Coltura di massa non frazionata di muscolo scheletrico di topo per ricapitolare la quiescenza di nicchie e cellule staminali

Summary

Il muscolo scheletrico comprende più tipi di cellule, comprese le cellule staminali residenti, ognuna con un contributo speciale all'omeostasi e alla rigenerazione muscolare. Qui vengono descritte la coltura 2D di cellule staminali muscolari e la nicchia delle cellule muscolari in un ambiente ex vivo che conserva molte delle caratteristiche fisiologiche, in vivo e ambientali.

Abstract

Il muscolo scheletrico è il tessuto più grande del corpo e svolge molteplici funzioni, dalla locomozione al controllo della temperatura corporea. La sua funzionalità e il recupero dagli infortuni dipendono da una moltitudine di tipi di cellule e da segnali molecolari tra le cellule muscolari centrali (miofibre, cellule staminali muscolari) e la loro nicchia. La maggior parte delle impostazioni sperimentali non preserva questo complesso microambiente fisiologico, e non consente nemmeno lo studio ex vivo delle cellule staminali muscolari in quiescenza, uno stato cellulare che è cruciale per loro. Qui, viene delineato un protocollo per la coltura ex vivo di cellule staminali muscolari con componenti cellulari della loro nicchia. Attraverso la scomposizione meccanica ed enzimatica dei muscoli, si ottiene una miscela di tipi cellulari, che viene messa in coltura 2D. L'immunocolorazione mostra che entro 1 settimana, più cellule di nicchia sono presenti in coltura insieme alle miofibre e, soprattutto, alle cellule Pax7-positive che mostrano le caratteristiche delle cellule staminali muscolari quiescenti. Queste proprietà uniche rendono questo protocollo un potente strumento per l'amplificazione cellulare e la generazione di cellule staminali quiescenti che possono essere utilizzate per affrontare domande fondamentali e traslazionali.

Introduction

Il movimento, la respirazione, il metabolismo, la postura del corpo e il mantenimento della temperatura corporea dipendono tutti dal muscolo scheletrico e i malfunzionamenti del muscolo scheletrico possono, quindi, causare patologie debilitanti (ad esempio, miopatie, distrofie muscolari, ecc.) ¹. Date le sue funzioni essenziali e l'abbondanza, il muscolo scheletrico ha attirato l'attenzione dei laboratori di ricerca di tutto il mondo che si sforzano di comprendere gli aspetti chiave che supportano la normale funzione muscolare e possono fungere da bersagli terapeutici. Inoltre, il muscolo scheletrico è un modello ampiament....

Protocol

Tutti gli esperimenti sono stati conformi alle normative animali francesi e dell'UE presso l'Institut Mondor de Recherche Biomédicale (INSERM U955), in particolare la direttiva 2010/63/UE. Gli animali sono stati tenuti in ambiente controllato e arricchito presso le strutture zootecniche con i numeri di certificazione A94 028 379 e D94-028-028; Sono stati maneggiati solo da ricercatori autorizzati e custodi di animali e sono stati ispezionati visivamente dal personale di stabulazione per animali per segni di disagio dura.......

Discussion

La funzione del muscolo scheletrico adulto è sostenuta da un insieme finemente orchestrato di interazioni cellulari e segnali molecolari. Qui viene presentato un metodo che consente lo studio di questi parametri in un ambiente ex vivo che assomiglia molto al microambiente fisiologico.

Diversi gruppi hanno riportato metodi in vitro per la coltura di cellule miogeniche. Questi metodi miravano a isolare le cellule satelliti per studiare le loro proprietà progenitrici miogenich.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
anti-CD31	BD	550274	dilution 1:100
anti-FOSB	Santa Cruz	sc-7203	dilution 1:200
anti-GFP	Abcam	ab13970	dilution 1:1000
anti-Ki67	Abcam	ab16667	dilution 1:1000
anti-MyHC	DSHB	MF20-c	dilution 1:400
anti-MYOD	Active Motif	39991	dilution 1:200
anti-MYOG	Santa Cruz	sc-576	dilution 1:150
anti-Pax7	Santa Cruz	sc-81648	dilution 1:100
anti-PDGFRα	Invitrogen	PA5-16571	dilution 1:50
b-FGF	Peprotech	450-33	concentration 4 ng/mL
bovine serum albumin (BSA) – used for digestion	Sigma Aldrich	A7906-1006	concentration 0.2%
BSA IgG-free, protease-free – used for staining	Jackson ImmunoResearch	001-000-162	concentration 5%
cell strainer 40 um	Dominique Dutscher	352340
cell strainer 70 um	Dominique Dutscher	352350
cell strainer 100 um	Dominique Dutscher	352360
Collagenase	Roche	10103586001	concentration 0.5 U/mL
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Euromedex	UD8050-05-A
Dispase	Roche	4942078001	concentration 3 U/mL
Dissection forceps size 5	Fine Science Tools	91150-20
Dissection forceps size 55	Fine Science Tools	11295-51
Dissection scissors (big, straight)	Fine Science Tools	9146-11	ideal for chopping
Dissection scissors (small, curved)	Fine Science Tools	15017-10
Dissection scissors (small, straight)	Fine Science Tools	14084-08
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)	ThermoFisher	41966-029
EdU Click-iT kit	ThermoFisher	C10340
Fetal bovine serum – option 1	Eurobio	CVF00-01
Fetal bovine serum – option 2	Gibco	10270-106
Matrigel	Corning Life Sciences	354234	coating solution
Parafilm	Dominique Dutscher	090261	flexible film
Penicillin streptomycin	Gibco	15140-122
Paraformaldehyde – option 1	PanReac AppliChem ITW Reagents	211511.1209	concentration 4%
Paraformaldeyde – option 2	ThermoFisher	28908	concentration 4%
Shaking water bath	ThermoFisher	TSSWB27
TritonX100	Sigma Aldrich	T8532-500 ML	concentration 0.5%
Wild-type mice	Janvier	C57BL/6NRj