Ofraktionerad bulkodling av musskelettmuskulatur för att rekapitulera nisch- och stamcellsvila

Summary

Skelettmuskulaturen består av flera celltyper, inklusive stamceller, var och en med ett särskilt bidrag till muskelhomeostas och regenerering. Här beskrivs 2D-odlingen av muskelstamceller och muskelcellnischen i en ex vivo-miljö som bevarar många av de fysiologiska, in vivo- och miljöegenskaperna.

Abstract

Skelettmuskulaturen är den största vävnaden i kroppen och utför flera funktioner, från rörelse till kroppstemperaturkontroll. Dess funktionalitet och återhämtning från skador beror på en mängd olika celltyper och på molekylära signaler mellan kärnmuskelcellerna (myofibrer, muskelstamceller) och deras nisch. De flesta experimentella miljöer bevarar inte denna komplexa fysiologiska mikromiljö, och de tillåter inte heller ex vivo-studier av muskelstamceller i vila, ett celltillstånd som är avgörande för dem. Här beskrivs ett protokoll för ex vivo-odling av muskelstamceller med cellulära komponenter i deras nisch. Genom mekanisk och enzymatisk nedbrytning av muskler erhålls en blandning av celltyper, som sätts i 2D-odling. Immunfärgning visar att inom 1 vecka finns flera nischceller i odling tillsammans med myofibrer och, viktigare, Pax7-positiva celler som uppvisar egenskaperna hos vilande muskelstamceller. Dessa unika egenskaper gör detta protokoll till ett kraftfullt verktyg för cellamplifiering och generering av vilande stamceller som kan användas för att ta itu med grundläggande och translationella frågor.

Introduction

Rörelse, andning, ämnesomsättning, kroppshållning och upprätthållande av kroppstemperatur beror alla på skelettmuskulaturen, och funktionsstörningar i skelettmuskulaturen kan därför orsaka försvagande patologier (dvs. myopatier, muskeldystrofier, etc.) ¹. Med tanke på dess väsentliga funktioner och överflöd har skelettmuskulaturen uppmärksammats av forskningslaboratorier över hela världen som strävar efter att förstå de viktigaste aspekterna som stöder normal muskelfunktion och kan fungera som terapeutiska mål. Dessutom är skelettmuskulatur en allmänt använd modell för att studera regenerering och stamcellsfunktion, efters....

Protocol

Alla försök uppfyllde franska och EU:s djurregler vid Institut Mondor de Recherche Biomédicale (INSERM U955), särskilt direktivet 2010/63/UE. Djuren hölls i en kontrollerad och berikad miljö på djuranläggningarna med certifieringsnummer A94 028 379 och D94-028-028. De hanterades endast av auktoriserade forskare och djurskötare, och de inspekterades visuellt av djurhållningspersonal för tecken på obehag under deras livstid. De avlivades genom cervikal luxation före dissektion. Inga interventionsprocedurer utf.......

Discussion

Funktionen hos vuxna skelettmuskler stöds av en fint orkestrerad uppsättning cellulära interaktioner och molekylära signaler. Här presenteras en metod som gör det möjligt att studera dessa parametrar i en ex vivo-miljö som liknar den fysiologiska mikromiljön.

Flera grupper har rapporterat in vitro-metoder för att odla myogena celler. Dessa metoder syftade till att isolera satellitceller för att studera deras myogena stamegenskaper. Två huvudsakliga metoder använd.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
anti-CD31	BD	550274	dilution 1:100
anti-FOSB	Santa Cruz	sc-7203	dilution 1:200
anti-GFP	Abcam	ab13970	dilution 1:1000
anti-Ki67	Abcam	ab16667	dilution 1:1000
anti-MyHC	DSHB	MF20-c	dilution 1:400
anti-MYOD	Active Motif	39991	dilution 1:200
anti-MYOG	Santa Cruz	sc-576	dilution 1:150
anti-Pax7	Santa Cruz	sc-81648	dilution 1:100
anti-PDGFRα	Invitrogen	PA5-16571	dilution 1:50
b-FGF	Peprotech	450-33	concentration 4 ng/mL
bovine serum albumin (BSA) – used for digestion	Sigma Aldrich	A7906-1006	concentration 0.2%
BSA IgG-free, protease-free – used for staining	Jackson ImmunoResearch	001-000-162	concentration 5%
cell strainer 40 um	Dominique Dutscher	352340
cell strainer 70 um	Dominique Dutscher	352350
cell strainer 100 um	Dominique Dutscher	352360
Collagenase	Roche	10103586001	concentration 0.5 U/mL
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Euromedex	UD8050-05-A
Dispase	Roche	4942078001	concentration 3 U/mL
Dissection forceps size 5	Fine Science Tools	91150-20
Dissection forceps size 55	Fine Science Tools	11295-51
Dissection scissors (big, straight)	Fine Science Tools	9146-11	ideal for chopping
Dissection scissors (small, curved)	Fine Science Tools	15017-10
Dissection scissors (small, straight)	Fine Science Tools	14084-08
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)	ThermoFisher	41966-029
EdU Click-iT kit	ThermoFisher	C10340
Fetal bovine serum – option 1	Eurobio	CVF00-01
Fetal bovine serum – option 2	Gibco	10270-106
Matrigel	Corning Life Sciences	354234	coating solution
Parafilm	Dominique Dutscher	090261	flexible film
Penicillin streptomycin	Gibco	15140-122
Paraformaldehyde – option 1	PanReac AppliChem ITW Reagents	211511.1209	concentration 4%
Paraformaldeyde – option 2	ThermoFisher	28908	concentration 4%
Shaking water bath	ThermoFisher	TSSWB27
TritonX100	Sigma Aldrich	T8532-500 ML	concentration 0.5%
Wild-type mice	Janvier	C57BL/6NRj