ثقافة مجمعة غير مجزأة لعضلات الهيكل العظمي للفأر لتلخيص هدوء الخلايا الجذعية المتخصصة

Summary

تتكون العضلات الهيكلية من أنواع متعددة من الخلايا، بما في ذلك الخلايا الجذعية المقيمة، ولكل منها مساهمة خاصة في الاتزان الداخلي للعضلات وتجديدها. هنا ، يتم وصف ثقافة 2D للخلايا الجذعية العضلية ومكانة الخلايا العضلية في بيئة خارج الجسم الحي تحافظ على العديد من الخصائص الفسيولوجية والحيوية والبيئية.

Abstract

العضلات الهيكلية هي أكبر نسيج في الجسم وتؤدي وظائف متعددة ، من الحركة إلى التحكم في درجة حرارة الجسم. تعتمد وظائفها والتعافي من الإصابات على العديد من أنواع الخلايا وعلى الإشارات الجزيئية بين خلايا العضلات الأساسية (الألياف العضلية والخلايا الجذعية العضلية) ومكانتها. لا تحافظ معظم الإعدادات التجريبية على هذه البيئة المكروية الفسيولوجية المعقدة ، كما أنها لا تسمح بالدراسة خارج الجسم الحي للخلايا الجذعية العضلية في هدوء ، وهي حالة خلوية ضرورية بالنسبة لهم. هنا ، يتم تحديد بروتوكول للثقافة خارج الجسم الحي للخلايا الجذعية العضلية مع المكونات الخلوية لمكانتها. من خلال الانهيار الميكانيكي والأنزيمي للعضلات ، يتم الحصول على مزيج من أنواع الخلايا ، والتي يتم وضعها في ثقافة 2D. يظهر التلوين المناعي أنه في غضون أسبوع 1 ، توجد خلايا متخصصة متعددة في الثقافة جنبا إلى جنب مع الألياف العضلية ، والأهم من ذلك ، الخلايا الإيجابية Pax7 التي تعرض خصائص الخلايا الجذعية العضلية الهادئة. هذه الخصائص الفريدة تجعل هذا البروتوكول أداة قوية لتضخيم الخلايا وتوليد خلايا جذعية شبيهة بالهدوء يمكن استخدامها لمعالجة الأسئلة الأساسية والانتقالية.

Introduction

تعتمد الحركة والتنفس والتمثيل الغذائي ووضعية الجسم والحفاظ على درجة حرارة الجسم على العضلات الهيكلية ، وبالتالي يمكن أن تسبب الأعطال في العضلات الهيكلية أمراضا منهكة (مثل اعتلالات العضلات وضمور العضلات وما إلى ذلك) ¹. نظرا لوظائفها الأساسية ووفرتها ، جذبت العضلات الهيكلية انتباه مختبرات الأبحاث في جميع أنحاء العالم التي تسعى جاهدة لفهم الجوانب الرئيسية التي تدعم وظيفة العضلات الطبيعية ويمكن أن تكون بمثابة أهداف علاجية. بالإضافة إلى ذلك ، تعد العضلات الهيكلية نموذجا يستخدم على نطاق واسع لدراسة التجدد ووظيفة الخلايا الجذعية ، حيث يمكن للعضلات السليمة إصلاح ذاتي بالكامل بعد الإصابة الكاملة والانحطاط ، ويرجع ذلك في الغالب إلى ....

Protocol

امتثلت جميع التجارب للوائح الحيوانية الفرنسية والاتحاد الأوروبي في معهد موندور للبحوث الطبية الحيوية (INSERM U955) ، ولا سيما التوجيه 2010/63 / UE. تم الاحتفاظ بالحيوانات في بيئة خاضعة للرقابة وغنية في مرافق الحيوانات بأرقام الشهادات A94 028 379 و D94-028-028 ؛ تم التعامل معها فقط من قبل الباحثين المعتمدين و?.......

Discussion

ترتكز وظيفة العضلات الهيكلية للبالغين على مجموعة منسقة بدقة من التفاعلات الخلوية والإشارات الجزيئية. هنا ، يتم تقديم طريقة تسمح بدراسة هذه المعلمات في بيئة خارج الجسم الحي تشبه إلى حد كبير البيئة المكروية الفسيولوجية.

أبلغت عدة مجموعات في المختبر عن طرق لزراعة ا?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
anti-CD31	BD	550274	dilution 1:100
anti-FOSB	Santa Cruz	sc-7203	dilution 1:200
anti-GFP	Abcam	ab13970	dilution 1:1000
anti-Ki67	Abcam	ab16667	dilution 1:1000
anti-MyHC	DSHB	MF20-c	dilution 1:400
anti-MYOD	Active Motif	39991	dilution 1:200
anti-MYOG	Santa Cruz	sc-576	dilution 1:150
anti-Pax7	Santa Cruz	sc-81648	dilution 1:100
anti-PDGFRα	Invitrogen	PA5-16571	dilution 1:50
b-FGF	Peprotech	450-33	concentration 4 ng/mL
bovine serum albumin (BSA) – used for digestion	Sigma Aldrich	A7906-1006	concentration 0.2%
BSA IgG-free, protease-free – used for staining	Jackson ImmunoResearch	001-000-162	concentration 5%
cell strainer 40 um	Dominique Dutscher	352340
cell strainer 70 um	Dominique Dutscher	352350
cell strainer 100 um	Dominique Dutscher	352360
Collagenase	Roche	10103586001	concentration 0.5 U/mL
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Euromedex	UD8050-05-A
Dispase	Roche	4942078001	concentration 3 U/mL
Dissection forceps size 5	Fine Science Tools	91150-20
Dissection forceps size 55	Fine Science Tools	11295-51
Dissection scissors (big, straight)	Fine Science Tools	9146-11	ideal for chopping
Dissection scissors (small, curved)	Fine Science Tools	15017-10
Dissection scissors (small, straight)	Fine Science Tools	14084-08
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)	ThermoFisher	41966-029
EdU Click-iT kit	ThermoFisher	C10340
Fetal bovine serum – option 1	Eurobio	CVF00-01
Fetal bovine serum – option 2	Gibco	10270-106
Matrigel	Corning Life Sciences	354234	coating solution
Parafilm	Dominique Dutscher	090261	flexible film
Penicillin streptomycin	Gibco	15140-122
Paraformaldehyde – option 1	PanReac AppliChem ITW Reagents	211511.1209	concentration 4%
Paraformaldeyde – option 2	ThermoFisher	28908	concentration 4%
Shaking water bath	ThermoFisher	TSSWB27
TritonX100	Sigma Aldrich	T8532-500 ML	concentration 0.5%
Wild-type mice	Janvier	C57BL/6NRj