Niet-gefractioneerde bulkkweek van skeletspieren van muizen om niche- en stamcelrust te recapituleren

Summary

Skeletspieren bestaan uit meerdere celtypen, waaronder residente stamcellen, elk met een speciale bijdrage aan de homeostase en regeneratie van spieren. Hier worden de 2D-kweek van spierstamcellen en de spiercelniche in een ex vivo setting beschreven die veel van de fysiologische, in vivo en omgevingskenmerken behoudt.

Abstract

Skeletspieren zijn het grootste weefsel van het lichaam en vervullen meerdere functies, van voortbeweging tot het regelen van de lichaamstemperatuur. De functionaliteit en het herstel van blessures zijn afhankelijk van een veelheid aan celtypen en van moleculaire signalen tussen de kernspiercellen (myovezels, spierstamcellen) en hun niche. De meeste experimentele instellingen behouden deze complexe fysiologische micro-omgeving niet, en ze laten ook niet de ex vivo studie van spierstamcellen in rust toe, een celtoestand die voor hen cruciaal is. Hier wordt een protocol geschetst voor de ex vivo kweek van spierstamcellen met cellulaire componenten van hun niche. Door de mechanische en enzymatische afbraak van spieren wordt een mengsel van celtypen verkregen, dat in 2D-kweek wordt gebracht. Immunokleuring toont aan dat binnen 1 week meerdere nichecellen in kweek aanwezig zijn naast myovezels en, belangrijker nog, Pax7-positieve cellen die de kenmerken vertonen van slapende spierstamcellen. Deze unieke eigenschappen maken dit protocol tot een krachtig hulpmiddel voor celamplificatie en het genereren van rustgevende stamcellen die kunnen worden gebruikt om fundamentele en translationele vragen te beantwoorden.

Introduction

Beweging, ademhaling, metabolisme, lichaamshouding en het handhaven van de lichaamstemperatuur zijn allemaal afhankelijk van skeletspieren, en storingen in de skeletspier kunnen dus slopende pathologieën veroorzaken (d.w.z. myopathieën, spierdystrofieën, enz.) ¹. Gezien de essentiële functies en overvloed ervan, hebben skeletspieren de aandacht getrokken van onderzoekslaboratoria over de hele wereld die ernaar streven de belangrijkste aspecten te begrijpen die de normale spierfunctie ondersteunen en als therapeutische doelen kunnen dienen. Bovendien zijn skeletspieren een veelgebruikt model om regeneratie en stamcelfunctie....

Protocol

Alle proeven voldeden aan de Franse en EU-voorschriften voor dieren van het Institut Mondor de Recherche Biomédicale (INSERM U955), met name de richtlijn 2010/63/UE. De dieren werden gehouden in een gecontroleerde en verrijkte omgeving in de dierenfaciliteiten met certificeringsnummers A94 028 379 en D94-028-028; Ze werden alleen gehanteerd door geautoriseerde onderzoekers en dierenverzorgers, en ze werden tijdens hun leven visueel geïnspecteerd door personeel van dierenverblijven op tekenen van ongemak. Ze werden geë.......

Discussion

De volwassen skeletspierfunctie wordt ondersteund door een fijn georkestreerde reeks cellulaire interacties en moleculaire signalen. Hier wordt een methode gepresenteerd die het mogelijk maakt om deze parameters te bestuderen in een ex vivo setting die sterk lijkt op de fysiologische micro-omgeving.

Verschillende groepen hebben in vitro methoden gerapporteerd om myogene cellen te kweken. Deze methoden waren gericht op het isoleren van satellietcellen om hun myogene voorlopere.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
anti-CD31	BD	550274	dilution 1:100
anti-FOSB	Santa Cruz	sc-7203	dilution 1:200
anti-GFP	Abcam	ab13970	dilution 1:1000
anti-Ki67	Abcam	ab16667	dilution 1:1000
anti-MyHC	DSHB	MF20-c	dilution 1:400
anti-MYOD	Active Motif	39991	dilution 1:200
anti-MYOG	Santa Cruz	sc-576	dilution 1:150
anti-Pax7	Santa Cruz	sc-81648	dilution 1:100
anti-PDGFRα	Invitrogen	PA5-16571	dilution 1:50
b-FGF	Peprotech	450-33	concentration 4 ng/mL
bovine serum albumin (BSA) – used for digestion	Sigma Aldrich	A7906-1006	concentration 0.2%
BSA IgG-free, protease-free – used for staining	Jackson ImmunoResearch	001-000-162	concentration 5%
cell strainer 40 um	Dominique Dutscher	352340
cell strainer 70 um	Dominique Dutscher	352350
cell strainer 100 um	Dominique Dutscher	352360
Collagenase	Roche	10103586001	concentration 0.5 U/mL
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Euromedex	UD8050-05-A
Dispase	Roche	4942078001	concentration 3 U/mL
Dissection forceps size 5	Fine Science Tools	91150-20
Dissection forceps size 55	Fine Science Tools	11295-51
Dissection scissors (big, straight)	Fine Science Tools	9146-11	ideal for chopping
Dissection scissors (small, curved)	Fine Science Tools	15017-10
Dissection scissors (small, straight)	Fine Science Tools	14084-08
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)	ThermoFisher	41966-029
EdU Click-iT kit	ThermoFisher	C10340
Fetal bovine serum – option 1	Eurobio	CVF00-01
Fetal bovine serum – option 2	Gibco	10270-106
Matrigel	Corning Life Sciences	354234	coating solution
Parafilm	Dominique Dutscher	090261	flexible film
Penicillin streptomycin	Gibco	15140-122
Paraformaldehyde – option 1	PanReac AppliChem ITW Reagents	211511.1209	concentration 4%
Paraformaldeyde – option 2	ThermoFisher	28908	concentration 4%
Shaking water bath	ThermoFisher	TSSWB27
TritonX100	Sigma Aldrich	T8532-500 ML	concentration 0.5%
Wild-type mice	Janvier	C57BL/6NRj