La profilazione polimerica microarray (MAPP) è una tecnica ad alto rendimento per l'analisi della composizione dei glicani in campioni biologici.
La profilazione polimerica con microarray (MAPP) è un approccio robusto e riproducibile per determinare sistematicamente la composizione e l'abbondanza relativa di glicani e glicoconiugati all'interno di una varietà di campioni biologici, inclusi tessuti vegetali e algali, materiali alimentari e campioni umani, animali e microbici. La tecnologia Microarray è alla base dell'efficacia di questo metodo fornendo una piattaforma di screening miniaturizzata e ad alto rendimento, che consente di caratterizzare contemporaneamente migliaia di interazioni tra glicani e sonde molecolari dirette da glicani altamente specifiche, utilizzando solo piccole quantità di analiti. I glicani costituenti vengono frazionati chimicamente ed enzimaticamente, prima di essere estratti sequenzialmente dal campione e immobilizzati direttamente su membrane di nitrocellulosa. La composizione dei glicani è determinata dall'attaccamento di specifiche sonde molecolari che riconoscono i glicani alle molecole estorte e stampate. MAPP è complementare alle tecniche convenzionali di analisi dei glicani, come l'analisi dei monosaccaridi e dei linkage e la spettrometria di massa. Tuttavia, le sonde molecolari che riconoscono i glicani forniscono informazioni sulle configurazioni strutturali dei glicani, che possono aiutare a chiarire le interazioni biologiche e i ruoli funzionali.
I glicani sono onnipresenti in tutti i domini della vita e mostrano una diversità senza precedenti nella struttura e nella funzione rispetto ad altremacromolecole. Tuttavia, a causa della loro complessità, della variabilità nella biosintesi e nei legami glicosidici e della scarsità di metodi appropriati per sezionare le strutture dei glicani, la nostra comprensione di questa diversità nelle strutture e nelle funzioni èrelativamente limitata.
Molte tecniche di analisi dei glicani sono distruttive e richiedono la scomposizione dei glicani nei loro monosaccaridi costituenti, che possono oscurare contesti tridimensionali e biologici rilevanti3. Al contrario, gli anticorpi monoclonali (mAb), i moduli leganti i carboidrati (CBM), le lectine, le agglutinine virali e le adesine microbiche, note collettivamente come sonde molecolari che riconoscono i glicani (GRMP)4, riconoscono e si legano a epitopi specifici e possono essere utilizzati come strumenti per rilevare e discriminare tra glicani all'interno di matrici multiglicaniche complesse 5,6.
In questo articolo presentiamo il microarray polymer profiling (MAPP), un metodo rapido, versatile e non distruttivo per l'analisi dei glicani, applicabile a un ampio spettro di campioni biologici. Il metodo mira a fornire una tecnologia robusta e ad alto rendimento per l'analisi dei glicani da diversi sistemi biologici e industriali/commerciali. MAPP unisce la specificità di riconoscimento delle sonde molecolari dirette da glicani con una tecnologia di screening microarray riproducibile e ad alte prestazioni per consentire il profilo di migliaia di interazioni molecolari in parallelo. Il risultato di questo approccio è l'intuizione diagnostica della composizione e dell'abbondanza relativa di glicani all'interno di un campione o di un tessuto di interesse.
MAPP può essere utilizzato come metodo indipendente, stand-alone, o in combinazione con altre tecniche biochimiche, come la microscopia a immunofluorescenza 7,8,9 e l'analisi monosaccaridica o di linkage10,11. La tecnica può anche essere utilizzata per mappare le specificità degli epitopi dei nuovi GRMP, utilizzando array stampati con standard di oligosaccaridi puri e strutturalmente ben definiti12. Uno dei principali vantaggi di MAPP rispetto ad altri metodi, come il saggio di immunoassorbimento enzimatico (ELISA), è la sua compatibilità con piccoli volumi di campione13,14. Inoltre, MAPP offre un'analisi a produttività significativamente più elevata15 e fornisce una forma efficace di conservazione dei campioni, poiché i campioni stampati sono asciutti e stabili quando immobilizzati su nitrocellulosa16.
Il legame dei GRMP dipende generalmente dalla presenza di un certo numero di residui zuccherini contigui che formano collettivamente un sito di legame (epitopo) che è unico per una particolare classe di polisaccaridi (xilano, mannano, xiloglucano, ecc.) 17. Al contrario, i singoli residui zuccherini (xilosio, mannosio, glucosio) quantificati utilizzando la maggior parte delle tecniche biochimiche, ad esempio la composizione dei monosaccaridi o l'analisi della metilazione, possono essere componenti di più classi di polisaccaridi e quindi difficili da assegnare18.
MAPP è stato sviluppato in risposta a una lacuna tecnologica, vale a dire la capacità di analizzare rapidamente più glicani da una varietà di fonti utilizzando piccole quantità di materiale. MAPP capitalizza l'ampio repertorio di GRMP che sono stati sviluppati e caratterizzati negli ultimi tre decenni 12,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32. Lo sviluppo di MAPP è stato un processo iterativo, con la tecnica costantemente perfezionata e ottimizzata. Esiste ora una notevole letteratura che descrive l'applicazione di MAPP a vari sistemi naturali e industriali in cui i glicani svolgono ruoli centrali 5,6,9,10,21,33,34,35,36,37,38,39. Qui descriviamo lo stato attuale dell'arte di MAPP.
Le principali fasi sperimentali del metodo MAPP sono riassunte nella Figura 1.
1. Preparazione dei campioni
NOTA: In questo caso, il metodo viene applicato ai tessuti vegetali a scopo illustrativo. Le piante selezionate sono state Coffea arabica, Allium sativum var. ophioscorodon e diverse varietà di mango thailandese (Aokrong, Kam, Rad, Chokanan, Mamkamdang, Talabnak, Mahachanok e Nga). Le piante sono state selezionate per la loro importanza commerciale. La loro lavorazione per il consumo umano genera scarti agroindustriali attualmente sottoutilizzati, che possono fornire una fonte di prodotti a valore aggiunto, tra cui i glicani puri. Pertanto, MAPP è stato applicato per caratterizzare la composizione glicanica della biomassa vegetale di scarto per scopi di bioprospezione.
2. Preparazione del residuo insolubile in alcool (ARIA)
3. Estrazione di glicani
NOTA: Se possibile, eseguire tutte le fasi di estrazione in un lizzatore tissutale con un cuscinetto a sfere in ciascuna provetta per favorire la risospensione. Se non è disponibile un lisatore tissutale, le estrazioni possono essere eseguite con agitazione o agitazione continua. Se ciò non è possibile, potrebbe essere necessario prolungare il tempo di estrazione.
4. Elaborazione delle norme
5. Stampa di microarray
6. Sonda di microarray
7. Analisi e quantificazione
MAPP è stato applicato per determinare la composizione glicanica degli scarti di biomassa agricola, comprendenti bucce di mango di diverse varietà della Thailandia settentrionale, polpa di ciliegia Coffea arabica e scarti di lavorazione dei chicchi di caffè e radici, steli e tessuti fogliari di aglio nero tailandese, Allium sativum var. Diversi polisaccaridi di origine vegetale sono utilizzati nell'industria alimentare come ingredienti funzionali42,43. Pertanto, lo scopo di questo esperimento è stato quello di dedurre se questi materiali di scarto agro-industriali abbondanti e attualmente sottoutilizzati possano fornire una fonte di polisaccaridi puri a valore aggiunto.
Il materiale AIR viene utilizzato abitualmente per preparare campioni destinati all'analisi dei glicani44. Ci sono diversi vantaggi nell'utilizzo di AIR; il trattamento con solventi rimuove efficacemente CAZymes, metaboliti, piccoli saccaridi, lipidi e pigmenti endogeni, ottenendo campioni arricchiti con polisaccaridi e proteine strutturali34. Inoltre, la produzione di AIR è un modo rapido ed efficace per aumentare la longevità del campione, in quanto è termostabile e può essere conservato per diversi anni.
Tre frazioni miste di glicani costituenti sono state estratte in sequenza dal materiale AIR vegetale utilizzando CDTA, NaOH e cellulasi. CDTA chela gli ioni Ca2+ , che consentono la rimozione delle pectine deesterificate reticolate di Ca2+ dalle pareti cellulari vegetali45. Le condizioni alcaline consentono il rilascio di emicellulose, come mannano, xilano e β-glucano, a causa dell'interruzione del legame idrogeno e della saponificazione dei legami estere tra microfibrille di cellulosa ed emicellulosa e lignina ed emicellulosa, rispettivamente,46. Un'endo-1,4-β-glucanasi ricombinante da Bacillus spp. è stata utilizzata per degradare le regioni amorfe delle microfibrille strutturali di cellulosa, rilasciando glicani residui legati alla cellulosa all'interno delle pareti cellulari47. Sebbene questo metodo separi efficacemente i glicani in questi tre grandi gruppi, va notato che i campioni non sono puri; per la natura stessa del metodo di estrazione, l'emicellulosa, se presente nel campione, sarà inevitabilmente estratta e successivamente rilevata in varia misura nelle frazioni CDTA e cellulasi. Allo stesso modo, un po' di pectina sarà rilevata nell'estrazione di NaOH se presente nel campione.
Un robot piezoelettrico senza contatto per la stampa di microarray è stato utilizzato per immobilizzare le frazioni glicaniche estratte sulla nitrocellulosa tramite l'attacco non covalente11, formando 300 microarray identici. Gli standard di glicani definiti (Tabella 1) sono stati inclusi anche nei microarray stampati come controlli positivi (Figura 5). Il profilo di legame MAPP ottenuto per gli standard glicani selezionati corrisponde alle specificità degli epitopi precedentemente riportate. Ad esempio, LM21 ha mostrato un forte legame con più polisaccaridi di mannano (galattomannano e glucomannano), mentre LM22 ha mostrato solo un debole legame con il galattomannano25. Allo stesso modo, LM19 si lega preferenzialmente all'omogalatturonanodeesterificato 48 e LM15 si lega allo xiloglucano23 del seme di tamarindo.
L'abbondanza relativa di 16 epitopi, diagnostici di polisaccaridi della parete cellulare vegetale non cellulosica, è stata rilevata mediante l'attaccamento di anticorpi monoclonali diretti ai glicani (Tabella 2) agli estratti stampati (Figura 6). La maggior parte dei glicani estratti è stata rilevata all'interno della frazione alcalina di NaOH. Forti segnali di legame sono stati registrati per gli anticorpi monoclonali LM10 e LM11, che rappresentano xilano/arabinoxilan, all'interno delle bucce di tutte le varietà di mango testate. All'interno dei campioni di aglio, LM10 e LM11 si sono legati preferenzialmente all'estratto di tessuto radicale (aglio R) e hanno mostrato solo un debole legame con l'estratto di tessuto fogliare (aglio L). LM19, che rappresenta omogalatturonan parzialmente metil-esterificato o non esterificato, fortemente legato ad alcuni estratti di varietà di mango (Aokrong e Talabnak), ma legato solo debolmente, o il suo legame non era rilevabile, in altre varietà (Chokanan, Mamkamdang, Mahachanok e Nga). Inoltre, LM19 si è legato solo alle frazioni di polpa di caffè e non si è legato al materiale di scarto della lavorazione dei chicchi di caffè, precedentemente ritenuto composto da pectina di caffè semi-purificata (dati non pubblicati).
Figura 1: Principali fasi sperimentali del metodo MAPP. (A) I campioni vengono omogeneizzati per formare polveri fini. (B) I campioni omogeneizzati vengono processati per isolare i loro AIR. (C) I glicani costituenti sono estratti in sequenza utilizzando un regime di estrazione su misura. (D) Le frazioni glicaniche estratte vengono trasferite in piastre da 384 pozzetti, secondo il layout della piastra, per la stampa su nitrocellulosa. (E) I microarray stampati vengono sondati con GRMP selezionati. (F) Il legame dei GRMP alle frazioni glicaniche stampate viene quantificato e analizzato prima che i dati vengano presentati come mappa di calore. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Esempio di layout di una piastra a 384 pozzetti per il caricamento di campioni, inchiostri e GSB con quattro diluizioni per campione/standard di glicani estratti. Colori diversi denotano campioni derivanti da diversi reagenti di estrazione, mentre tonalità diverse rappresentano diluizioni seriali. Il primo numero nel codice rappresenta il numero del campione, mentre il numero finale rappresenta il numero di diluizione (D1 indica la diluizione uno, D2 indica la diluizione due e così via). Ad esempio, un bene etichettato '12D3' rappresenta il campione di glicani 12, diluizione tre. Le piastre dei pozzetti devono essere divise in otto sezioni identiche composte da sei colonne e otto file. La prima sezione della prima lastra deve contenere solo inchiostro e tampone e deve essere simile al layout della lastra di esempio. I campioni di glicani estratti possono quindi essere caricati nelle sezioni successive della piastra in base al layout della piastra. Reagenti di estrazione diversi non devono essere caricati nella stessa sezione della piastra. Se non ci sono campioni sufficienti per riempire un'intera sezione, riempire tutti i pozzetti rimanenti in quella sezione con tampone; Non lasciare i pozzi vuoti. Se sono necessarie più lastre, la sezione successiva dopo che tutti i campioni sono stati caricati deve contenere tre colonne alternate di inchiostro e GSB: questa potrebbe non essere la sezione otto, a seconda del numero di campioni stampati. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Rappresentazione schematica del progetto di microarray stampato. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Microarray rappresentativi. (A) Nessun vincolo. (B) Il segnale di legame è oscurato da un segnale di fondo elevato. (C) Colorazione blu/viola generalizzata dovuta a sovrasaturazione con NBT/BCIP. (D) Tastatura difettosa a causa dell'elevata concentrazione del substrato. (E) Stampa difettosa a causa della testina di stampa sporca. (F) Forte legame a pochi campioni. (G) Forte legame con molti campioni. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Legame dell'anticorpo monoclonale a standard glicani definiti, incluso per convalidare il processo di stampa e sondaggio. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: MAPP di glicani estratti da scarti di biomassa agricola. I campioni includono scarti di polpa di caffè (polpa di caffè e pectina di caffè), bucce di mango di diverse varietà thailandesi (AO, Aokrong; KO, Kam; RD, Rad; CH, Chokanan; MA, Mamkamdang; TL, Talabnak; MH, Mahachanok; NG, Nga) e foglie di aglio nero (Aglio L), gambo (Aglio S), bulbo (Aglio BG) e radici (Aglio R), utilizzando CDTA, NaOH e cellulasi (Bacillus spp. cellulasi 5A). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Tabella 1: Standard commerciali definiti per i polisaccaridi utilizzati nell'analisi MAPP come controlli positivi. Clicca qui per scaricare questa tabella.
Tabella 2: Anticorpi monoclonali diretti contro glicani selezionati per l'interrogazione di microarray di glicani vegetali estratti. Clicca qui per scaricare questa tabella.
La tecnica MAPP qui descritta è ormai un metodo consolidato per l'analisi dei glicani. I principi di base sono stati descritti per la prima volta nel 200711, ma la tecnica ha subito un continuo sviluppo al fine di capitalizzare le ultime innovazioni nella tecnologia dei microarray, lo sviluppo di sonde molecolari e i progressi nella nostra comprensione della biochimica dei glicani. In generale, i glicani, in particolare i polisaccaridi, sono più difficili da analizzare rispetto alle proteine e ai nucleotidi a causa della loro complessità strutturale ed eterogeneità45, nonché del fatto che non possono essere facilmente sequenziati o sintetizzati1. In molti casi, nessuna singola tecnica può decifrare in modo definitivo la complessità dei glicani; pertanto, MAPP viene spesso utilizzato con altri metodi. Questo è uno dei motivi per cui la preparazione dell'AIR viene solitamente scelta come punto di partenza per MAPP, poiché l'AIR è compatibile con la maggior parte degli altri metodi di analisi dei glicani34, facilitando il successivo confronto dei set di dati.
A causa dell'omogeneizzazione del campione prima della preparazione dell'aria, alcune informazioni spaziali vengono invariabilmente perse. Tuttavia, poiché i polisaccaridi vengono rilasciati sequenzialmente dai campioni, la presenza di epitopi nelle frazioni ottenute fornisce informazioni sull'architettura molecolare e sulla composizione di quel campione17. Pertanto, la selezione di un regime di estrazione appropriato è fondamentale per il successo del metodo. Diversi parametri determinano l'idoneità del metodo di estrazione: struttura cellulare, tempo, temperatura, pH, pressione, forza ionica del solvente e finezza del campione di particolato solido49. Si raccomanda di utilizzare una gamma di solventi sempre più aggressivi per massimizzare la probabilità di estrarre con successo i glicani costituenti e costruire un quadro compositivo rappresentativo del campione. Per la maggior parte dei campioni, CDTA, NaOH e cellulasi sono sufficienti per rimuovere i polisaccaridi di origine vegetale e della parete cellulare 33,50,51,52. Per alcuni campioni di tessuto, un regime di estrazione ibrido che include anche CaCl2, HCl e Na2CO3 ha dimostrato di avere successo53, mentre i campioni di microalghe marine possono richiedere l'aggiunta di acido etilendiamminotetraacetico (EDTA)10.
I microarray dovrebbero includere una serie di standard di glicani puri e definiti da utilizzare come controlli positivi5. Le norme incluse devono essere modificate in base alla natura del campione. Una volta stampato, è necessario selezionare i GRMP appropriati. La generazione di anticorpi monoclonali ibridomi in strutture polisaccaridicheè impegnativa 54; Gli anticorpi leganti i glicani sono difficili da allevare e possono avere una bassa affinità55. Fortunatamente, le informazioni sulla sequenza genica per i CBM possono essere ottenute con relativa facilità per l'espressione ricombinante4 e l'ingegnerizzazione delle loro specificità di legame56,57. Sebbene sia stato sviluppato un impressionante catalogo di GRMP, la maggior parte dei quali è ora disponibile da fonti commerciali, in relazione alla diversità delle strutture glicaniche esistenti in natura, solo una piccola parte è stata prodotta e caratterizzata con successo58. Ciò può limitare la capacità di rilevare e discriminare tra determinate strutture. Si consiglia di eseguire un primo esperimento di sondaggio utilizzando una o due sonde rappresentative di ciascuna struttura glicana principale che si prevede sia presente, per la quale la specificità di legame è ben caratterizzata. Nei successivi esperimenti di sondaggio, l'elenco delle sonde può essere ampliato per coprire una gamma più ampia di glicani e approfondire le strutture fini.
Anche se banale, garantire che i microarray vengano lavati accuratamente dopo ogni fase di incubazione è fondamentale per il successo della procedura di sondaggio. La rimozione inefficace di sonde non legate in modo specifico rischia di oscurare il risultato causando un segnale di fondo elevato dopo lo sviluppo del colore. In questo caso, è necessario ripetere la procedura di sondaggio, iniziando con un nuovo microarray. Inoltre, le matrici devono essere toccate con parsimonia e solo tenendo i bordi con una pinza; La membrana in nitrocellulosa è fragile e si danneggia facilmente. La soluzione per lo sviluppo del colore si accumula in crepe e pieghe, causando una sovrasaturazione, che impedisce l'analisi dell'array.
MAPP è veloce, adattabile e conveniente. Questo metodo è compatibile con glicani animali, microbici o vegetali derivati da qualsiasi sistema biologico o industriale, purché possano essere estratti e immobilizzati su nitrocellulosa, e per i quali si disponga di apposite sonde molecolari. I dati generati forniscono informazioni dettagliate, semi-quantitative, composizionali, che non possono essere facilmente ottenute tramite altri metodi di analisi dei glicani.
Gli autori ringraziano ArrayJet per la sua consulenza esperta in materia di robotica microarray. SS e JS desiderano riconoscere il sostegno del Fondo fondamentale 2022 (FF65/004), Università di Chiang Mai.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
1,3:1,4-β-D-Glucan, Lichenan (icelandic moss) | Megazyme | P-LICHN | |
1,4-β-D-Mannan | Megazyme | P-MANCB | |
384-well microtiter plate | Greiner Bio-One | M1686 | |
5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate (BCIP) | Melford | B74100-1.0 | |
Acetone | Sigma | 270725 | |
Alkaline Phosphatase AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 115-055-003 | |
Alkaline Phosphatase AffiniPure Goat Anti-Rat IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 112-055-003 | |
Alkaline Phosphatase AffiniPure Rabbit Anti-His Tag | Jackson ImmunoResearch | 300-055-240 | |
Arabinoxylan (wheat) | Megazyme | P-WAXYL | |
Array-Pro Analyzer Software | Media Cybernetics | Version 6.3 | |
Bacillus sp. Cellulase 5A (BCel5A) | NZYTech | CZ0564 | |
BAM antibodies | SeaProbes | Various | |
Black drawing ink (indian ink) | Winsor & Newton | GWD030 | |
Carbohydrate binding modules | NZYTech | Various | |
CCRC antibodies | CarboSource | Various | |
CDTA | Sigma | 319945 | |
Chloroform | Sigma | PHR1552 | |
Ethanol | Sigma | 1.11727 | |
Galactan (potato) | Megazyme | P-GALPOT | |
Galactomannan (carob) | Megazyme | P-GALML | |
Glycerol solution | Sigma | 49781-5L | |
Gum tragacanth (legumes) | Sigma-Aldrich | G1128 | |
INCh antibodies | INRA | Various | |
LM and JIM antibodies | PlantProbes | Various | |
Marathon Argus Microarray Printer | ArrayJet | ||
Methanol | Sigma | 34860 | |
Monoclonal antibodies | Biosupplies Australia | Various | |
NaBH4 | Sigma | 452882 | |
NaOH | Sigma | S5881 | |
Nitro-blue tetrazolium (NBT) | Melford | N66000-1.0 | |
Nitrocellulose membrane | Thermo Fisher Scientific | 88018 | |
Pectin (degree of methyl esterification 46%) | Danisco | NA | |
ProClin 200 | Sigma | 48171-U | |
Rhamnogalacturonan (soybean pectic fibre) | Megazyme | P-RHAGN | |
Rotating mixer | Fisher Scientific | 88-861-050 | |
Rotating/rocking Shaker | Cole-Parmer | ||
Skimmed milk powder | Marvel | ||
Spin filter | Costar Spin-X | 8160 | |
Stainless steel beads | Qiagen | 69989 | |
TissueLyser II | Qiagen | 85300 | |
Tris | Sigma | 93362 | |
Triton X-100 | Sigma | T8787-250ML | |
Tween 20 | Sigma | P9416-100ML | |
Xylan (beechwood) | Megazyme | P-XYLNBE | |
Xyloglucan (tamarind) | Megazyme | P-XYGLN | |
β-Glucan (oat) | Megazyme | P-BGOM |
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