccitate a 405 nm e 488 nm e proiezione di intensità media delle immagini raziometriche di mtHyPer7 in cellule in fase logaritmica media esposte a diverse concentrazioni di H 2 O 2. Lo pseudocolore indica il rapporto mtHyPer7 ossidato:ridotto (scala in basso). Barra della scala = 1 μm. Il contorno della cella è mostrato in bianco; n > 100 celle per condizione. (B) Quantificazione del rapporto mtHyPer7 ossidato:ridotto in cellule di lievito in gemmazione trattate con diverse concentrazioni di H2 O2 . Vengono mostrati i mezzi di cinque prove indipendenti, con simboli di forma e colore diversi per ogni prova. Media ± SEM del rapporto mtHyPer7 ossidato:ridotto: 1,794 ± 0,07627 (nessun trattamento), 1,357 ± 0,03295 (0,1 mM), 2,571 ± 0,3186 (0,5 mM), 6,693 ± 0,5194 (1 mM), 7,017 ± 0,1197 (2 mM). p < 0,0001 (ANOVA unidirezionale con test di confronto multiplo di Tukey). I valori di p sono indicati come: ****p < 0,0001. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65428/65428fig07large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Infine, studi precedenti hanno rivelato che i mitocondri più in forma, che sono più ridotti e contengono meno superossido, sono ereditati preferenzialmente dalle cellule figlie del lievito 4 e che le catalasi citosoliche sono trasportate e attivate nelle cellule figliedel lievito42,43,44,45. Questi studi documentano l'ereditarietà asimmetrica dei mitocondri durante la divisione delle cellule di lievito e un ruolo per questo processo nella forma fisica e nella durata della vita delle cellule figlie, nonché l'asimmetria dell'età madre-figlia. Per verificare se esistono differenze in H2 O2 tra madri e gemme, mtHyPer7 è stato misurato in gemme e cellule madri. Sono state osservate differenze nell'H 2O 2 mitocondriale all'interno delle cellule di lievito e una diminuzione sottile ma statisticamente significativa nella lettura del biosensore H 2 O 2 è stata rilevata nei mitocondri nel germoglio rispetto a quelli nella cellula madre (Figura 8). Questi risultati sono coerenti con i risultati precedenti secondo cui i mitocondri nel germoglio sono meglio protetti dallo stress ossidativo. Forniscono anche la documentazione che mtHyPer7 può fornire una lettura quantitativa per H 2 O2mitocondriale con risoluzione cellulare e subcellulare nel lievito in gemmazione.
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65428/65428fig08.jpg"> Figura 8: Il livello mitocondrialedi H 2 O2 è più basso nella cellula figlia. (A) Proiezione massima di un'immagine raziometrica di mtHyPer7 in una cella rappresentativa. Lo pseudocolore indica il rapporto mtHyPer7 ossidato:ridotto (scala in basso). Le differenze subcellulari nel rapporto sono evidenti (punte di freccia). Barra della scala = 1 μm. Contorno della cella: bianco. (B) Differenza tra il rapporto mtHyPer7 nella gemma e nella cellula madre. Per ogni singola cella, il valore del rapporto madre è stato sottratto dal valore del rapporto di gemma e tracciato come un punto. n = 193 cellule raggruppate da cinque esperimenti indipendenti, mostrate con simboli di colore diverso per ogni esperimento. Media ± SEM della differenza tra il rapporto mtHyPer7 nella gemma e nelle cellule madri: -0,04297 ± 0,01266. p = 0,0008 (test t accoppiato) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65428/65428fig08large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Tabella supplementare S1: Ceppi utilizzati in questo studio. Elenco dei ceppi di lievito utilizzati. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65428/65428_Supplemental%20Table%201%20Strains%20used%20in%20this%20study-R2.xls" target="_blank">Fare clic qui per scaricare il file.</a>
Tabella supplementare S2: Plasmidi utilizzati in questo studio. Elenco dei plasmidi utilizzati. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65428/Supplemental%20Table%202%20Plasmids%20used%20in%20this%20study-R2.xls" target="_blank">Fare clic qui per scaricare il file.</a>
Tabella supplementare S3: Primer utilizzati in questo studio. Elenco dei primer utilizzati. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65428/65428_Supplemental%20Table%203%20Primers%20used%20in%20this%20study-R2.xls" target="_blank">Fare clic qui per scaricare il file.</a>
File supplementare 1: Protocollo per la costruzione di plasmidi biosensori. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65428/65428_Yang%20et%20al%20Supp%20Protocol%202023.docx" target="_blank">Fare clic qui per scaricare il file.</a>
File supplementare 2: Script per l'analisi automatizzata. Per ogni script vengono forniti file di input e file di output di esempio. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65428/biosensor-supplemental-coding-files.zip" target="_blank">Fare clic qui per scaricare il file.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Advancing Mitochondrial Research  mtHyper7 Biosensor for Subcellular Analysis at JoVE.com

Il perossido di idrogeno (H 2 O2 ) è sia una fonte di danno ossidativo che una molecola di segnalazione. Questo protocollo descrive come misurare l'H 2 O2mitocondriale utilizzando HyPer7 mirato ai mitocondri (mtHyPer7), un biosensore raziometrico geneticamente codificato, nel lievito vivente. Descrive in dettaglio come ottimizzare le condizioni di imaging ed eseguire analisi quantitative cellulari e subcellulari utilizzando software disponibili gratuitamente.

Mitochondrial dysfunction, or functional alteration, is found in many diseases and conditions, including neurodegenerative and musculoskeletal disorders, ...

I mitocondri sono organelli all'interno delle cellule che facilitano la mobilizzazione dell'energia, il metabolismo centrale, la produzione di macromolecole vitali, l'immagazzinamento del calcio e la trasduzione del segnale. Di conseguenza, svolgono un ruolo cruciale nella funzione cellulare, nella forma fisica e nel controllo della durata della vita. La nostra ricerca si concentra sullo studio dell'impatto dei mitocondri sull'invecchiamento utilizzando il lievito in gemmazione Saccharomyces cerevisiae come organismo modello.L'imaging di cellule vive è il nostro strumento migliore per osservare la variazione della funzione mitocondriale. Qui descriviamo un metodo che utilizza un biosensore di spostamento spettrale metrico del rapporto geneticamente codificato chiamato mitocondriale HyPer7. mtHyPer7 rileva il perossido di idrogeno, una specie reattiva dell'ossigeno, che può danneggiare i costituenti cellulari, ma funziona anche come molecola di segnalazione nei mitocondri delle cellule vive.mtHyPer7 ha un'elevata affinità per il perossido di idrogeno e una bassa sensibilità al pH. È integrato nel genoma del lievito, il che si traduce in un'espressione stabile e coerente nelle popolazioni di cellule di lievito. Infine, è quantitativamente mirato ai mitocondri e non ha alcun effetto rilevabile sulla funzione cellulare o mitocondriale o sulla forma fisica.I biosensori come mtHyPer7 sono fondamentali per studiare la funzione mitocondriale a risoluzione subcellulare, per trovare i meccanismi alla base del controllo di qualità mitocondriale e per esaminare come tale processo influisce sulla forma fisica cellulare, sull'alimentazione e sulla durata della vita. Il colorante mtHyPer7 fornisce un lavoro costante in contrasto con i coloranti organici utilizzati per il rilevamento delle specie reattive dell'ossigeno. Rispetto ai sensori basati su FRET, mtHyPer7 è più compatto ed evita problemi come l'eccitazione incrociata e il bleed through, nonché il posizionamento preciso e i requisiti di orientamento per FRET.

Imaging di mtHyPer7, un biosensore raziometrico per il perossido mitocondriale, in cellule di lievito viventi

Abstract