תגובת שרשרת פולימראז והכלאה של כתם נקודה לזיהוי לפטוספירה בדגימות מים

Summary

במחקר זה, יישום כתם נקודה תוכנן לזהות לפטוספירה משלושת הקלאדים העיקריים בדגימות מים. שיטה זו מאפשרת זיהוי של כמויות DNA מינימליות הממוקדות באופן ספציפי על ידי בדיקה המסומנת בדיגוקסיגנין, המזוהה בקלות על ידי נוגדן אנטי דיגוקסיגנין. גישה זו היא כלי רב ערך ומספק למטרות מיון.

Abstract

כתם הנקודות הוא טכניקה פשוטה, מהירה, רגישה ורב-תכליתית המאפשרת זיהוי כמויות מינימליות של DNA הממוקדות ספציפית על ידי הכלאת בדיקה בנוכחות DNA נשא. הוא מבוסס על העברת כמות ידועה של DNA לתמיכה מוצקה אינרטית, כגון קרום ניילון, תוך שימוש במנגנון כתם הנקודה וללא הפרדה אלקטרופורטית. לקרומי ניילון יש יתרון של יכולת קשירה גבוהה של חומצות גרעין (400 מיקרוגרם לסמ"ק²), חוזק גבוה, והם טעונים חיובית או ניטרלית. הגשושית המשמשת היא מקטע ssDNA ספציפי ביותר של 18 עד 20 בסיסים ארוכים המסומנים בדיגוקסיגנין (DIG). הגשושית תצומד לדנ"א של לפטוספירה (Leptospira ). לאחר שהגשושית ביצעה הכלאה עם דנ"א המטרה, היא מזוהה על ידי נוגדן אנטי-דיגוקסיגנין, המאפשר את זיהויו בקלות באמצעות פליטותיו המתגלות בסרט רנטגן. הנקודות עם הפליטה יתאימו למקטעי הדנ"א המעניינים. שיטה זו משתמשת בתיוג לא איזוטופי של הבדיקה, אשר עשוי להיות זמן מחצית חיים ארוך מאוד. החיסרון של תווית חיסונית סטנדרטית זו הוא רגישות נמוכה יותר מאשר בדיקות איזוטופיות. עם זאת, היא מתמתנת על ידי צימוד תגובת שרשרת פולימראז (PCR) ומבחני כתם נקודה. גישה זו מאפשרת העשרת רצף המטרה ואיתורו. בנוסף, ניתן להשתמש בו כיישום כמותי בהשוואה לדילול סדרתי של תקן ידוע. יישום נקודתי לזיהוי לפטוספירה משלושת הקלאדים העיקריים בדגימות מים מוצג כאן. מתודולוגיה זו יכולה להיות מיושמת על כמויות גדולות של מים לאחר שהם רוכזו על ידי צנטריפוגה כדי לספק ראיות לנוכחות של DNA לפטוספירלי. זהו כלי בעל ערך ומספק למטרות סינון כלליות, וניתן להשתמש בו עבור חיידקים אחרים שאינם ניתנים לגידול שעשויים להימצא במים, ובכך לשפר את הבנת המערכת האקולוגית.

Introduction

לפטוספירוזיס בבני אדם מקורו בעיקר במקורות סביבתיים ^1,2. נוכחותה של לפטוספירה באגמים, נהרות ונחלים היא אינדיקטור להעברת לפטוספירוזיס בקרב חיות בר, וחיות בית וייצור שעלולות בסופו של דבר לבוא במגע עם גופי מים אלה ^1,3,4. יתר על כן, לפטוספירה זוהתה במקורות לא טבעיים, כולל ביוב, עומדים ומי ברז ^5,6.

לפטוספירה הוא חיידק^מופץ ברחבי העולם ^7,8, ותפקיד הסביבה ב....

Protocol

1. הכנת מדגם

1. רכז כל דגימת מים בצינורות מיקרוצנטריפוגות של 1.5 מ"ל באמצעות צנטריפוגה ב 8,000 x גרם למשך 10 דקות ב -4 ° C. חזור על שלב זה, כמה פעמים שנדרש, כדי לרכז את הדגימה לנפח של 250 μL.
2. השתמש בערכת מיצוי ה- DNA בהתאם להוראות היצרן (ראה טבלת חומרים).
3. בצע את ה- PCR הספצ?.......

Discussion

השלבים הקריטיים של טכניקת כתם הנקודה כוללים (1) אימוביליזציה של דנ"א, (2) חסימת אתרי הקישור החופשיים על הממברנה עם דנ"א לא הומולוגי, (3) השלמה בין הגשושית לבין מקטע המטרה בתנאי חישול, (4) הסרת הגשושית הבלתי היברידית, ו-(5) גילוי מולקולת הכתב⁴¹.

לכתם PCR-Dot-blot יש מגבלות מסוי?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
REAGENTS
Purelink DNA extraction kit	Invitrogen	K182002
Gotaq Flexi DNA Polimerase (End-Point PCR Taq polymerase kit)	Promega	M3001
Whatman filter paper, grade 1,	Merk	WHA1001325
Nylon Membranes, positively charged Roll 30cm x 3 m	Roche	11417240001
Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragments Sheep Polyclonal Primary-antibody	Roche	11093274910
Medium Base EMJH	Difco	S1368JAA
Leptospira Enrichment EMJH	Difco	BD 279510
Blocking Reagent	Roche	11096176001
CSPD ready to use Disodium 3-(4-methoxyspiro {1,2-dioxetane-3,2′-(5′-chloro) tricyclo [3.3.1.13,7] decan}8-4-yl) phenyl phosphate	Merk	11755633001
Deoxyribonucleic acid from herring sperm	Sigma Aldrich	D3159
Developer Carestream	Carestream Health Inc	GBX5158621
Digoxigenin-11-ddUTP	Roche	11363905910
EDTA, Disodium Salt (Dihydrate)	Promega	H5032
Ficoll 400	Sigma Aldrich	F8016
Fixer Carestream	Carestream Health Inc	GBX 5158605
Lauryl sulfate Sodium Salt (Sodium dodecyl sulfate; SDS) C12H2504SNa	Sigma Aldrich	L5750
N- Lauroylsarcosine sodium salt CH3(CH2)10CON(CH3) CH2COONa	Sigma Aldrich	L-9150	It is an anionic surfactant
Polivinylpyrrolidone (PVP-40)	Sigma Aldrich	PVP40
Polyethylene glycol Sorbitan monolaurate (Tween 20)	Sigma Aldrich	9005-64-5
Sodium Chloride (NaCl)	Sigma Aldrich	7647-14-5
Sodium dodecyl sulfate (SDS)	Sigma Aldrich	151-21-3
Sodium hydroxide (NaOH)	Sigma Aldrich	1310-73-2
Sodium phosphate dibasic (NaH2PO4)	Sigma-Aldrich	7558-79-4
Terminal transferase, recombinant	Roche	3289869103
Tris hydrochloride (Tris HCl)	Sigma-Aldrich	1185-53-1
SSPE 20X	Sigma-Aldrich	S2015-1L	It can be Home-made following Supplementary File 6
Primers	Sigma-Aldrich	On demand	Follow table 1
Probes	Sigma-Aldrich	On demand	Follow table 1
Equipment
Nanodrop™ One Spectrophotometer	Thermo-Scientific	ND-ONE-W
Refrigerated microcentrifuge Sigma 1-14K, suitable for centrifugation of 1.5 ml microcentrifuge tubes at 14,000 rpm	Sigma-Aldrich	1-14K
Disinfected adjustable pipettes, range 2-20 µl, 20-200 µl	Gilson	SKU:F167360
Disposable 1.5 ml microcentrifuge tubes (autoclaved)	Axygen	MCT-150-SP
Disposable 600 µl microcentrifuge tubes (autoclaved)	Axygen	3208
Disposable Pipette tips 1-10 µl	Axygen	T-300
Disposable Pipette tips 1-200 µl	Axygen	TR-222-Y
Dot-Blot apparatus Bio-Dot	BIORAD	1706545
Portable Hergom Suction	Hergom	7E-A
Scientific Light Box (Visible-light PH90-115V)	Hoefer	PH90-115V
UV Crosslinker	Hoefer	UVC-500
Thermo Hybaid PCR Express Thermocycler	Hybaid	HBPX110
Radiographic cassette with IP Plate14 X 17	Fuji