Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

אתרי מגע מיטוכונדריאליים הם קומפלקסים חלבוניים המקיימים אינטראקציה עם חלבוני הממברנה הפנימית והחיצונית של המיטוכונדריה. אתרים אלה חיוניים לתקשורת בין קרומי המיטוכונדריה, ולכן בין הציטוזול לבין המטריצה המיטוכונדריאלית. במאמר זה אנו מתארים שיטה לזיהוי מועמדים המתאימים לסוג מסוים זה של חלבונים.

Abstract

מיטוכונדריה נמצאים כמעט בכל התאים האיקריוטים ומבצעים תפקידים חיוניים הרבה מעבר לייצור אנרגיה, למשל, סינתזה של צבירי ברזל-גופרית, שומנים או חלבונים, חציצה Ca2+ והשראת אפופטוזיס. כמו כן, תפקוד לקוי של המיטוכונדריה גורם למחלות אנושיות חמורות כמו סרטן, סוכרת וניוון עצבי. כדי לבצע את הפונקציות האלה, המיטוכונדריה צריכים לתקשר עם שאר התא דרך המעטפת שלהם, המורכבת משני קרומים. לכן, שני קרומים אלה צריכים לקיים אינטראקציה כל הזמן. אתרי מגע חלבוניים בין הקרומים הפנימיים והחיצוניים של המיטוכונדריה חיוניים מבחינה זו. עד כה אותרו מספר אתרי קשר. בשיטה המתוארת כאן, משתמשים במיטוכונדריה של Saccharomyces cerevisiae כדי לבודד אתרי מגע, ובכך לזהות מועמדים המתאימים לחלבוני אתר מגע. השתמשנו בשיטה זו כדי לזהות את אתר המגע המיטוכונדריאלי ואת קומפלקס מערכת ארגון הקריסטות (MICOS), אחד הקומפלקסים העיקריים ליצירת אתרי מגע בקרום הפנימי של המיטוכונדריה, אשר נשמר משמרים לבני אדם. לאחרונה, שיפרנו עוד יותר שיטה זו כדי לזהות אתר קשר חדשני המורכב מ- Cqd1 וממתחם Por1-Om14.

Introduction

מיטוכונדריה מבצעים מגוון תפקידים שונים באיקריוטים, כאשר הידוע ביותר הוא ייצור ATP באמצעות זרחן חמצוני. פונקציות אחרות כוללות ייצור של אשכולות ברזל-גופרית, סינתזת שומנים, ובאיקריוטים גבוהים יותר, איתות Ca2+, והשראת אפופטוזיס 1,2,3,4. פונקציות אלה קשורות באופן בלתי נפרד Ultrastructure מורכב שלהם.

מבנה העל המיטוכונדריאלי תואר לראשונה במיקרוסקופ אלקטרונים5. הוכח כי מיטוכונדריה הם אברונים מורכבים למדי המורכבים משני קרומים: הקרום החיצוני של המיטוכונדריה והקרום הפנימי של המיטוכונדריה. ל....

Protocol

1. מאגרים ופתרונות מלאי

  1. הכינו תמיסת 1 M 3-morpholinopropane-1-sulfonic acid (MOPS) במים שעברו דה-יוניזציה, pH 7.4. יש לאחסן בטמפרטורה של 4°C.
  2. הכן 500 mM ethylenediaminetetraacetic חומצה (EDTA) במים deionized, pH 8.0. יש לאחסן בטמפרטורת החדר.
  3. הכינו סורביטול 2.4 מ 'במים נטולי יונים. יש לאחסן בטמפרטורת החדר לאחר האוטוקלאב.......

Representative Results

קל יחסית להפריד בין הקרומים הפנימיים והחיצוניים של המיטוכונדריה. עם זאת, הדור וההפרדה של שלפוחיות המכילות אתרי מגע הם הרבה יותר קשה. לדעתנו, שני שלבים הם קריטיים וחיוניים: תנאי הסוניקציה והשיפוע שבו נעשה שימוש.

בדרך כלל, מעברי צבע ליניאריים נחשבים כבעלי רזולוציה טובה יותר ב?.......

Discussion

תת-שבירה מיטוכונדריאלית היא ניסוי מסובך עם מספר שלבים מורכבים ביותר. לכן, כיוונו לשפר עוד יותר, ובמידה מסוימת, לפשט את השיטה המבוססת שלנו32. כאן, האתגרים היו הדרישה לציוד מסובך ומיוחד מאוד, שהם לעתים קרובות מבנים בודדים, ואת צריכת הזמן והאנרגיה העצומה. לשם כך ניסינו להסיר את המש?.......

Disclosures

המחברים מצהירים כי אין ניגודי עניינים.

Acknowledgements

M.E.H. מודה ל- Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG), פרויקט מספר 413985647, לתמיכה כספית. המחברים מודים לד"ר מיכאל קיבלר, אוניברסיטת לודוויג-מקסימיליאן, מינכן, על תמיכתו הנדיבה והנרחבת. אנו אסירי תודה לוולטר נויפרט על תרומתו המדעית, הדיונים המועילים וההשראה המתמשכת שלו. J.F. מודה לבית הספר למוסמכים במדעי החיים במינכן (LSM) על התמיכה.

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
13.2 mL, Open-Top Thinwall Ultra-Clear Tube, 14 x 89mmBeckman Instruments, Germany344059
50 mL, Open-Top Thickwall Polycarbonate Open-Top Tube, 29 x 104mmBeckman Instruments, Germany363647
A-25.50 Fixed-Angle Rotor- Aluminum, 8 x 50 mL, 25,000 rpm, 75,600 x gBeckman Instruments, Germany363055
Abbe refractometerZeiss, Germanydiscontinued,
any pipet controller will suffice
accu-jet pro Pipet ControllerBrandtech, USABR26320discontinued,
any pipet controller will suffice
Beaker 1000 mLDWK Life Science, GermanyC118.1
Branson  Digital Sonifier W-250 DBranson Ultrasonics, USAFIS15-338-125
Branson Ultrasonic 3mm TAPERED MICROTIPBranson Ultrasonics, USA101-148-062
Branson Ultrasonics 200- and 400-Watt Sonifiers: Rosette Cooling CellBranson Ultrasonics, USA15-338-70
Centrifuge Avanti JXN-26Beckman Instruments, GermanyB37912
Centrifuge Optima XPN-100 ultraBeckman Instruments, Germany8043-30-0031
cOmplete Proteaseinhibtor-CocktailRoche, Switzerland11697498001
D-SorbitRoth, Germany6213
EDTA (Ethylendiamin-tetraacetic acid disodium salt dihydrate)Roth, Germany8043
Erlenmeyer flask, 100 mLRoth, GermanyX747.1
graduated pipette, Kl. B, 25:0, 0.1Hirschmann, Germany1180170
graduated pipette, Kl. B, 5:0, 0.05Hirschmann, Germany1180153
ice bathneoLab, Germany S12651
Magnetic stirrer RCT basicIKA-Werke GmbH, GermanyZ645060GB-1EA
MOPS (3-(N-Morpholino)propanesulphonic acid)Gerbu, Germany1081
MyPipetman Select P1000Gilson, USAFP10006S
MyPipetman Select P20Gilson, USAFP10003S
MyPipetman Select P200Gilson, USAFP10005S
Omnifix 1 mLBraun, Germany4022495251879
Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)Serva, Germany32395.03
STERICAN cannula 21 Gx4 4/5 0.8x120 mmBraun, Germany4022495052414
stirring bar, 15 mmVWR, USA442-0366
SucroseMerck, GermanyS8501
SW 41 Ti Swinging-Bucket RotorBeckman Instruments, Germany331362
Test tubesEppendorf, Germany3810X
Tissue grinders, Potter-Elvehjem type, 2 mL glass vesselVWR, USA432-0200
Tissue grinders, Potter-Elvehjem type, 2 mL plunger with serrated tipVWR, USA432-0212
Trichloroacetic acid (TCA)Sigma Aldrich, Germany33731discontinued,
any TCA will suffice (CAS: 73-03-9)
TRISRoth, Germany4855

References

  1. Braymer, J. J., Freibert, S. A., Rakwalska-bange, M., Lill, R. BBA - Molecular Cell Research Mechanistic concepts of iron-sulfur protein biogenesis in Biology * General concepts of FeS protein biogenesis. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Cell Research. 1868 (1), 118863 (2021).
  2. Osman, C., Merkwirth, C., Langer, T.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

Ca2Saccharomyces cerevisiaeMICOSCqd1 Por1 Om14

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved