A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
אתרי מגע מיטוכונדריאליים הם קומפלקסים חלבוניים המקיימים אינטראקציה עם חלבוני הממברנה הפנימית והחיצונית של המיטוכונדריה. אתרים אלה חיוניים לתקשורת בין קרומי המיטוכונדריה, ולכן בין הציטוזול לבין המטריצה המיטוכונדריאלית. במאמר זה אנו מתארים שיטה לזיהוי מועמדים המתאימים לסוג מסוים זה של חלבונים.
מיטוכונדריה נמצאים כמעט בכל התאים האיקריוטים ומבצעים תפקידים חיוניים הרבה מעבר לייצור אנרגיה, למשל, סינתזה של צבירי ברזל-גופרית, שומנים או חלבונים, חציצה Ca2+ והשראת אפופטוזיס. כמו כן, תפקוד לקוי של המיטוכונדריה גורם למחלות אנושיות חמורות כמו סרטן, סוכרת וניוון עצבי. כדי לבצע את הפונקציות האלה, המיטוכונדריה צריכים לתקשר עם שאר התא דרך המעטפת שלהם, המורכבת משני קרומים. לכן, שני קרומים אלה צריכים לקיים אינטראקציה כל הזמן. אתרי מגע חלבוניים בין הקרומים הפנימיים והחיצוניים של המיטוכונדריה חיוניים מבחינה זו. עד כה אותרו מספר אתרי קשר. בשיטה המתוארת כאן, משתמשים במיטוכונדריה של Saccharomyces cerevisiae כדי לבודד אתרי מגע, ובכך לזהות מועמדים המתאימים לחלבוני אתר מגע. השתמשנו בשיטה זו כדי לזהות את אתר המגע המיטוכונדריאלי ואת קומפלקס מערכת ארגון הקריסטות (MICOS), אחד הקומפלקסים העיקריים ליצירת אתרי מגע בקרום הפנימי של המיטוכונדריה, אשר נשמר משמרים לבני אדם. לאחרונה, שיפרנו עוד יותר שיטה זו כדי לזהות אתר קשר חדשני המורכב מ- Cqd1 וממתחם Por1-Om14.
מיטוכונדריה מבצעים מגוון תפקידים שונים באיקריוטים, כאשר הידוע ביותר הוא ייצור ATP באמצעות זרחן חמצוני. פונקציות אחרות כוללות ייצור של אשכולות ברזל-גופרית, סינתזת שומנים, ובאיקריוטים גבוהים יותר, איתות Ca2+, והשראת אפופטוזיס 1,2,3,4. פונקציות אלה קשורות באופן בלתי נפרד Ultrastructure מורכב שלהם.
מבנה העל המיטוכונדריאלי תואר לראשונה במיקרוסקופ אלקטרונים5. הוכח כי מיטוכונדריה הם אברונים מורכבים למדי המורכבים משני קרומים: הקרום החיצוני של המיטוכונדריה והקרום הפנימי של המיטוכונדריה. ל....
1. מאגרים ופתרונות מלאי
קל יחסית להפריד בין הקרומים הפנימיים והחיצוניים של המיטוכונדריה. עם זאת, הדור וההפרדה של שלפוחיות המכילות אתרי מגע הם הרבה יותר קשה. לדעתנו, שני שלבים הם קריטיים וחיוניים: תנאי הסוניקציה והשיפוע שבו נעשה שימוש.
בדרך כלל, מעברי צבע ליניאריים נחשבים כבעלי רזולוציה טובה יותר ב?.......
תת-שבירה מיטוכונדריאלית היא ניסוי מסובך עם מספר שלבים מורכבים ביותר. לכן, כיוונו לשפר עוד יותר, ובמידה מסוימת, לפשט את השיטה המבוססת שלנו32. כאן, האתגרים היו הדרישה לציוד מסובך ומיוחד מאוד, שהם לעתים קרובות מבנים בודדים, ואת צריכת הזמן והאנרגיה העצומה. לשם כך ניסינו להסיר את המש?.......
M.E.H. מודה ל- Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG), פרויקט מספר 413985647, לתמיכה כספית. המחברים מודים לד"ר מיכאל קיבלר, אוניברסיטת לודוויג-מקסימיליאן, מינכן, על תמיכתו הנדיבה והנרחבת. אנו אסירי תודה לוולטר נויפרט על תרומתו המדעית, הדיונים המועילים וההשראה המתמשכת שלו. J.F. מודה לבית הספר למוסמכים במדעי החיים במינכן (LSM) על התמיכה.
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
13.2 mL, Open-Top Thinwall Ultra-Clear Tube, 14 x 89mm | Beckman Instruments, Germany | 344059 | |
50 mL, Open-Top Thickwall Polycarbonate Open-Top Tube, 29 x 104mm | Beckman Instruments, Germany | 363647 | |
A-25.50 Fixed-Angle Rotor- Aluminum, 8 x 50 mL, 25,000 rpm, 75,600 x g | Beckman Instruments, Germany | 363055 | |
Abbe refractometer | Zeiss, Germany | discontinued, any pipet controller will suffice | |
accu-jet pro Pipet Controller | Brandtech, USA | BR26320 | discontinued, any pipet controller will suffice |
Beaker 1000 mL | DWK Life Science, Germany | C118.1 | |
Branson Digital Sonifier W-250 D | Branson Ultrasonics, USA | FIS15-338-125 | |
Branson Ultrasonic 3mm TAPERED MICROTIP | Branson Ultrasonics, USA | 101-148-062 | |
Branson Ultrasonics 200- and 400-Watt Sonifiers: Rosette Cooling Cell | Branson Ultrasonics, USA | 15-338-70 | |
Centrifuge Avanti JXN-26 | Beckman Instruments, Germany | B37912 | |
Centrifuge Optima XPN-100 ultra | Beckman Instruments, Germany | 8043-30-0031 | |
cOmplete Proteaseinhibtor-Cocktail | Roche, Switzerland | 11697498001 | |
D-Sorbit | Roth, Germany | 6213 | |
EDTA (Ethylendiamin-tetraacetic acid disodium salt dihydrate) | Roth, Germany | 8043 | |
Erlenmeyer flask, 100 mL | Roth, Germany | X747.1 | |
graduated pipette, Kl. B, 25:0, 0.1 | Hirschmann, Germany | 1180170 | |
graduated pipette, Kl. B, 5:0, 0.05 | Hirschmann, Germany | 1180153 | |
ice bath | neoLab, Germany | S12651 | |
Magnetic stirrer RCT basic | IKA-Werke GmbH, Germany | Z645060GB-1EA | |
MOPS (3-(N-Morpholino)propanesulphonic acid) | Gerbu, Germany | 1081 | |
MyPipetman Select P1000 | Gilson, USA | FP10006S | |
MyPipetman Select P20 | Gilson, USA | FP10003S | |
MyPipetman Select P200 | Gilson, USA | FP10005S | |
Omnifix 1 mL | Braun, Germany | 4022495251879 | |
Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) | Serva, Germany | 32395.03 | |
STERICAN cannula 21 Gx4 4/5 0.8x120 mm | Braun, Germany | 4022495052414 | |
stirring bar, 15 mm | VWR, USA | 442-0366 | |
Sucrose | Merck, Germany | S8501 | |
SW 41 Ti Swinging-Bucket Rotor | Beckman Instruments, Germany | 331362 | |
Test tubes | Eppendorf, Germany | 3810X | |
Tissue grinders, Potter-Elvehjem type, 2 mL glass vessel | VWR, USA | 432-0200 | |
Tissue grinders, Potter-Elvehjem type, 2 mL plunger with serrated tip | VWR, USA | 432-0212 | |
Trichloroacetic acid (TCA) | Sigma Aldrich, Germany | 33731 | discontinued, any TCA will suffice (CAS: 73-03-9) |
TRIS | Roth, Germany | 4855 |
Explore More Articles
This article has been published
Video Coming Soon
ABOUT JoVE
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved