Los autores agradecen a Katherine Filpo López por su asistencia técnica experta. Este trabajo fue apoyado por subvenciones de los Institutos Nacionales de Salud (NIH, por sus siglas en inglés) (GM122589 y AG051047) a LP.
En estos estudios se utilizó el recurso compartido de microscopía confocal y especializada del Centro Oncológico Integral Herbert Irving de la Universidad de Columbia, financiado en parte a través de la Subvención de Apoyo al Centro Oncológico de los NIH/NCI P30CA013696.

Obtención de imágenes de peróxido mitocondrial en células de levadura vivas mediante mtHyper7

Los autores declaran que no tienen conflictos de intereses.

En este protocolo, se describe un método para usar mtHyPer7 como biosensor para evaluar el H 2 O2mitocondrial en células de levadura vivas en ciernes. El biosensor se construye utilizando un método basado en CRISPR y se introduce en una región libre de genes conservada en el genoma de la levadura sin el uso de marcadores seleccionables. En comparación con los biosensores transmitidos por plásmidos, los integrados se expresan en todas las células y a niveles consistentes, lo que proporciona resultados de cuantificación más fiables. No se utilizan marcadores seleccionables para generar células que expresen mtHyPer7, lo que permite el uso de una gama más amplia de antecedentes de cepas y facilita la modificación genética de las células que expresan biosensores. La proteína mtHyPer7 se dirige correctamente a las mitocondrias sin efectos notables en la morfología, función, distribución o tasas de crecimiento celular mitocondriales. mtHyPer7 muestra una respuesta dependiente de la dosis alH2O22 añadido externamente. Además, mtHyPer7 es capaz de informar sobre la heterogeneidad de la calidad mitocondrial con resolución subcelular. Por último, el uso de un microscopio confocal de disco giratorio en lugar de una microscopía de campo amplio para obtener imágenes de biosensores dirigidos a mitocondrias provoca menos fotoblanqueo en los fluoróforos y genera imágenes de alta resolución para analizar las diferencias subcelulares.
Limitaciones y enfoques alternativos Este método no es adecuado para obtener imágenes de células durante más de 10 minutos, ya que las células se secarán debajo del cubreobjetos. Para obtener imágenes a largo plazo, es mejor utilizar el método de la almohadilla de agar46 o inmovilizar las células en una placa de cultivo con fondo de vidrio llena de medio SC.
La elección del biosensor debe guiarse por la concentración de la diana en condiciones experimentales. Si la sensibilidad de HyPer7 es demasiado alta, se recomienda una versión diferente de HyPer, como HyPer3 o HyPerRed47,48. Sin embargo, hay que tener en cuenta que otras sondas HyPer son más sensibles al pH. Para una mayor sensibilidad, podría ser más apropiado el roGFP basado en peroxirredoxina (roGFP2Tsa2ΔCR)27.
El estado estacionario de oxidación del sensorH 2 O2 está vinculado tanto a las tasas de oxidación como a las de reducción. La tasa de oxidación de los biosensores es causada principalmente porH2O2, pero la tasa de reducción depende de los sistemas de reducción antioxidante activos en la célula y el orgánulo. Se ha demostrado que HyPer7 es predominantemente reducido por el sistema de tiorredoxina en el citosol de levadura, y su reducción es más rápida que la de roGFP2Tsa2ΔCR27. Por lo tanto, los diferentes mecanismos de reducción y dinámica de respuesta de la sonda deben tenerse en cuenta al interpretar las mediciones de los biosensores deH2O2. En particular, para inferir los nivelesde H 2 O2 a partir de la lectura del biosensor, se debe suponer que el sistema de reducción mantiene una capacidad constante durante el experimento. Como alternativa a los scripts aquí descritos, se ha puesto a disposición una variedad de otros programas informáticos para el análisis de sensores redox49.
Pasos críticos Con cualquier biosensor, es fundamental demostrar que el biosensor en sí mismo no afecta el proceso que se está midiendo. Por lo tanto, es importante comparar el crecimiento y la morfología mitocondrial de las cepas en cada condición experimental. Aquí, la morfología mitocondrial se evalúa utilizando MitoTracker Red, que tiñe las mitocondrias de una manera dependiente del potencial de membrana. Sin embargo, la comparación de las mitocondrias en células no transformadas y transformadas por biosensores se puede lograr mediante la tinción con éster metílico de tetrametilrodamina (TMRM), un colorante vital mitocondrial alternativo que detecta el potencial de membrana, o MitoTracker Green, que tiñe las mitocondrias independientemente del potencial de membrana. Si se sospecha de efectos nocivos, puede ser útil reducir el nivel de expresión o cambiar el sitio de integración.
La validación del comportamiento dosis-respuesta de la sonda y la relación señal-ruido de la técnica de imagen también son esenciales para obtener resultados sólidos. Si la variabilidad dentro de un grupo excede la variabilidad entre grupos, las diferencias se vuelven difíciles de detectar. La variabilidad intragrupo puede ser el resultado de una variación poblacional real o de ruido en el proceso de detección. Los pasos clave para aumentar la relación señal:ruido son la adquisición de imágenes (rango de valores de píxeles y ruido), la sustracción de fondo y el umbral.
Los efectos de ruido también se pueden reducir durante los pasos de cálculo. El enfoque más sencillo es calcular la intensidad media ponderada a partir de las mediciones de la imagen de relación (Resultados.csv), donde cada píxel representa la relación local entre las eficiencias de excitación. Esto produce una relación "píxel". Sin embargo, si la relación señal:ruido de la imagen es baja, se pueden obtener resultados más robustos calculando la intensidad media ponderada para un ROI tanto en el numerador como en los canales del denominador, y luego calculando la relación entre estas dos medias ponderadas (relación "por región").
Para seleccionar un método de umbral, el comando Fiji Imagen | Ajustar | El umbral automático se puede utilizar para probar automáticamente todos los métodos de Fiji incorporados. Para evaluar la segmentación (umbral), una máscara guardada se convierte en una selección haciendo clic en Editar | Selección | Crear selección, agregada al Administrador de ROI (presionando T) y luego activada en el archivo de imagen sin procesar. Si las mitocondrias no se detectan adecuadamente, se debe intentar un método de segmentación diferente.
Al comparar imágenes, es esencial adquirir todas las imágenes con condiciones de imagen idénticas, así como mostrar todas las imágenes con una mejora de contraste idéntica.
El movimiento mitocondrial debe tenerse en cuenta a la hora de optimizar las condiciones de obtención de imágenes. Si las mitocondrias se mueven significativamente entre la excitación a 405 y 488 nm, la imagen de relación no será precisa. Se recomienda mantener el tiempo de exposición <500 ms y cambiar la excitación por el método más rápido disponible (por ejemplo, un pulso de disparo o un filtro sintonizable acústico-óptico). Al capturar una pila Z, ambas excitaciones deben realizarse para cada paso Z antes de pasar al siguiente paso Z.
Para la visualización de los resultados, los cambios en el tono (color) son más obvios para el ojo humano que los cambios en la intensidad. Por lo tanto, el valor de la relación se convierte en una escala de colores para facilitar la interpretación visual. Las imágenes coloreadas pueden ser no moduladas, en las que todos los píxeles mitocondriales aparecen con el mismo brillo, o moduladas por intensidad, en las que la intensidad de píxeles de la imagen original se utiliza para establecer intensidades en la imagen coloreada.
Modificación y solución de problemas Como alternativa a la confirmación de la función mitocondrial mediante provocación con paraquat, las células pueden ser replicadas o inoculadas en fuentes de carbono fermentables y no fermentables.
Para la sustracción de fondo, la resta de bolas rodantes (navegando a Proceso | Restar fondo...) También se puede utilizar para eliminar la falta de uniformidad de la iluminación. Debe asegurarse de que la presencia de celdas no altere el fondo que se está restando (marcando la opción Crear fondo y examinando el resultado).
En resumen, la sonda mtHyPer7 proporciona un método consistente y mínimamente invasivo para relacionar el estado morfológico y funcional de las mitocondrias de levadura en células vivas, y permite el estudio de un importante factor de estrés celular y molécula de señalización en un sistema modelo genéticamente tratable y de fácil acceso.

Las mitocondrias son orgánulos celulares eucariotas esenciales que son bien conocidos por su función en la producción de ATP a través de la fosforilación oxidativa y el transporte de electrones1. Además, las mitocondrias son sitios para el almacenamiento de calcio, la síntesis de lípidos, aminoácidos, ácidos grasos y grupos de hierro-azufre, y la transducción de señales 2,3. Dentro de las células, las mitocondrias forman una red dinámica con morfología y distribución características, que varía según el tipo de célula y el estado metabólico. Además, aunque las mitocondrias pueden fusionarse y dividirse, no todas las mitocondrias de una célula son equivalentes. Numerosos estudios han documentado la heterogeneidad funcional de las mitocondrias dentro de las células individuales en atributos como el potencial de membrana y el estado oxidativo 4,5,6. Esta variación en la función mitocondrial se debe en parte al daño al orgánulo por mutaciones en el ADNmt (que ocurren a un ritmo mayor que en el ADN nuclear) y al daño oxidativo por especies reactivas de oxígeno (ROS) generadas tanto dentro como fuera del orgánulo 7,8,9. El daño al orgánulo se mitiga mediante mecanismos de control de calidad mitocondrial que reparan el daño o eliminan las mitocondrias que están dañadas sin posibilidad de reparación10.
El peróxido de hidrógeno (H2O2) es una especie reactiva de oxígeno que es una fuente de daño oxidativo a las proteínas celulares, ácidos nucleicos y lípidos. Sin embargo, elH2O2también sirve como una molécula de señalización que regula las actividades celulares a través de la oxidación reversible de los tioles en las proteínas diana11,12. ElH2O2se produce a partir de electrones que se escapan de la cadena de transporte de electrones mitocondrial y por enzimas específicas, como la NADPH oxidasa y las monoaminooxidasas 13,14,15,16,17,18,19,20. También es inactivado por los sistemas antioxidantes, incluidos los basados en tiorredoxina y glutatión21,22,23. Por lo tanto, el análisis de los niveles mitocondriales deH2O2es fundamental para comprender el papel de este metabolito en la función mitocondrial y celular normal y en condiciones de estrés oxidativo. 
El objetivo general de este protocolo es detectar el H 2 O 2 mitocondrial utilizando un biosensor radiométrico H 2 O2 codificado genéticamente, HyPer7, que está dirigido al orgánulo (mtHyPer7). mtHyPer7 es una quimera que consiste en la secuencia de señal mitocondrial de ATP9 (la presecuencia Su9), una forma permutada circularmente de proteína verde fluorescente (GFP) y el dominio de unión H2 O2 de la proteína OxyR de Neisseria meningitidis24 (Figura 1). En la GFP permutada circularmente, los extremos N y C de la GFP nativa se fusionan y se forman nuevos terminales cerca del cromóforo, lo que confiere una mayor movilidad a la proteína y una mayor labilidad de sus características espectrales en comparación con la GFP25 nativa. La interacción del dominio OxyR de mtHyPer7 con H 2 O 2 es de alta afinidad, H 2 O 2-selectivo, yconduce a la oxidación reversible de los residuos de cisteína conservados y a la formación de puentes disulfuro. Los cambios conformacionales asociados con la oxidación de OxyR se transfieren a la GFP permutada circularmente en mtHyPer7, lo que da como resultado un cambio espectral en el máximo de excitación del cromóforo mtHyPer7 de 405 nm en el estado reducido a 488 nm en el estado H 2O 2-oxidado 26. Por lo tanto, la relación de fluorescencia de mtHyPer7 en respuesta a la excitación a 488 nm frente a 405 nm refleja la oxidación de la sonda porH2O2.
Idealmente, un biosensor debería proporcionar una lectura cuantitativa, absoluta y en tiempo real de su molécula objetivo. Sin embargo, desafortunadamente, esto no siempre es posible en las mediciones del mundo real. En el caso de los sensores de oxidación, como mtHyPer7, la lectura en tiempo real se ve afectada por la tasa de reducción del puente disulfuro. Los sistemas de reducción utilizados por los biosensores ROS difieren, y estos pueden alterar drásticamente la dinámica de respuesta de la sonda, como lo demuestra la comparación de HyPer7, reducido por el sistema de tiorredoxina, y roGFP2-Tsa2ΔCR, reducido por glutatión, en el citosolde levadura 27. Por lo tanto, para sacar una conclusión sobre la concentraciónrelativa de H2O2 a partir de las proporciones mtHyPer7, se debe suponer que el sistema de reducción mantiene una capacidad constante durante el experimento. A pesar de estas consideraciones, HyPer7 y las sondas relacionadas se han utilizado en diversos contextos para obtener información sobre H2O2en células vivas25,28,29.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65428/65428fig01.jpg"> Figura 1: Diseño, mecanismo molecular y espectros de excitación/emisión del biosensor H 2 O2 mtHyPer7. (A) La sonda mtHyPer7 se obtiene insertando GFP permutada circularmente en el dominio OxyR-RD de Neisseria meningitidis. Contiene la secuencia de diana mitocondrial de la subunidad 9 de la ATP sintasa de Neurospora crassa (Su9). (B) Ilustración del mecanismo de detección de H 2 O2de mtHyPer7. La oxidación de cisteínas en el dominio RD aumenta la emisión de fluorescencia tras la excitación a 488 nm y disminuye la emisión producida por la excitación a 405 nm. (C) Espectros de excitación y emisión de HyPer7 en formas oxidadas y reducidas. Esta figura se reproduce con permiso de Pak et al.24. Abreviaturas: GFP = proteína verde fluorescente; cpGFP = GFP permutada circularmente. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65428/65428fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Esta imagen radiométrica de mtHyPer7 ofrece importantes beneficiospara la cuantificación mitocondrial de H2O2 24,27; Proporciona un control interno para la concentración de la sonda. Además, el cambio en el pico de excitación producido por laexposición a H2O2 no es completo, incluso en concentraciones saturadas deH2O2. Por lo tanto, las imágenes de relación pueden aumentar la sensibilidad mediante la incorporación de dos puntos espectrales en el análisis.
La sonda mtHyPer7 utilizada aquí tiene una afinidad muy alta por elH2O2y una sensibilidad relativamente baja al pH24, y se ha dirigido con éxito a las mitocondrias30 de Caenorhabditis elegans. Esta proteína también se ha utilizado en levaduras 27,31. Sin embargo, estudios anteriores se basaron en la expresión transmitida por plásmidos de mtHyPer7, lo que da lugar a una variabilidad de célula a célula en la expresión de la sonda27. Además, el constructo descrito en este protocolo se integró en una región conservada y libre de genes en el cromosoma X32 utilizando un enfoque basado en CRISPR para la integración sin marcadores. La expresión del gen biosensor integrado también está controlada por el promotor constitutivo fuerte de TEF1 (Figura 2). Como resultado, hay una expresión más estable y consistente del biosensor en las poblaciones de células de levadura en comparación con la observada utilizando la expresión del biosensor transmitido por plásmidos, y las células que llevan el biosensor se pueden propagar sin la necesidad de medios selectivos.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65428/65428fig02.jpg"> Figura 2: Generación de células que expresan mtHyPer7 mediante CRISPR. La construcción del biosensor que contiene Cas9 y sgRNA (YN2_1_LT58_X2site) y la construcción del biosensor que contiene mtHyPer7 amplificada por PCR se introducen en células de levadura en ciernes mediante transformación de acetato de litio. El sitio de inserción libre de genes en el cromosoma X (X2) es reconocido y cortado por la proteína Cas9 con el sgRNA, y el biosensor se integra en el genoma por recombinación homóloga. Después de la identificación de los transformantes exitosos mediante cribado microscópico, PCR de colonias y secuenciación, el plásmido Cas9 se elimina (se cura) mediante el crecimiento en medios no selectivos. Abreviaturas: sgRNA = ARN guía simple; TEF = factor potenciador de la transcripción. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65428/65428fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Por último, mtHyPer7 ofrece ventajas sobre otros biosensores ROS. Por ejemplo, los colorantes orgánicos utilizados para detectar ROS (por ejemplo, dihidroetidio [DHE]2 y MitoSOX3) pueden producir tinciones desiguales o inespecíficas y, a menudo, se administran en disolventes como el etanol o el dimetilsulfóxido, que requieren controles adicionales para los efectos de los disolventes. Otra clase de biosensores ROS son los biosensores basados en la transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET) (por ejemplo, Redoxfluor para el estado redoxcelular 4 y los sensores de peróxido HSP-FRET5, OxyFRET 6 y PerFRET6). Estas sondas están codificadas genéticamente y son altamente sensibles en principio y pueden dirigirse cuantitativamente a las mitocondrias utilizando secuencias de señales mitocondriales bien caracterizadas. Sin embargo, existen desafíos en el uso de sondas basadas en FRET, incluido el fondo debido a la excitación cruzada y el sangrado, y los estrictos requisitos para la proximidad y orientación de los fluoróforos para que ocurra FRET33,34. Además, las sondas FRET consisten en dos proteínas fluorescentes que requieren construcciones más grandes para su expresión en células de interés en comparación con las sondas de cambio de espectro. El protocolo descrito aquí se desarrolló para aprovechar las fortalezas del biosensor basado en HyPer7 y para utilizar esta sonda compacta, ratiométrica, de alta afinidad y codificada genéticamente para obtener imágenes cuantitativas del peróxido en las mitocondrias en levaduras vivas.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100x/1.45 Plan Apo Lambda objective lens</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MRD01905</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenine sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#A9126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Agar</td>
			<td>BD Difco</td>
			<td>#DF0145170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Peptone</td>
			<td>BD Difco</td>
			<td>#DF0118170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Tryptone</td>
			<td>BD Difco</td>
			<td>#DF211705</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Yeast Extract</td>
			<td>BD Difco</td>
			<td>#DF0127179</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BamHI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0136S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BglII</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0144S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbenicilin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carl Zeiss Immersol Immersion Oil</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>444960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextrose (D-(+)-Glucose)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. cloni 10G chemical competent cell</td>
			<td>Bioserch Technologies</td>
			<td>60108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIJI</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td>Schindelin et al 2012</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G418 (Geneticin)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A1720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP emission filter</td>
			<td>Chroma</td>
			<td></td>
			<td>525/50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibson assembly</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E2611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphpad Prism 7</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td></td>
			<td>https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H2O2 (stable)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H1009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HO-pGPD-mito-roGFP-KanMX6-HO</td>
			<td>Pon Lab</td>
			<td>JYE057/EP41</td>
			<td>Liao et al 20201</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator Shaker</td>
			<td>New Brunswick Scientific</td>
			<td>E24</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KAPA HiFi PCR kit</td>
			<td>Roche Sequencing and Life Science, Kapa Biosystems, Wilmington, MA</td>
			<td>KK1006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-arginine hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#A8094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>laser</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>405 and 488 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-histidine hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#H5659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-leucine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#L8912</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-lysine hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#L8662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-methionine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#M9625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-phenylalanine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#P5482</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-tryptophan</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#T8941</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-tyrosine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#T8566</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mHyPer7 plasmid</td>
			<td>This study</td>
			<td>JYE116</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope coverslips</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>3406</td>
			<td>#1.5 (170 &#181;m thickness)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>3050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MitoTracker Red CM-H2Xros</td>
			<td>ThermoFisherScientific</td>
			<td>M7513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBuilder HiFi Assembly Master Mix</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E2621</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Elements</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Microscope acquisition software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Ti Eclipse inverted microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraquat (Methyl viologen dichloride hydrate)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat. #856177&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RStudio</td>
			<td>Posit.co</td>
			<td>Free desktop version</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>BU530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stagetop incubator</td>
			<td>Tokai Hit</td>
			<td>INU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uracil</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#U1128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast nitrogen base (YNB) containing ammonium sulfate without amino acids</td>
			<td>BD Difco</td>
			<td>#DF0919073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>YN2_1_LT58_X2site</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>177705</td>
			<td>Pianale et al 2021</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zyla 4.2 sCMOS camera</td>
			<td>Andor</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging of mthyper7, a ratiometric biosensor for mitochondrial peroxide, in living yeast cells

La disfunción mitocondrial, o alteración funcional, se encuentra en muchas enfermedades y afecciones, incluidos los trastornos neurodegenerativos y musculoesqueléticos, el cáncer y el envejecimiento normal. Aquí, se describe un enfoque para evaluar la función mitocondrial en células de levadura vivas a resoluciones celulares y subcelulares utilizando un biosensor radiométrico mínimamente invasivo codificado genéticamente. El biosensor, HyPer7 (mtHyPer7), detecta el peróxido de hidrógeno (H2O2) en las mitocondrias. Consiste en una secuencia de señales mitocondriales fusionada a una proteína fluorescente permutada circularmente y el dominio de respuestaH 2 O2 de una proteína bacteriana OxyR. El biosensor se genera e integra en el genoma de la levadura utilizando un sistema libre de marcadores CRISPR-Cas9, para una expresión más consistente en comparación con las construcciones transmitidas por plásmidos.
mtHyPer7 está dirigido cuantitativamente a las mitocondrias, no tiene ningún efecto detectable sobre la tasa de crecimiento de la levadura o la morfología mitocondrial, y proporciona una lectura cuantitativadel H 2 O2 mitocondrial en condiciones normales de crecimiento y tras la exposición al estrés oxidativo. Este protocolo explica cómo optimizar las condiciones de obtención de imágenes utilizando un sistema de microscopio confocal de disco giratorio y realizar análisis cuantitativos utilizando software de libre acceso. Estas herramientas permiten recopilar información espacio-temporal sobre las mitocondrias tanto dentro de las células como entre las células de una población. Además, el flujo de trabajo descrito aquí se puede utilizar para validar otros biosensores.

Mitochondria are essential eukaryotic cellular organelles that are well known for their function in producing ATP through oxidative phosphorylation and electron transport1. In addition, mitochondria are sites for calcium storage, the synthesis of lipids, amino acids, fatty acid and iron-sulfur clusters, and signal transduction2,3. Within cells, mitochondria form a dynamic network with characteristic morphology and distribution, which varies according to cell type and metabolic state. Furthermore, although mitochondria can fuse and divide, not all the mitochondria in a cell are equivalent. Numerous studies have documented the functional heterogeneity of mitochondria within individual cells in attributes such as membrane potential and oxidative state4,5,6. This variation in mitochondrial function is due in part to damage to the organelle from mtDNA mutations (which occur at a higher rate than in nuclear DNA) and to oxidative damage by reactive oxygen species (ROS) generated both within and outside the organelle7,8,9. Damage to the organelle is mitigated by mitochondrial quality control mechanisms that repair the damage or eliminate mitochondria that are damaged beyond repair10.
Hydrogen peroxide (H2O2) is a reactive oxygen species that is a source of oxidative damage to cellular proteins, nucleic acids, and lipids. However, H2O2 also serves as a signaling molecule that regulates cellular activities through the reversible oxidation of thiols in target proteins11,12. H2O2 is produced from electrons that leak from the mitochondrial electron transport chain and by specific enzymes, such as NADPH oxidase and monoamine oxidases13,14,15,16,17,18,19,20. It is also inactivated by antioxidant systems, including those based on thioredoxin and glutathione21,22,23. Thus, analysis of mitochondrial H2O2 levels is critical for understanding the role of this metabolite in normal mitochondrial and cellular function and under conditions of oxidative stress.
The overall goal of this protocol is to detect mitochondrial H2O2 using a genetically encoded ratiometric H2O2 biosensor, HyPer7, that is targeted to the organelle (mtHyPer7). mtHyPer7 is a chimera consisting of the mitochondrial signal sequence from ATP9 (the Su9 presequence), a circularly permuted form of green fluorescent protein (GFP), and the H2O2-binding domain of the OxyR protein from Neisseria meningitidis24 (Figure 1). In circularly permuted GFP, the N- and C-termini of native GFP are fused and new termini are formed near the chromophore, which impart greater mobility to the protein and greater lability of its spectral characteristics compared to native GFP25. The interaction of mtHyPer7&#39;s OxyR domain with H2O2 is high-affinity, H2O2-selective, and leads to reversible oxidation of the conserved cysteine residues and disulfide bridge formation. Conformational changes associated with the oxidation of OxyR are transferred to the circularly permuted GFP in mtHyPer7, which results in a spectral shift in the excitation maximum of the mtHyPer7 chromophore from 405 nm in the reduced state to&#160;488 nm in the H2O2-oxidized state26. Thus, the ratio of fluorescence from mtHyPer7 in response to excitation at 488 nm versus 405 nm reflects the oxidation of the probe by H2O2.
Ideally, a biosensor should provide a real-time, absolute, quantitative readout of its target molecule. Unfortunately, however, this is not always possible in real-world measurements. In the case of oxidation sensors, such as mtHyPer7, the real-time readout is affected by the rate of reduction of the disulfide bridge. The reduction systems used by ROS biosensors differ, and these can dramatically alter probe response dynamics-as shown by the comparison of HyPer7, reduced by the thioredoxin system, and roGFP2-Tsa2&#916;CR, reduced by glutathione-in yeast cytosol27. Thus, to draw a conclusion about the relative H2O2 concentration from mtHyPer7 ratios, one must assume that the reduction system maintains a constant capacity during the experiment. Notwithstanding these considerations, HyPer7 and related probes have been used in various contexts to obtain information about H2O2 in living cells25,28,29.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65428/65428fig01.jpg" /> 
Figure 1: Design, molecular mechanism, and excitation/emission spectra of the H2O2 biosensor mtHyPer7. (A) The mtHyPer7 probe is derived by inserting circularly permuted GFP into the OxyR-RD domain from Neisseria meningitidis. It contains the mitochondrial targeting sequence from subunit 9 of the ATP synthase from Neurospora crassa (Su9). (B) Illustration of the H2O2-sensing mechanism of mtHyPer7. Oxidation of cysteines in the RD domain increases fluorescence emission upon excitation at 488 nm and decreases emission produced by excitation at 405 nm. (C) Excitation and emission spectra of HyPer7 in oxidized and reduced forms. This figure is reprinted with permission from Pak et al.24. Abbreviations: GFP = green fluorescent protein; cpGFP = circularly permuted GFP. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65428/65428fig01large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
This ratiometric imaging of mtHyPer7 offers important benefits for mitochondrial H2O2 quantitation24,27; it provides an internal control for probe concentration. In addition, the shift in excitation peak produced by H2O2 exposure is not complete, even in saturating concentrations of H2O2. Thus, ratio imaging can increase the sensitivity by incorporating two spectral points in the analysis.
The mtHyPer7 probe used here has a very high affinity for H2O2 and relatively low sensitivity to pH24, and has been successfully targeted to Caenorhabditis elegans mitochondria30. This protein has also been used in yeast27,31. However, previous studies relied on plasmid-borne expression of mtHyPer7, which results in cell-to-cell variability in probe expression27. In addition, the construct described in this protocol was integrated into a conserved, gene-free region on chromosome X32 using a CRISPR-based approach for marker-free integration. Expression of the integrated biosensor gene is also controlled by the strong constitutive TEF1 promoter (Figure 2). As a result, there is more stable, consistent expression of the biosensor in yeast cell populations compared to that observed using plasmid-borne biosensor expression, and cells bearing the biosensor can be propagated without the need for selective media.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65428/65428fig02.jpg" /> 
Figure 2: Generation of mtHyPer7-expressing cells by CRISPR. The Cas9 and sgRNA-containing plasmid (YN2_1_LT58_X2site) and PCR-amplified mtHyPer7-containing biosensor construct are introduced into budding yeast cells by lithium acetate transformation. The gene-free insertion site on chromosome X (X2) is recognized and cut by Cas9 protein with the sgRNA, and the biosensor is integrated into the genome by homologous recombination. After identification of the successful transformants by microscopic screening, colony PCR, and sequencing, the Cas9 plasmid is removed (cured) by growth in non-selective media. Abbreviations: sgRNA = single guide RNA; TEF = transcription enhancer factor. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65428/65428fig02large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
Finally, mtHyPer7 offers advantages over other ROS biosensors. For example, organic dyes used to detect ROS (e.g., dihydroethidium [DHE]2 and MitoSOX3) can produce uneven or nonspecific staining and are often delivered in solvents such as ethanol or dimethyl sulfoxide, which require additional controls for solvent effects. Another class of ROS biosensors are fluorescence resonance energy transfer (FRET)-based biosensors (e.g., Redoxfluor for cellular redox state4, and the peroxide sensors HSP-FRET5, OxyFRET6, and PerFRET6). These probes are genetically encoded and highly sensitive in principle and can be quantitatively targeted to mitochondria using well-characterized mitochondrial signal sequences. However, there are challenges in the use of FRET-based probes, including background due to cross-excitation and bleed-through, and stringent requirements for the proximity and orientation of the fluorophores for FRET to occur33,34. In addition, FRET probes consist of two fluorescent proteins that require larger constructs for expression in cells of interest compared to spectra-shifting probes. The protocol described here was developed to take advantage of the strengths of the HyPer7-based biosensor, and to use this compact, ratiometric, high-affinity, genetically encoded probe for quantitative imaging of peroxide in mitochondria in living yeast.

Autor destacado: Avance de la investigación mitocondrial - Biosensor mtHyper7 para análisis subcelular 

Obtención de imágenes de mtHyPer7, un biosensor radiométrico para el peróxido mitocondrial, en células vivas de levadura

Mitochondria are organelles within cells that facilitate energy mobilization, central metabolism, production of vital macromolecules, calcium storage, and signal transduction. As a result, they play a crucial role in cellular function, fitness, and lifespan control. Our research focuses on investigating the impact of mitochondria on aging using the budding yeast Saccharomyces cerevisiae as a model organism.Live cell imaging is our best tool to observe variation in mitochondrial function. Here we describe a method that utilizes a genetically encoded ratio metric spectral shifting biosensor called mitochondrial HyPer7. mtHyPer7 detects hydrogen peroxide, a reactive oxygen species, that can damage cellular constituents, but also functions as a signaling molecule in mitochondria of live cells.mtHyPer7 has a high affinity for hydrogen peroxide and low sensitivity to pH. It is integrated into the yeast genome, which results in stable and consistent expression in yeast cell populations. Finally, it is quantitatively targeted to mitochondria and has no detectable effect on cellular or mitochondrial function or fitness.Biosensors like mtHyPer7 are critical for studying mitochondrial function at subcellular resolution, for finding mechanisms underlying mitochondrial quality control, and for examining how that process affects cell fitness, feed, and lifespan. The mtHyPer7 stain provides consistent laboring in contrast to organic dyes utilized for reactive oxygen species detection. Compared to FRET-based sensors, mtHyPer7 is more compact and avoids issues such as cross-excitation and bleed through, as well as the precise positioning and the orientation requirements for FRET.

Para confirmar que mtHyPer7 es una sonda adecuada para evaluar el H 2 O2mitocondrial, se evaluó la localización de mtHyPer7 y su efecto sobre las mitocondrias de la levadura y la salud celular. Para evaluar la orientación de mtHyPer7, las mitocondrias se tiñeron con el colorante vital específico de las mitocondrias MitoTracker Red en células de levadura de control y levaduras que expresan mtHyPer7. Utilizando la tinción MitoTracker Red, las mitocondrias se resolvieron como estructuras tubulares largas que se alinearon a lo largo del eje madre-yema y se acumularon en la punta de la yema y la punta de la célula madre distal a la yema41. La morfología mitocondrial fue similar en las células control y en las células que expresan mtHyPer7. Además, mtHyPer7 se colocalizó con las mitocondrias teñidas con rojo de MitoTracker (Figura 3A). Por lo tanto, mtHyPer7 se dirigió de manera eficiente y cuantitativa a las mitocondrias sin afectar la morfología o distribución mitocondrial normal.
A continuación, se realizaron experimentos de validación adicionales para evaluar el efecto de mtHyPer7 sobre la aptitud celular y la sensibilidad al estrés oxidativo en las mitocondrias. Las tasas de crecimiento de las células que expresan mtHyPer7 en medios ricos o sintéticos a base de glucosa (YPD o SC, respectivamente) son similares a las de las células de tipo salvaje no transformadas (Figura 3B, D). Para evaluar los posibles efectos sobre el estrés oxidativo en las mitocondrias, la levadura control y la levadura que expresa mtHyPer7 fueron tratadas con bajos niveles de paraquat, una pequeña molécula redox-activa que se acumula en las mitocondrias y da lugar a niveles elevados de superóxido en el orgánulo24,27. Si la expresión de mtHyPer7 induce estrés oxidativo en las mitocondrias o protege a las mitocondrias del estrés oxidativo, entonces las células que expresan mtHyPer7 deberían exhibir una mayor o menor sensibilidad al tratamiento con paraquat, respectivamente. El tratamiento con niveles bajos de paraquat resultó en una disminución en las tasas de crecimiento de la levadura. Además, las tasas de crecimiento de las células de tipo salvaje y de las células que expresan mtHyPer7 en presencia de paraquat fueron similares (Figura 3C,E). Por lo tanto, la expresión del biosensor no creó tensiones celulares significativas en las células de levadura en ciernes ni alteró la sensibilidad de la levadura al estrés oxidativo mitocondrial.
Dada la evidencia de que mtHyPer7 es adecuado para estudiar el H 2 O 2 mitocondrial en levaduras en ciernes, se probó si mtHyPer7 podría detectar H 2 O 2 mitocondrial en levadura de tipo salvaje en fase logarítmica media y cambios en el H 2 O 2 mitocondrial inducidos por H 2 O 2 agregado externamente. Se realizó un experimento de titulación de H2O2y se midió la relación media oxidada:reducida (O/R) mtHyPer7 en mitocondrias.
Los scripts de análisis automatizados produjeron varios archivos de salida.
La imagen de relación (ratio.tif): Una pila Z que consiste en la relación de las pilas de 488 nm y 405 nm con umbral de fondo corregido. Esta pila se puede ver en Fiji sin procesamiento adicional; Sin embargo, se recomienda mejorar el contraste y/o colorear la imagen como se describe en el paso 4.3 o 5.6 del protocolo antes de visualizarla.
La imagen de la máscara (mask.tif): Una pila Z que consiste en las áreas mitocondriales umbralizadas utilizadas para el análisis. Esta imagen debe utilizarse para evaluar la precisión del umbral.
Los ROI utilizados para el análisis (ROIs.zip): Cuando este archivo se abre en Fiji, junto con la imagen de origen, los ROI se superponen a la imagen para hacer referencia cruzada a la tabla de resultados y a la imagen de origen. Cada ROI se renombra con un número de celda y un número de ROI.
Tablas de medición (NumResults.csv, DenomResults.csv, Results.csv) que contienen el área, la media y la densidad integrada de las mitocondrias umbralizadas para cada corte en las imágenes del numerador, el denominador y la proporción, respectivamente. En cortes donde las mitocondrias estaban ausentes o desenfocadas, se registra NaN.
Un archivo de registro (Log.txt) que documenta las opciones utilizadas para la corrección de fondo y ruido, el umbral y el cálculo de la proporción.
La relación O/R de mtHyPer7 mostró una respuesta dependiente de la dosis a la concentración de H2O2, que alcanzó una meseta a 1-2 mM deH2O2adicionado externamente(Figura 7). Sorprendentemente, la relación HyPer7 fue menor en las células expuestas a 0,1 mMH2O2 que en las células control, aunque esta diferencia no fue estadísticamente significativa. Una explicación para este fenómeno puede ser una respuesta de hormesis, en la que la exposición a un bajo nivel de factor estresante puede inducir respuestas de estrés, como mecanismos antioxidantes, que a su vez reducen la cantidad de ROS detectable por la sonda. Los niveles más altos de factores estresantes, por el contrario, pueden abrumar las respuestas internas al estrés y dar lugar a una lectura más alta de HyPer7.
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65428/65428fig07.jpg"> Figura 7: Respuesta de mtHyPer7 a H 2 O2 añadido externamente. (A) Proyección máxima de imágenes excitadas de 405 nm y 488 nm y proyección de intensidad media de imágenes radiométricas de mtHyPer7 en células de fase logarítmica media expuestas a diferentes concentraciones deH2O2. El pseudocolor indica la relación oxidado:reducido mtHyPer7 (escala en la parte inferior). Barra de escala = 1 μm. El contorno de la celda se muestra en blanco; n > 100 células por condición. (B) Cuantificación de la relación mtHyPer7 oxidada:reducida en células de levadura en ciernes tratadas con diferentes concentraciones deH2O2. Se muestran las medias de cinco ensayos independientes, con símbolos de diferentes formas y colores para cada ensayo. Media ± SEM de la relación de mtHyPer oxidado:reducido7: 1,794 ± 0,07627 (sin tratamiento), 1,357 ± 0,03295 (0,1 mM), 2,571 ± 0,3186 (0,5 mM), 6,693 ± 0,5194 (1 mM), 7,017 ± 0,1197 (2 mM). p < 0,0001 (ANOVA de un factor con la prueba de comparaciones múltiples de Tukey). Los valores de p se denotan como: ****p < 0,0001. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65428/65428fig07large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Finalmente, estudios previos revelaron que las mitocondrias más aptas, que son más reducidas y contienen menos superóxido, son heredadas preferentemente por las células hijas de levadura4, y que las catalasas citosólicas son transportadas y activadas en las células hijas de levadura42,43,44,45. Estos estudios documentan la herencia asimétrica de las mitocondrias durante la división de células de levadura y el papel de este proceso en la aptitud y la esperanza de vida de las células hijas, así como en la asimetría de la edad madre-hija. Para probar si existen diferencias en H2O2entre las yemas y las yemas, se midió mtHyPer7 en yemas y células madre. Se observaron diferencias en el H 2 O 2mitocondrial dentro de las células de levadura, y se detectó una disminución sutil pero estadísticamente significativa en la lectura del biosensor H 2 O 2 en las mitocondrias de la yema en comparación con las de la célula madre (Figura 8). Estos hallazgos son consistentes con hallazgos previos de que las mitocondrias en la yema están mejor protegidas del estrés oxidativo. También proporcionan documentación de que mtHyPer7 puede proporcionar una lectura cuantitativa de H 2 O2mitocondrial con resolución celular y subcelular en levaduras en ciernes.
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65428/65428fig08.jpg"> Figura 8: El nivel mitocondrial de H2O2es más bajo en la célula hija. (A) Proyección máxima de una imagen radiométrica de mtHyPer7 en una célula representativa. El pseudocolor indica la relación oxidado:reducido mtHyPer7 (escala en la parte inferior). Las diferencias subcelulares en la proporción son evidentes (puntas de flecha). Barra de escala = 1 μm. Contorno de la celda: blanco. (B) Diferencia entre la relación mtHyPer7 en la yema y la célula madre. Para cada celda individual, el valor de la proporción madre se restó del valor de la proporción de yemas y se graficó como un punto. n = 193 células agrupadas de cinco experimentos independientes, que se muestran con símbolos de diferentes colores para cada experimento. Media ± SEM de la diferencia entre la relación mtHyPer7 en las células madre y yema: -0,04297 ± 0,01266. p = 0.0008 (prueba t pareada) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65428/65428fig08large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Tabla suplementaria S1: Cepas utilizadas en este estudio. Lista de cepas de levadura utilizadas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65428/65428_Supplemental%20Table%201%20Strains%20used%20in%20this%20study-R2.xls" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Tabla suplementaria S2: Plásmidos utilizados en este estudio. Lista de plásmidos utilizados. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65428/Supplemental%20Table%202%20Plasmids%20used%20in%20this%20study-R2.xls" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Tabla suplementaria S3: Imprimaciones utilizadas en este estudio. Lista de imprimaciones utilizadas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65428/65428_Supplemental%20Table%203%20Primers%20used%20in%20this%20study-R2.xls" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Archivo Suplementario 1: Protocolo para la construcción de plásmidos biosensores. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65428/65428_Yang%20et%20al%20Supp%20Protocol%202023.docx" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Archivo complementario 2: Scripts para análisis automatizado. Para cada script, se proporcionan archivos de entrada y archivos de salida de ejemplo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65428/biosensor-supplemental-coding-files.zip" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>

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El peróxido de hidrógeno (H2O2) es tanto una fuente de daño oxidativo como una molécula de señalización. Este protocolo describe cómo medir el H 2 O2mitocondrial utilizando HyPer7 dirigido a mitocondrias (mtHyPer7), un biosensor radiométrico codificado genéticamente, en levaduras vivas. Detalla cómo optimizar las condiciones de obtención de imágenes y realizar análisis cuantitativos celulares y subcelulares utilizando software de libre acceso.

Mitochondrial dysfunction, or functional alteration, is found in many diseases and conditions, including neurodegenerative and musculoskeletal disorders, ...

Las mitocondrias son orgánulos dentro de las células que facilitan la movilización de energía, el metabolismo central, la producción de macromoléculas vitales, el almacenamiento de calcio y la transducción de señales. Como resultado, desempeñan un papel crucial en la función celular, el estado físico y el control de la vida útil. Nuestra investigación se centra en investigar el impacto de las mitocondrias en el envejecimiento utilizando la levadura en ciernes Saccharomyces cerevisiae como organismo modelo.Las imágenes de células vivas son nuestra mejor herramienta para observar la variación en la función mitocondrial. Aquí describimos un método que utiliza un biosensor de desplazamiento espectral métrico de proporción codificado genéticamente llamado HyPer mitocondrial. mtHyPer7 detecta el peróxido de hidrógeno, una especie reactiva de oxígeno, que puede dañar los constituyentes celulares, pero también funciona como una molécula de señalización en las mitocondrias de las células vivas.mtHyPer7 tiene una alta afinidad por el peróxido de hidrógeno y una baja sensibilidad al pH. Está integrado en el genoma de la levadura, lo que da como resultado una expresión estable y consistente en las poblaciones de células de levadura. Por último, se dirige cuantitativamente a las mitocondrias y no tiene ningún efecto detectable sobre la función o la aptitud celular o mitocondrial.Los biosensores como mtHyPer7 son fundamentales para estudiar la función mitocondrial a resolución subcelular, para encontrar mecanismos subyacentes al control de calidad mitocondrial y para examinar cómo ese proceso afecta la aptitud celular, la alimentación y la vida útil. La tinción mtHyPer7 proporciona un trabajo de trabajo consistente en contraste con los colorantes orgánicos utilizados para la detección de especies reactivas de oxígeno. En comparación con los sensores basados en FRET, mtHyPer7 es más compacto y evita problemas como la excitación cruzada y el sangrado, así como el posicionamiento preciso y los requisitos de orientación para FRET.

Obtención de imágenes de mtHyPer7, un biosensor radiométrico para el peróxido mitocondrial, en células vivas de levadura

Abstract