Визуализация mtHyPer7, ратиометрического биосенсора для митохондриальной перекиси, в живых клетках дрожжей

Митохондриальная дисфункция, или функциональные изменения, обнаруживается при многих заболеваниях и состояниях, включая нейродегенеративные и опорно-двигательные расстройства, рак и нормальное старение. В данной работе описан подход к оценке митохондриальной функции в живых клетках дрожжей при клеточном и субклеточном разрешении с использованием генетически кодируемого, минимально инвазивного, ратиометрического биосенсора. Биосенсор, нацеленный на митохондрии HyPer7 (mtHyPer7), обнаруживает перекись водорода (_H2O2) в митохондриях. Он состоит из митохондриальной сигнальной последовательности, соединенной с циркулярно перестановленным флуоресцентным белком, и H 2 O₂чувствительным доменом бактериального белка OxyR. Биосенсор генерируется и интегрируется в геном дрожжей с помощью системы без маркеров CRISPR-Cas9 для более стабильной экспрессии по сравнению с плазмидными конструкциями.

mtHyPer7 количественно нацелен на митохондрии, не оказывает заметного влияния на скорость роста дрожжей или морфологию митохондрий и обеспечивает количественное измерение митохондриального_H2O₂ в нормальных условиях роста и при воздействии окислительного стресса. В этом протоколе объясняется, как оптимизировать условия визуализации с помощью системы конфокального микроскопа с вращающимся диском и выполнять количественный анализ с помощью свободно доступного программного обеспечения. Эти инструменты позволяют собирать богатую пространственно-временную информацию о митохондриях как внутри клеток, так и между клетками в популяции. Кроме того, описанный здесь рабочий процесс может быть использован для проверки других биосенсоров.