Полимеразная цепная реакция и дот-блот-гибридизация для обнаружения лептоспир в пробах воды

Summary

В этом исследовании было разработано приложение точечного блоттинга для обнаружения лептоспир из трех основных клад в образцах воды. Этот метод позволяет идентифицировать минимальные количества ДНК, специфически нацеленные на зонд, меченный дигоксигенином, легко обнаруживаемые антителом к дигоксигенину. Этот подход является ценным и удовлетворительным инструментом для целей скрининга.

Abstract

Дот-блот — это простой, быстрый, чувствительный и универсальный метод, который позволяет идентифицировать минимальное количество ДНК, специфически нацеленной на зондовую гибридизацию в присутствии ДНК-носителя. Он основан на переносе известного количества ДНК на инертную твердую основу, такую как нейлоновая мембрана, с использованием аппарата «точка-блот» и без электрофоретического разделения. Нейлоновые мембраны обладают высокой способностью связывания нуклеиновых кислот (400 мкг/^см2), высокой прочностью и положительно или нейтрально заряжены. Используемый зонд представляет собой высокоспецифичный фрагмент одноцепочной ДНК длиной от 18 до 20 оснований, помеченный дигоксигенином (DIG). Зонд будет конъюгироваться с ДНК лептоспиры . После того, как зонд гибридизуется с целевой ДНК, он обнаруживается антителом против дигоксигенина, что позволяет легко обнаружить его по излучению, выявленному в рентгеновской пленке. Точки с излучением будут соответствовать интересующим фрагментам ДНК. В этом методе используется безизотопное мечение зонда, которое может иметь очень длительный период полураспада. Недостатком этой стандартной иммунометки является более низкая чувствительность, чем у изотопных зондов. Тем не менее, его смягчают с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) и дотблот-анализов. Такой подход позволяет обогатить целевую последовательность и обнаружить ее. Кроме того, он может быть использован в качестве количественного применения при сравнении с серийным разбавлением хорошо известного стандарта. Здесь представлено приложение точечного блоттинга для обнаружения лептоспир из трех основных клад в пробах воды. Эта методология может быть применена к большому количеству воды после того, как они были концентрированы центрифугированием, чтобы предоставить доказательства наличия лептоспиральной ДНК. Это ценный и удовлетворительный инструмент для общих целей скрининга, который может быть использован для других бактерий, которые могут присутствовать в воде, улучшая понимание экосистемы.

Introduction

Лептоспироз у человека в основном происходит из источников окружающей среды ^1,2. Присутствие лептоспир в озерах, реках и ручьях является индикатором передачи лептоспироза среди диких животных, домашних и производственных животных, которые в конечном итоге могут вступать в контакт с этими водоемами ^1,3,4. Кроме того, лептоспиры были обнаружены в неприродных источниках, включая сточные воды, стоячую и водопроводную воду ^5,6.

Protocol

1. Подготовка образцов

1. Сконцентрируйте каждую пробу воды в микроцентрифужных пробирках объемом 1,5 мл центрифугированием при 8 000 x g в течение 10 мин при 4 °C. Повторите этот шаг столько раз, сколько потребуется, чтобы сконцентрировать образец в объеме 250 мкл.
2. Исполь?.......

Discussion

Критические этапы метода дотблоттинга включают (1) иммобилизацию ДНК, (2) блокирование свободных сайтов связывания на мембране негомологичной ДНК, (3) комплементарность между зондом и фрагментом-мишенью в условиях отжига, (4) удаление негибридизованного зонда и (5) обнаружение репортерной.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
REAGENTS
Purelink DNA extraction kit	Invitrogen	K182002
Gotaq Flexi DNA Polimerase (End-Point PCR Taq polymerase kit)	Promega	M3001
Whatman filter paper, grade 1,	Merk	WHA1001325
Nylon Membranes, positively charged Roll 30cm x 3 m	Roche	11417240001
Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragments Sheep Polyclonal Primary-antibody	Roche	11093274910
Medium Base EMJH	Difco	S1368JAA
Leptospira Enrichment EMJH	Difco	BD 279510
Blocking Reagent	Roche	11096176001
CSPD ready to use Disodium 3-(4-methoxyspiro {1,2-dioxetane-3,2′-(5′-chloro) tricyclo [3.3.1.13,7] decan}8-4-yl) phenyl phosphate	Merk	11755633001
Deoxyribonucleic acid from herring sperm	Sigma Aldrich	D3159
Developer Carestream	Carestream Health Inc	GBX5158621
Digoxigenin-11-ddUTP	Roche	11363905910
EDTA, Disodium Salt (Dihydrate)	Promega	H5032
Ficoll 400	Sigma Aldrich	F8016
Fixer Carestream	Carestream Health Inc	GBX 5158605
Lauryl sulfate Sodium Salt (Sodium dodecyl sulfate; SDS) C12H2504SNa	Sigma Aldrich	L5750
N- Lauroylsarcosine sodium salt CH3(CH2)10CON(CH3) CH2COONa	Sigma Aldrich	L-9150	It is an anionic surfactant
Polivinylpyrrolidone (PVP-40)	Sigma Aldrich	PVP40
Polyethylene glycol Sorbitan monolaurate (Tween 20)	Sigma Aldrich	9005-64-5
Sodium Chloride (NaCl)	Sigma Aldrich	7647-14-5
Sodium dodecyl sulfate (SDS)	Sigma Aldrich	151-21-3
Sodium hydroxide (NaOH)	Sigma Aldrich	1310-73-2
Sodium phosphate dibasic (NaH2PO4)	Sigma-Aldrich	7558-79-4
Terminal transferase, recombinant	Roche	3289869103
Tris hydrochloride (Tris HCl)	Sigma-Aldrich	1185-53-1
SSPE 20X	Sigma-Aldrich	S2015-1L	It can be Home-made following Supplementary File 6
Primers	Sigma-Aldrich	On demand	Follow table 1
Probes	Sigma-Aldrich	On demand	Follow table 1
Equipment
Nanodrop™ One Spectrophotometer	Thermo-Scientific	ND-ONE-W
Refrigerated microcentrifuge Sigma 1-14K, suitable for centrifugation of 1.5 ml microcentrifuge tubes at 14,000 rpm	Sigma-Aldrich	1-14K
Disinfected adjustable pipettes, range 2-20 µl, 20-200 µl	Gilson	SKU:F167360
Disposable 1.5 ml microcentrifuge tubes (autoclaved)	Axygen	MCT-150-SP
Disposable 600 µl microcentrifuge tubes (autoclaved)	Axygen	3208
Disposable Pipette tips 1-10 µl	Axygen	T-300
Disposable Pipette tips 1-200 µl	Axygen	TR-222-Y
Dot-Blot apparatus Bio-Dot	BIORAD	1706545
Portable Hergom Suction	Hergom	7E-A
Scientific Light Box (Visible-light PH90-115V)	Hoefer	PH90-115V
UV Crosslinker	Hoefer	UVC-500
Thermo Hybaid PCR Express Thermocycler	Hybaid	HBPX110
Radiographic cassette with IP Plate14 X 17	Fuji