Niş ve Kök Hücre Sessizliğini Özetlemek için Fare İskelet Kasının Fraksiyone Edilmemiş Toplu Kültürü

Summary

İskelet kası, her biri kas homeostazına ve rejenerasyonuna özel bir katkısı olan yerleşik kök hücreler de dahil olmak üzere birden fazla hücre tipinden oluşur. Burada, fizyolojik, in vivo ve çevresel özelliklerin çoğunu koruyan ex vivo bir ortamda kas kök hücrelerinin 2 boyutlu kültürü ve kas hücresi nişi açıklanmaktadır.

Abstract

İskelet kası vücudun en büyük dokusudur ve hareketten vücut ısısı kontrolüne kadar birçok işlevi yerine getirir. İşlevselliği ve yaralanmalardan iyileşmesi, çok sayıda hücre tipine ve çekirdek kas hücreleri (miyofiberler, kas kök hücreleri) ve bunların nişleri arasındaki moleküler sinyallere bağlıdır. Deneysel ortamların çoğu bu karmaşık fizyolojik mikro ortamı korumaz ve onlar için çok önemli olan bir hücre durumu olan sessizlik içindeki kas kök hücrelerinin ex vivo çalışmasına da izin vermez. Burada, kas kök hücrelerinin nişlerinin hücresel bileşenleri ile ex vivo kültürü için bir protokol özetlenmiştir. Kasların mekanik ve enzimatik parçalanması yoluyla, 2D kültüre konan hücre tiplerinin bir karışımı elde edilir. İmmün boyama, 1 hafta içinde, miyofiberlerin ve daha da önemlisi, hareketsiz kas kök hücrelerinin özelliklerini gösteren Pax7 pozitif hücrelerin yanı sıra kültürde birden fazla niş hücrenin bulunduğunu göstermektedir. Bu benzersiz özellikler, bu protokolü hücre amplifikasyonu ve temel ve translasyonel soruları ele almak için kullanılabilecek hareketsiz benzeri kök hücrelerin üretilmesi için güçlü bir araç haline getirir.

Introduction

Hareket, solunum, metabolizma, vücut duruşu ve vücut ısısının korunması iskelet kasına bağlıdır ve iskelet kasındaki arızalar bu nedenle zayıflatıcı patolojilere (yani miyopatiler, kas distrofileri, vb.) neden olabilir. ¹. Temel işlevleri ve bolluğu göz önüne alındığında, iskelet kası, normal kas fonksiyonunu destekleyen ve terapötik hedefler olarak hizmet edebilecek temel yönleri anlamaya çalışan dünya çapındaki araştırma laboratuvarlarının dikkatini çekmiştir. Ek olarak, iskelet kası, rejenerasyon ve kök hücre fonksiyonunu incelemek için yaygın olarak kullanılan bir modeldir, çünkü sağlıklı kas, çoğunlukla yerleşik kök h....

Protocol

Tüm deneyler, Institut Mondor de Recherche Biomédicale'deki (INSERM U955) Fransız ve AB hayvan yönetmeliklerine, özellikle de 2010/63/UE direktifine uygundur. Hayvanlar, A94 028 379 ve D94-028-028 sertifika numaralı hayvan tesislerinde kontrollü ve zenginleştirilmiş bir ortamda tutuldu; Sadece yetkili araştırmacılar ve hayvan bakıcıları tarafından ele alındılar ve yaşamları boyunca rahatsızlık belirtileri için hayvan barınağı personeli tarafından görsel olarak incelendiler. Diseksiyon öncesi .......

Discussion

Yetişkin iskelet kası fonksiyonu, ince bir şekilde düzenlenmiş bir dizi hücresel etkileşim ve moleküler sinyal ile desteklenir. Burada, bu parametrelerin fizyolojik mikro çevreye çok benzeyen bir ex vivo ortamda incelenmesine izin veren bir yöntem sunulmaktadır.

Birkaç grup, miyojenik hücreleri kültürlemek için in vitro yöntemler bildirmiştir. Bu yöntemler, miyojenik progenitör özelliklerini incelemek için uydu hücrelerini izole etmeyi amaçladı. Saf .......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
anti-CD31	BD	550274	dilution 1:100
anti-FOSB	Santa Cruz	sc-7203	dilution 1:200
anti-GFP	Abcam	ab13970	dilution 1:1000
anti-Ki67	Abcam	ab16667	dilution 1:1000
anti-MyHC	DSHB	MF20-c	dilution 1:400
anti-MYOD	Active Motif	39991	dilution 1:200
anti-MYOG	Santa Cruz	sc-576	dilution 1:150
anti-Pax7	Santa Cruz	sc-81648	dilution 1:100
anti-PDGFRα	Invitrogen	PA5-16571	dilution 1:50
b-FGF	Peprotech	450-33	concentration 4 ng/mL
bovine serum albumin (BSA) – used for digestion	Sigma Aldrich	A7906-1006	concentration 0.2%
BSA IgG-free, protease-free – used for staining	Jackson ImmunoResearch	001-000-162	concentration 5%
cell strainer 40 um	Dominique Dutscher	352340
cell strainer 70 um	Dominique Dutscher	352350
cell strainer 100 um	Dominique Dutscher	352360
Collagenase	Roche	10103586001	concentration 0.5 U/mL
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Euromedex	UD8050-05-A
Dispase	Roche	4942078001	concentration 3 U/mL
Dissection forceps size 5	Fine Science Tools	91150-20
Dissection forceps size 55	Fine Science Tools	11295-51
Dissection scissors (big, straight)	Fine Science Tools	9146-11	ideal for chopping
Dissection scissors (small, curved)	Fine Science Tools	15017-10
Dissection scissors (small, straight)	Fine Science Tools	14084-08
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)	ThermoFisher	41966-029
EdU Click-iT kit	ThermoFisher	C10340
Fetal bovine serum – option 1	Eurobio	CVF00-01
Fetal bovine serum – option 2	Gibco	10270-106
Matrigel	Corning Life Sciences	354234	coating solution
Parafilm	Dominique Dutscher	090261	flexible film
Penicillin streptomycin	Gibco	15140-122
Paraformaldehyde – option 1	PanReac AppliChem ITW Reagents	211511.1209	concentration 4%
Paraformaldeyde – option 2	ThermoFisher	28908	concentration 4%
Shaking water bath	ThermoFisher	TSSWB27
TritonX100	Sigma Aldrich	T8532-500 ML	concentration 0.5%
Wild-type mice	Janvier	C57BL/6NRj