Нефракционированная объемная культура скелетных мышц мышей для повторения нишевого покоя и покоя стволовых клеток

Summary

Скелетные мышцы состоят из нескольких типов клеток, включая резидентные стволовые клетки, каждый из которых вносит особый вклад в гомеостаз и регенерацию мышц. Здесь описывается 2D-культура мышечных стволовых клеток и ниша мышечных клеток в условиях ex vivo, которая сохраняет многие физиологические, in vivo и экологические характеристики.

Abstract

Скелетные мышцы являются самой большой тканью тела и выполняют множество функций, от передвижения до контроля температуры тела. Его функциональность и восстановление после травм зависят от множества типов клеток и от молекулярных сигналов между основными мышечными клетками (миоволокнами, мышечными стволовыми клетками) и их нишей. Большинство экспериментальных установок не сохраняют это сложное физиологическое микроокружение, а также не позволяют исследовать ex vivo мышечные стволовые клетки в состоянии покоя, которое имеет для них решающее значение. Здесь изложен протокол культивирования ex vivo мышечных стволовых клеток с клеточными компонентами их ниши. Путем механического и ферментативного расщепления мышц получается смесь типов клеток, которая помещается в 2D-культуру. Иммуноокрашивание показывает, что в течение 1 недели в культуре присутствуют несколько нишевых клеток наряду с миоволокнами и, что важно, Pax7-положительными клетками, которые проявляют характеристики спящих мышечных стволовых клеток. Эти уникальные свойства делают этот протокол мощным инструментом для клеточной амплификации и получения покоящихся стволовых клеток, которые могут быть использованы для решения фундаментальных и трансляционных вопросов.

Introduction

Движение, дыхание, обмен веществ, положение тела и поддержание температуры тела зависят от скелетной мускулатуры, и сбои в работе скелетных мышц могут, таким образом, вызывать изнурительные патологии (например, миопатии, мышечные дистрофии и т. д.). ¹. Благодаря своим основным функциям и изобилию, скелетные мышцы привлекли внимание исследовательских лабораторий по всему миру, которые стремятся понять ключевые аспекты, поддерживающие нормальную работу мышц и служащие терапевтическими мишенями. Кроме того, скелетные мышцы являются широко используемой моделью для изучения регенерации и функции стволовых клеток, поскольку здор....

Protocol

Все эксперименты проводились в соответствии с французскими и европейскими нормами в отношении животных в Институте биологических исследований (INSERM U955), в частности, директивой 2010/63/UE. Животные содержались в контролируемой и обогащенной среде на животноводческих объектах с номерами се.......

Discussion

Функция скелетных мышц взрослого человека подкрепляется тонко организованным набором клеточных взаимодействий и молекулярных сигналов. Здесь представлен метод, позволяющий изучать эти параметры в условиях ex vivo , близком к физиологическому микроокружению.

Нескол?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
anti-CD31	BD	550274	dilution 1:100
anti-FOSB	Santa Cruz	sc-7203	dilution 1:200
anti-GFP	Abcam	ab13970	dilution 1:1000
anti-Ki67	Abcam	ab16667	dilution 1:1000
anti-MyHC	DSHB	MF20-c	dilution 1:400
anti-MYOD	Active Motif	39991	dilution 1:200
anti-MYOG	Santa Cruz	sc-576	dilution 1:150
anti-Pax7	Santa Cruz	sc-81648	dilution 1:100
anti-PDGFRα	Invitrogen	PA5-16571	dilution 1:50
b-FGF	Peprotech	450-33	concentration 4 ng/mL
bovine serum albumin (BSA) – used for digestion	Sigma Aldrich	A7906-1006	concentration 0.2%
BSA IgG-free, protease-free – used for staining	Jackson ImmunoResearch	001-000-162	concentration 5%
cell strainer 40 um	Dominique Dutscher	352340
cell strainer 70 um	Dominique Dutscher	352350
cell strainer 100 um	Dominique Dutscher	352360
Collagenase	Roche	10103586001	concentration 0.5 U/mL
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Euromedex	UD8050-05-A
Dispase	Roche	4942078001	concentration 3 U/mL
Dissection forceps size 5	Fine Science Tools	91150-20
Dissection forceps size 55	Fine Science Tools	11295-51
Dissection scissors (big, straight)	Fine Science Tools	9146-11	ideal for chopping
Dissection scissors (small, curved)	Fine Science Tools	15017-10
Dissection scissors (small, straight)	Fine Science Tools	14084-08
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)	ThermoFisher	41966-029
EdU Click-iT kit	ThermoFisher	C10340
Fetal bovine serum – option 1	Eurobio	CVF00-01
Fetal bovine serum – option 2	Gibco	10270-106
Matrigel	Corning Life Sciences	354234	coating solution
Parafilm	Dominique Dutscher	090261	flexible film
Penicillin streptomycin	Gibco	15140-122
Paraformaldehyde – option 1	PanReac AppliChem ITW Reagents	211511.1209	concentration 4%
Paraformaldeyde – option 2	ThermoFisher	28908	concentration 4%
Shaking water bath	ThermoFisher	TSSWB27
TritonX100	Sigma Aldrich	T8532-500 ML	concentration 0.5%
Wild-type mice	Janvier	C57BL/6NRj