Cultivo masivo no fraccionado de músculo esquelético de ratón para recapitular la quiescencia de nicho y de células madre

Summary

El músculo esquelético comprende múltiples tipos de células, incluidas las células madre residentes, cada una con una contribución especial a la homeostasis y regeneración muscular. Aquí, se describe el cultivo 2D de células madre musculares y el nicho de células musculares en un entorno ex vivo que conserva muchas de las características fisiológicas, in vivo y ambientales.

Abstract

El músculo esquelético es el tejido más grande del cuerpo y realiza múltiples funciones, desde la locomoción hasta el control de la temperatura corporal. Su funcionalidad y recuperación de lesiones dependen de multitud de tipos celulares y de señales moleculares entre las células musculares centrales (miofibras, células madre musculares) y su nicho. La mayoría de los entornos experimentales no preservan este complejo microambiente fisiológico, y tampoco permiten el estudio ex vivo de las células madre musculares en quiescencia, un estado celular que es crucial para ellas. Aquí, se describe un protocolo para el cultivo ex vivo de células madre musculares con componentes celulares de su nicho. A través de la descomposición mecánica y enzimática de los músculos, se obtiene una mezcla de tipos celulares, que se pone en cultivo 2D. La inmunotinción muestra que en 1 semana, múltiples células de nicho están presentes en cultivo junto con miofibras y, lo que es más importante, células Pax7 positivas que muestran las características de las células madre musculares quiescentes. Estas propiedades únicas hacen de este protocolo una poderosa herramienta para la amplificación celular y la generación de células madre quiescentes que se pueden utilizar para abordar cuestiones fundamentales y traslacionales.

Introduction

El movimiento, la respiración, el metabolismo, la postura corporal y el mantenimiento de la temperatura corporal dependen del músculo esquelético, y las disfunciones en el músculo esquelético pueden, por lo tanto, causar patologías debilitantes (es decir, miopatías, distrofias musculares, etc.) ¹. Dadas sus funciones esenciales y su abundancia, el músculo esquelético ha atraído la atención de laboratorios de investigación de todo el mundo que se esfuerzan por comprender los aspectos clave que apoyan la función muscular normal y pueden servir como objetivos terapéuticos. Además, el músculo esquelético es un modelo ampliamen....

Protocol

Todos los experimentos cumplieron con las regulaciones animales francesas y de la UE en el Institut Mondor de Recherche Biomédicale (INSERM U955), en particular la directiva 2010/63/UE. Los animales se mantuvieron en un ambiente controlado y enriquecido en las instalaciones de animales con números de certificación A94 028 379 y D94-028-028; Fueron manipulados solo por investigadores y cuidadores de animales autorizados, y fueron inspeccionados visualmente por el personal de alojamiento de animales en busca de signos d.......

Discussion

La función del músculo esquelético adulto está respaldada por un conjunto finamente orquestado de interacciones celulares y señales moleculares. Aquí, se presenta un método que permite el estudio de estos parámetros en un entorno ex vivo que se asemeja mucho al microambiente fisiológico.

Varios grupos han reportado métodos in vitro para cultivar células miogénicas. Estos métodos tenían como objetivo aislar células satélite para estudiar sus propiedades progeni.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
anti-CD31	BD	550274	dilution 1:100
anti-FOSB	Santa Cruz	sc-7203	dilution 1:200
anti-GFP	Abcam	ab13970	dilution 1:1000
anti-Ki67	Abcam	ab16667	dilution 1:1000
anti-MyHC	DSHB	MF20-c	dilution 1:400
anti-MYOD	Active Motif	39991	dilution 1:200
anti-MYOG	Santa Cruz	sc-576	dilution 1:150
anti-Pax7	Santa Cruz	sc-81648	dilution 1:100
anti-PDGFRα	Invitrogen	PA5-16571	dilution 1:50
b-FGF	Peprotech	450-33	concentration 4 ng/mL
bovine serum albumin (BSA) – used for digestion	Sigma Aldrich	A7906-1006	concentration 0.2%
BSA IgG-free, protease-free – used for staining	Jackson ImmunoResearch	001-000-162	concentration 5%
cell strainer 40 um	Dominique Dutscher	352340
cell strainer 70 um	Dominique Dutscher	352350
cell strainer 100 um	Dominique Dutscher	352360
Collagenase	Roche	10103586001	concentration 0.5 U/mL
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Euromedex	UD8050-05-A
Dispase	Roche	4942078001	concentration 3 U/mL
Dissection forceps size 5	Fine Science Tools	91150-20
Dissection forceps size 55	Fine Science Tools	11295-51
Dissection scissors (big, straight)	Fine Science Tools	9146-11	ideal for chopping
Dissection scissors (small, curved)	Fine Science Tools	15017-10
Dissection scissors (small, straight)	Fine Science Tools	14084-08
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)	ThermoFisher	41966-029
EdU Click-iT kit	ThermoFisher	C10340
Fetal bovine serum – option 1	Eurobio	CVF00-01
Fetal bovine serum – option 2	Gibco	10270-106
Matrigel	Corning Life Sciences	354234	coating solution
Parafilm	Dominique Dutscher	090261	flexible film
Penicillin streptomycin	Gibco	15140-122
Paraformaldehyde – option 1	PanReac AppliChem ITW Reagents	211511.1209	concentration 4%
Paraformaldeyde – option 2	ThermoFisher	28908	concentration 4%
Shaking water bath	ThermoFisher	TSSWB27
TritonX100	Sigma Aldrich	T8532-500 ML	concentration 0.5%
Wild-type mice	Janvier	C57BL/6NRj