A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
В этом исследовании было разработано приложение точечного блоттинга для обнаружения лептоспир из трех основных клад в образцах воды. Этот метод позволяет идентифицировать минимальные количества ДНК, специфически нацеленные на зонд, меченный дигоксигенином, легко обнаруживаемые антителом к дигоксигенину. Этот подход является ценным и удовлетворительным инструментом для целей скрининга.
Дот-блот — это простой, быстрый, чувствительный и универсальный метод, который позволяет идентифицировать минимальное количество ДНК, специфически нацеленной на зондовую гибридизацию в присутствии ДНК-носителя. Он основан на переносе известного количества ДНК на инертную твердую основу, такую как нейлоновая мембрана, с использованием аппарата «точка-блот» и без электрофоретического разделения. Нейлоновые мембраны обладают высокой способностью связывания нуклеиновых кислот (400 мкг/см2), высокой прочностью и положительно или нейтрально заряжены. Используемый зонд представляет собой высокоспецифичный фрагмент одноцепочной ДНК длиной от 18 до 20 оснований, помеченный дигоксигенином (DIG). Зонд будет конъюгироваться с ДНК лептоспиры . После того, как зонд гибридизуется с целевой ДНК, он обнаруживается антителом против дигоксигенина, что позволяет легко обнаружить его по излучению, выявленному в рентгеновской пленке. Точки с излучением будут соответствовать интересующим фрагментам ДНК. В этом методе используется безизотопное мечение зонда, которое может иметь очень длительный период полураспада. Недостатком этой стандартной иммунометки является более низкая чувствительность, чем у изотопных зондов. Тем не менее, его смягчают с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) и дотблот-анализов. Такой подход позволяет обогатить целевую последовательность и обнаружить ее. Кроме того, он может быть использован в качестве количественного применения при сравнении с серийным разбавлением хорошо известного стандарта. Здесь представлено приложение точечного блоттинга для обнаружения лептоспир из трех основных клад в пробах воды. Эта методология может быть применена к большому количеству воды после того, как они были концентрированы центрифугированием, чтобы предоставить доказательства наличия лептоспиральной ДНК. Это ценный и удовлетворительный инструмент для общих целей скрининга, который может быть использован для других бактерий, которые могут присутствовать в воде, улучшая понимание экосистемы.
Лептоспироз у человека в основном происходит из источников окружающей среды 1,2. Присутствие лептоспир в озерах, реках и ручьях является индикатором передачи лептоспироза среди диких животных, домашних и производственных животных, которые в конечном итоге могут вступать в контакт с этими водоемами 1,3,4. Кроме того, лептоспиры были обнаружены в неприродных источниках, включая сточные воды, стоячую и водопроводную воду 5,6.
1. Подготовка образцов
Для оценки эффективности метода использовали геномную ДНК из чистых культур каждого серовара Leptospira , а также кладоспецифичный зонд. Мембраны получали с 100 нг геномной ДНК на ПЦР-реакцию для каждого серовара, за которым следовали восемь геномных ДНК неродственных бактерий и различ?.......
Критические этапы метода дотблоттинга включают (1) иммобилизацию ДНК, (2) блокирование свободных сайтов связывания на мембране негомологичной ДНК, (3) комплементарность между зондом и фрагментом-мишенью в условиях отжига, (4) удаление негибридизованного зонда и (5) обнаружение репортерной.......
Мы в долгу перед коллекцией лептоспир кафедры микробиологии и иммунологии факультета ветеринарной медицины и зоотехнии Национального автономного университета Мексики. Мы благодарны за щедрое пожертвование эталонных штаммов Leptospira ; Leptospira fainei serovar Hurstbridge штамм BUT6 и Leptospira biflexa serovar Patoc штамм Patoc I доктору Алехандро де ла Пенья Моктесума. Мы благодарим д-ра Хосе Антонио Окампо Сервантеса, координатора CIBAC, и персонал за их материально-техническую поддержку. EDT проводился в рамках программы «Терминальный проект» для студентов бакалавриата Столичного автономного университета-кампуса Ку....
Name | Company | Catalog Number | Comments |
REAGENTS | |||
Purelink DNA extraction kit | Invitrogen | K182002 | |
Gotaq Flexi DNA Polimerase (End-Point PCR Taq polymerase kit) | Promega | M3001 | |
Whatman filter paper, grade 1, | Merk | WHA1001325 | |
Nylon Membranes, positively charged Roll 30cm x 3 m | Roche | 11417240001 | |
Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragments Sheep Polyclonal Primary-antibody | Roche | 11093274910 | |
Medium Base EMJH | Difco | S1368JAA | |
Leptospira Enrichment EMJH | Difco | BD 279510 | |
Blocking Reagent | Roche | 11096176001 | |
CSPD ready to use Disodium 3-(4-methoxyspiro {1,2-dioxetane-3,2′-(5′-chloro) tricyclo [3.3.1.13,7] decan}8-4-yl) phenyl phosphate | Merk | 11755633001 | |
Deoxyribonucleic acid from herring sperm | Sigma Aldrich | D3159 | |
Developer Carestream | Carestream Health Inc | GBX5158621 | |
Digoxigenin-11-ddUTP | Roche | 11363905910 | |
EDTA, Disodium Salt (Dihydrate) | Promega | H5032 | |
Ficoll 400 | Sigma Aldrich | F8016 | |
Fixer Carestream | Carestream Health Inc | GBX 5158605 | |
Lauryl sulfate Sodium Salt (Sodium dodecyl sulfate; SDS) C12H2504SNa | Sigma Aldrich | L5750 | |
N- Lauroylsarcosine sodium salt CH3(CH2)10CON(CH3) CH2COONa | Sigma Aldrich | L-9150 | It is an anionic surfactant |
Polivinylpyrrolidone (PVP-40) | Sigma Aldrich | PVP40 | |
Polyethylene glycol Sorbitan monolaurate (Tween 20) | Sigma Aldrich | 9005-64-5 | |
Sodium Chloride (NaCl) | Sigma Aldrich | 7647-14-5 | |
Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma Aldrich | 151-21-3 | |
Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma Aldrich | 1310-73-2 | |
Sodium phosphate dibasic (NaH2PO4) | Sigma-Aldrich | 7558-79-4 | |
Terminal transferase, recombinant | Roche | 3289869103 | |
Tris hydrochloride (Tris HCl) | Sigma-Aldrich | 1185-53-1 | |
SSPE 20X | Sigma-Aldrich | S2015-1L | It can be Home-made following Supplementary File 6 |
Primers | Sigma-Aldrich | On demand | Follow table 1 |
Probes | Sigma-Aldrich | On demand | Follow table 1 |
Equipment | |||
Nanodrop™ One Spectrophotometer | Thermo-Scientific | ND-ONE-W | |
Refrigerated microcentrifuge Sigma 1-14K, suitable for centrifugation of 1.5 ml microcentrifuge tubes at 14,000 rpm | Sigma-Aldrich | 1-14K | |
Disinfected adjustable pipettes, range 2-20 µl, 20-200 µl | Gilson | SKU:F167360 | |
Disposable 1.5 ml microcentrifuge tubes (autoclaved) | Axygen | MCT-150-SP | |
Disposable 600 µl microcentrifuge tubes (autoclaved) | Axygen | 3208 | |
Disposable Pipette tips 1-10 µl | Axygen | T-300 | |
Disposable Pipette tips 1-200 µl | Axygen | TR-222-Y | |
Dot-Blot apparatus Bio-Dot | BIORAD | 1706545 | |
Portable Hergom Suction | Hergom | 7E-A | |
Scientific Light Box (Visible-light PH90-115V) | Hoefer | PH90-115V | |
UV Crosslinker | Hoefer | UVC-500 | |
Thermo Hybaid PCR Express Thermocycler | Hybaid | HBPX110 | |
Radiographic cassette with IP Plate14 X 17 | Fuji |
This article has been published
Video Coming Soon
ABOUT JoVE
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved