小鼠骨骼肌的普通散装培养物，以概括生态位和干细胞静止

Summary

骨骼肌由多种细胞类型组成，包括常驻干细胞，每种细胞都对肌肉稳态和再生有特殊贡献。在这里，描述了肌肉干细胞的 2D 培养和肌肉细胞生态位在 离体 环境中保留了许多生理、 体内和环境特征。

Abstract

骨骼肌是身体最大的组织，具有从运动到体温控制的多种功能。它的功能和从损伤中恢复取决于多种细胞类型以及核心肌肉细胞（肌纤维、肌肉干细胞）与其生态位之间的分子信号。大多数实验环境不能保留这种复杂的生理微环境，也不允许对静止的肌肉干细胞进行 离体 研究，这种细胞状态对它们至关重要。在这里，概述了具有其生态位的细胞成分的肌肉干细胞的 离体 培养方案。通过肌肉的机械和酶促分解，获得细胞类型的混合物，并将其放入 2D 培养物中。免疫染色显示，在 1 周内，培养物中存在多个生态位细胞以及具有静止肌肉干细胞特征的 Pax7 阳性细胞。这些独特的特性使该协议成为细胞扩增和产生可用于解决基本和转化问题的静止样干细胞的强大工具。

Introduction

运动、呼吸、新陈代谢、身体姿势和体温维持都依赖于骨骼肌，因此骨骼肌功能障碍会导致使人衰弱的病症（即肌病、肌营养不良等）。¹. 鉴于其基本功能和丰富性，骨骼肌引起了全球研究实验室的关注，这些实验室致力于了解支持正常肌肉功能并可作为治疗靶点的关键方面。此外，骨骼肌是研究再生和干细胞功能的广泛使用模型，因为健康的肌肉在完全损伤和退化后可以完全自我修复，这主要是由于其驻留的干细胞²;这些也称为卫星细胞，位于肌纤维外围的基底层下³.

成人骨骼肌的核心细胞是肌纤维（长合胞体多核细胞）和卫星细胞（具有肌源性潜力的干细胞，在损伤激活它们之前处于静止状态）。后者细胞是肌肉再生的中心细胞，在没有它们的情况下，这个过程不会发生4,5,6,7。在它们的直接微环境中，有多种细胞类型和分子因子向它们发出信号。这个生态位在整个发育过程中逐渐建立，直到成年⁸.成人肌肉含有多种细胞类型（内皮细胞、周细胞、巨噬细胞、纤维脂肪祖....

Protocol

所有实验均符合法国和欧盟的动物法规，特别是指令2010/63/UE。动物被饲养在动物设施的受控和富集环境中，认证编号为A94 028 379和D94-028-028;它们仅由授权的研究人员和动物看护人处理，并由动物饲养人员目视检查其一生中是否有不适迹象。他们在解剖前因颈椎脱位而被安乐死。在动物的一生中没有进行任何介入手术;因此，没有必要获得伦理委员会和法国高等教育、研究和创新部对该程序的批准。.......

Discussion

成人骨骼肌功能由一组精心编排的细胞相互作用和分子信号支撑。在这里，提出了一种方法，该方法允许在与生理微环境非常相似的 离体 环境中研究这些参数。

一些小组已经报道了体外培养肌原细胞的方法。这些方法旨在分离卫星细胞以研究其肌源祖细胞特性。使用两种主要方法分离纯卫星细胞，从比目鱼肌和/或 EDL 肌肉¹⁸的分离纤维培养物?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
anti-CD31	BD	550274	dilution 1:100
anti-FOSB	Santa Cruz	sc-7203	dilution 1:200
anti-GFP	Abcam	ab13970	dilution 1:1000
anti-Ki67	Abcam	ab16667	dilution 1:1000
anti-MyHC	DSHB	MF20-c	dilution 1:400
anti-MYOD	Active Motif	39991	dilution 1:200
anti-MYOG	Santa Cruz	sc-576	dilution 1:150
anti-Pax7	Santa Cruz	sc-81648	dilution 1:100
anti-PDGFRα	Invitrogen	PA5-16571	dilution 1:50
b-FGF	Peprotech	450-33	concentration 4 ng/mL
bovine serum albumin (BSA) – used for digestion	Sigma Aldrich	A7906-1006	concentration 0.2%
BSA IgG-free, protease-free – used for staining	Jackson ImmunoResearch	001-000-162	concentration 5%
cell strainer 40 um	Dominique Dutscher	352340
cell strainer 70 um	Dominique Dutscher	352350
cell strainer 100 um	Dominique Dutscher	352360
Collagenase	Roche	10103586001	concentration 0.5 U/mL
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Euromedex	UD8050-05-A
Dispase	Roche	4942078001	concentration 3 U/mL
Dissection forceps size 5	Fine Science Tools	91150-20
Dissection forceps size 55	Fine Science Tools	11295-51
Dissection scissors (big, straight)	Fine Science Tools	9146-11	ideal for chopping
Dissection scissors (small, curved)	Fine Science Tools	15017-10
Dissection scissors (small, straight)	Fine Science Tools	14084-08
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)	ThermoFisher	41966-029
EdU Click-iT kit	ThermoFisher	C10340
Fetal bovine serum – option 1	Eurobio	CVF00-01
Fetal bovine serum – option 2	Gibco	10270-106
Matrigel	Corning Life Sciences	354234	coating solution
Parafilm	Dominique Dutscher	090261	flexible film
Penicillin streptomycin	Gibco	15140-122
Paraformaldehyde – option 1	PanReac AppliChem ITW Reagents	211511.1209	concentration 4%
Paraformaldeyde – option 2	ThermoFisher	28908	concentration 4%
Shaking water bath	ThermoFisher	TSSWB27
TritonX100	Sigma Aldrich	T8532-500 ML	concentration 0.5%
Wild-type mice	Janvier	C57BL/6NRj