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  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

Neste estudo, uma aplicação de dot-blot foi projetada para detectar Leptospira dos três clados principais em amostras de água. Este método permite a identificação de quantidades mínimas de DNA especificamente direcionadas por uma sonda marcada com digoxigenina, facilmente detectada por um anticorpo anti-digoxigenina. Essa abordagem é uma ferramenta valiosa e satisfatória para fins de triagem.

Abstract

O dot-blot é uma técnica simples, rápida, sensível e versátil que permite a identificação de quantidades mínimas de DNA especificamente direcionadas pela hibridização da sonda na presença de DNA transportador. Baseia-se na transferência de uma quantidade conhecida de DNA para um suporte sólido inerte, como uma membrana de náilon, utilizando o aparelho de dot-blot e sem separação eletroforética. As membranas de nylon têm a vantagem de alta capacidade de ligação de ácidos nucleicos (400 μg/cm2), alta resistência e são carregadas positiva ou neutramente. A sonda usada é um fragmento de ssDNA altamente específico de 18 a 20 bases marcadas com digoxigenina (DIG). A sonda se conjugará com o DNA da Leptospira . Uma vez que a sonda tenha hibridizado com o DNA alvo, ela é detectada por um anticorpo anti-digoxigenina, permitindo sua fácil detecção por meio de suas emissões reveladas em um filme de raios-X. Os pontos com uma emissão corresponderão aos fragmentos de DNA de interesse. Este método emprega a marcação não isotópica da sonda, que pode ter uma meia-vida muito longa. A desvantagem deste imunomarcador padrão é uma sensibilidade mais baixa do que as sondas isotópicas. No entanto, é mitigado pelo acoplamento da reação em cadeia da polimerase (PCR) e ensaios de dot-blot. Essa abordagem permite o enriquecimento da sequência alvo e sua detecção. Além disso, pode ser usado como uma aplicação quantitativa quando comparado com uma diluição em série de um padrão bem conhecido. Uma aplicação de dot-blot para detectar Leptospira dos três clados principais em amostras de água é apresentada aqui. Esta metodologia pode ser aplicada a grandes quantidades de água, uma vez que tenham sido concentradas por centrifugação para fornecer evidências da presença de DNA de Leptospira. Esta é uma ferramenta valiosa e satisfatória para fins gerais de triagem, podendo ser utilizada para outras bactérias não cultiváveis que possam estar presentes na água, melhorando a compreensão do ecossistema.

Introduction

A leptospirose em humanos tem origem principalmente em fontes ambientais 1,2. A presença de Leptospira em lagos, rios e córregos é um indicador de transmissão de leptospirose entre animais silvestres e animais domésticos e de produção que podem eventualmente entrar em contato com esses corpos d'água 1,3,4. Além disso, Leptospira foi identificada em fontes não naturais, incluindo esgoto, água estagnada e água da torneira 5,6.

Protocol

1. Preparação da amostra

  1. Concentre cada amostra de água em tubos de microcentrífuga de 1,5 mL por centrifugação a 8.000 x g por 10 min a 4 ° C. Repita esta etapa, quantas vezes forem necessárias, para concentrar a amostra em um volume de 250 μL.
  2. Use o kit de extração de DNA de acordo com as instruções do fabricante (consulte a Tabela de Materiais).
  3. Realize a PCR específica de acordo com a sonda dot-blot que será utilizada (Ta.......

Representative Results

Para avaliar a eficácia da técnica, foi utilizado DNA genômico de culturas puras de cada sorovar de Leptospira , juntamente com a sonda específica do clado. As membranas foram preparadas com 100 ng de DNA genômico por reação de PCR para cada sorovar, seguido por oito DNA genômico de bactérias não relacionadas e concentrações variáveis de DNA genômico dos sorovares ad hoc de Leptospira . Cada ensaio incluiu controle positivo, negativo e sem modelo. Esses DNAs genômicos não relacionados n?.......

Discussion

As etapas críticas da técnica de dot-blot incluem (1) imobilização de DNA, (2) bloqueio dos locais de ligação livres na membrana com DNA não homólogo, (3) a complementaridade entre a sonda e o fragmento alvo sob condições de recozimento, (4) remoção da sonda não hibridizada e (5) a detecção da molécula repórter41.

O PCR-Dot-blot tem certas limitações, como a técnica não fornece informações sobre o tamanho do fragmento hibridizado.......

Disclosures

Os autores declaram não haver conflito de interesses.

Acknowledgements

Estamos em dívida com a coleção Leptospira do Departamento de Microbiologia e Imunologia da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade Nacional Autônoma do México. Agradecemos a generosa doação das cepas de referência de Leptospira ; Leptospira fainei sorovar Hurstbridge cepa BUT6 e Leptospira biflexa sorovar Patoc cepa Patoc I para o Dr. Alejandro de la Peña Moctezuma. Agradecemos ao Dr. José Antonio Ocampo Cervantes, Coordenador do CIBAC, e ao pessoal pelo apoio logístico. A EDT estava no âmbito do programa Terminal Project para alunos de graduação da Universidade Autônoma Metropolitana-Campus Cuaji....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
REAGENTS
Purelink DNA extraction kitInvitrogenK182002
Gotaq Flexi DNA Polimerase (End-Point PCR Taq polymerase kit)PromegaM3001
Whatman filter paper, grade 1,MerkWHA1001325
Nylon Membranes, positively charged Roll 30cm x 3 mRoche11417240001
Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragments Sheep Polyclonal Primary-antibodyRoche11093274910
Medium Base EMJHDifcoS1368JAA
Leptospira Enrichment EMJHDifcoBD 279510
Blocking ReagentRoche11096176001
CSPD ready to use Disodium 3-(4-methoxyspiro {1,2-dioxetane-3,2′-(5′-chloro) tricyclo [3.3.1.13,7] decan}8-4-yl) phenyl phosphateMerk11755633001
Deoxyribonucleic acid from herring spermSigma AldrichD3159
Developer CarestreamCarestream Health IncGBX5158621
Digoxigenin-11-ddUTPRoche11363905910
EDTA, Disodium Salt (Dihydrate)PromegaH5032
Ficoll 400Sigma AldrichF8016
Fixer CarestreamCarestream Health IncGBX 5158605
Lauryl sulfate Sodium Salt (Sodium dodecyl sulfate; SDS) C12H2504SNaSigma AldrichL5750
N- Lauroylsarcosine sodium salt CH3(CH2)10CON(CH3) CH2COONaSigma AldrichL-9150It is an anionic surfactant
Polivinylpyrrolidone (PVP-40)Sigma AldrichPVP40
Polyethylene glycol Sorbitan monolaurate (Tween 20)Sigma Aldrich9005-64-5
Sodium Chloride (NaCl)Sigma Aldrich7647-14-5
Sodium dodecyl sulfate (SDS)Sigma Aldrich151-21-3
Sodium hydroxide (NaOH)Sigma Aldrich1310-73-2
Sodium phosphate dibasic (NaH2PO4)Sigma-Aldrich7558-79-4
Terminal transferase, recombinantRoche3289869103
Tris hydrochloride (Tris HCl)Sigma-Aldrich1185-53-1
SSPE 20XSigma-AldrichS2015-1LIt can be Home-made following Supplementary File 6
PrimersSigma-AldrichOn demandFollow table 1
ProbesSigma-AldrichOn demandFollow table 1
Equipment
Nanodrop™ One SpectrophotometerThermo-ScientificND-ONE-W
Refrigerated microcentrifuge Sigma 1-14K, suitable for centrifugation of 1.5 ml microcentrifuge tubes at 14,000 rpmSigma-Aldrich1-14K
Disinfected adjustable pipettes, range 2-20 µl, 20-200 µlGilsonSKU:F167360
Disposable 1.5 ml microcentrifuge tubes (autoclaved)AxygenMCT-150-SP
Disposable 600 µl microcentrifuge tubes (autoclaved)Axygen3208
Disposable Pipette tips 1-10 µlAxygenT-300
Disposable Pipette tips 1-200 µlAxygenTR-222-Y
Dot-Blot apparatus Bio-DotBIORAD1706545
Portable Hergom SuctionHergom7E-A
Scientific Light Box (Visible-light PH90-115V)HoeferPH90-115V
UV CrosslinkerHoeferUVC-500
Thermo Hybaid PCR Express ThermocyclerHybaidHBPX110
Radiographic cassette with IP Plate14 X 17Fuji

References

  1. Bierque, E., Thibeaux, R., Girault, D., Soupé-Gilbert, M. E., Goarant, C. A systematic review of Leptospira in water and soil environments. PLOS One. 15 (1), e0227055 (2020).
  2. Haake, D. A., Levett, P. N. Leptospirosis in humans.

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