Ufraktioneret bulkkultur af museskeletmuskulatur for at rekapitulere niche- og stamcellestilstand

Summary

Skeletmuskulatur omfatter flere celletyper, herunder residente stamceller, hver med et særligt bidrag til muskelhomeostase og regenerering. Her beskrives 2D-kulturen af muskelstamceller og muskelcellenichen i en ex vivo-indstilling, der bevarer mange af de fysiologiske, in vivo og miljømæssige egenskaber.

Abstract

Skeletmuskulatur er kroppens største væv og udfører flere funktioner, fra bevægelse til kropstemperaturkontrol. Dens funktionalitet og genopretning fra skader afhænger af en lang række celletyper og af molekylære signaler mellem kernemuskelcellerne (myofibre, muskelstamceller) og deres niche. De fleste eksperimentelle indstillinger bevarer ikke dette komplekse fysiologiske mikromiljø, og de tillader heller ikke ex vivo-undersøgelse af muskelstamceller i hvile, en celletilstand, der er afgørende for dem. Her skitseres en protokol for ex vivo-kulturen af muskelstamceller med cellulære komponenter i deres niche. Gennem mekanisk og enzymatisk nedbrydning af muskler opnås en blanding af celletyper, som sættes i 2D-kultur. Immunfarvning viser, at inden for 1 uge er flere nicheceller til stede i kultur sammen med myofibre og vigtigere Pax7-positive celler, der viser egenskaberne ved hvilende muskelstamceller. Disse unikke egenskaber gør denne protokol til et kraftfuldt værktøj til celleforstærkning og generering af hvilende-lignende stamceller, der kan bruges til at løse grundlæggende og translationelle spørgsmål.

Introduction

Bevægelse, vejrtrækning, stofskifte, kropsholdning og vedligeholdelse af kropstemperatur afhænger alle af skeletmuskulatur, og funktionsfejl i skeletmuskulaturen kan således forårsage svækkende patologier (dvs. myopatier, muskeldystrofier osv.) ¹. I betragtning af dets væsentlige funktioner og overflod har skeletmuskulatur henledt opmærksomheden fra forskningslaboratorier over hele verden, der stræber efter at forstå de vigtigste aspekter, der understøtter normal muskelfunktion og kan tjene som terapeutiske mål. Derudover er skeletmuskulatur en meget anvendt model til at studere regenerering og stamcellefunktion, da sund m....

Protocol

Alle forsøg overholdt franske og EU-dyrebestemmelser på Institut Mondor de Recherche Biomédicale (INSERM U955), navnlig direktiv 2010/63/EU. Dyrene blev holdt i et kontrolleret og beriget miljø på dyrefaciliteterne med certificeringsnumrene A94 028 379 og D94-028-028. De blev kun håndteret af autoriserede forskere og dyrepassere, og de blev visuelt inspiceret af dyrestaldpersonale for tegn på ubehag i løbet af deres levetid. De blev aflivet ved cervikal dislokation før dissektion. Der blev ikke udført intervent.......

Discussion

Voksen skeletmuskelfunktion understøttes af et fint orkestreret sæt cellulære interaktioner og molekylære signaler. Her præsenteres en metode, der giver mulighed for undersøgelse af disse parametre i en ex vivo-indstilling , der ligner det fysiologiske mikromiljø.

Flere grupper har rapporteret in vitro metoder til dyrkning af myogene celler. Disse metoder havde til formål at isolere satellitceller for at studere deres myogene stamfaderegenskaber. To hovedmetoder anven.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
anti-CD31	BD	550274	dilution 1:100
anti-FOSB	Santa Cruz	sc-7203	dilution 1:200
anti-GFP	Abcam	ab13970	dilution 1:1000
anti-Ki67	Abcam	ab16667	dilution 1:1000
anti-MyHC	DSHB	MF20-c	dilution 1:400
anti-MYOD	Active Motif	39991	dilution 1:200
anti-MYOG	Santa Cruz	sc-576	dilution 1:150
anti-Pax7	Santa Cruz	sc-81648	dilution 1:100
anti-PDGFRα	Invitrogen	PA5-16571	dilution 1:50
b-FGF	Peprotech	450-33	concentration 4 ng/mL
bovine serum albumin (BSA) – used for digestion	Sigma Aldrich	A7906-1006	concentration 0.2%
BSA IgG-free, protease-free – used for staining	Jackson ImmunoResearch	001-000-162	concentration 5%
cell strainer 40 um	Dominique Dutscher	352340
cell strainer 70 um	Dominique Dutscher	352350
cell strainer 100 um	Dominique Dutscher	352360
Collagenase	Roche	10103586001	concentration 0.5 U/mL
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Euromedex	UD8050-05-A
Dispase	Roche	4942078001	concentration 3 U/mL
Dissection forceps size 5	Fine Science Tools	91150-20
Dissection forceps size 55	Fine Science Tools	11295-51
Dissection scissors (big, straight)	Fine Science Tools	9146-11	ideal for chopping
Dissection scissors (small, curved)	Fine Science Tools	15017-10
Dissection scissors (small, straight)	Fine Science Tools	14084-08
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)	ThermoFisher	41966-029
EdU Click-iT kit	ThermoFisher	C10340
Fetal bovine serum – option 1	Eurobio	CVF00-01
Fetal bovine serum – option 2	Gibco	10270-106
Matrigel	Corning Life Sciences	354234	coating solution
Parafilm	Dominique Dutscher	090261	flexible film
Penicillin streptomycin	Gibco	15140-122
Paraformaldehyde – option 1	PanReac AppliChem ITW Reagents	211511.1209	concentration 4%
Paraformaldeyde – option 2	ThermoFisher	28908	concentration 4%
Shaking water bath	ThermoFisher	TSSWB27
TritonX100	Sigma Aldrich	T8532-500 ML	concentration 0.5%
Wild-type mice	Janvier	C57BL/6NRj