Este trabajo se realizó en parte en la Instalación de Instrumentación Analítica (AIF) de la Universidad Estatal de Carolina del Norte, que cuenta con el apoyo del Estado de Carolina del Norte y la Fundación Nacional de Ciencias (número de premio ECCS-2025064). La AIF es miembro de la Red de Nanotecnología del Triángulo de Investigación de Carolina del Norte (RTNN), un sitio en la Infraestructura Nacional Coordinada de Nanotecnología (NNCI). Los autores desean agradecer a Damien Alloyeau, Director de Investigación del CNRS en la Universidad de París Cité, por proporcionar los resultados del estudio del umbral de dosis de zeolita CFEG de 200 kV.

1. Método 1: Calibración de la dosis del microscopio electrónico de transmisión para los modos de imagen TEM y TEM de barrido (STEM)
<ol><li>Encienda el picoamperímetro y deje que se caliente durante un mínimo de 30 minutos antes de comenzar una calibración de dosis. Cargue el soporte de calibración de dosis en el TEM y conecte el soporte de calibración al picoamperímetro mediante el cable de conexión rápida.</li>
	<li>Con el microscopio en modo TEM , abra las válvulas de columna y localice el orificio fiducial de 35 μm en el soporte de dosis (Figura 2). Inicie la aplicación de software MVS y seleccione Dosis (Automatización de calibración) de las opciones del experimento. NOTA: El software guarda la ubicación del orificio fiducial después de la calibración inicial, lo que permite al software localizar automáticamente su posición para futuras calibraciones.</li>
	<li>Haga clic en el icono Conectar (Figura 1A) y seleccione el microscopio para activar la conexión entre el TEM y el software MVS. Una vez conectado, las imágenes de la cámara/detector serán visibles en el visor de imágenes del software. NOTA: No es necesario optimizar la altura eucéntrica, y el borde del orificio fiducial puede aparecer borroso debido al grosor de la punta. Esto no afectará a las mediciones actuales.</li>
	<li>Vaya a la pestaña Dosis y, a continuación, a Calibración de dosis. Seleccione el proceso de calibración del área de dosis , siga las instrucciones del software e introduzca los valores configurables por el usuario solicitados (como la apertura y la configuración del monocromador). Una vez completada la calibración del área de dosis, seleccione el proceso de calibración de la corriente de dosis y siga las instrucciones del software.</li>
	<li>Repita el proceso de calibración (paso 1.4) para cada tamaño de punto, apertura o ajuste de monocromador que pueda utilizarse durante el experimento.</li>
	<li>Cuando finalice el proceso de calibración para el modo TEM , calibre la dosis de electrones para el modo STEM repitiendo el paso 1.4. NOTA: El modo STEM no requiere que se realice la calibración del área de dosis .</li>
	<li>Cuando finalicen todas las calibraciones deseadas, haga clic en Cerrar sesión, retire el soporte de calibración de dosis y vuelva a la pantalla de inicio del software MVS.</li>
</ol>2. Método 2: Determinación del umbral de dosis utilizando el MVS y el software de dosis
<ol><li>Cargue una rejilla TEM estándar con una muestra (en este ejemplo se utilizaron nanopartículas de zeolita ZSM-5 disponibles comercialmente) en un soporte TEM estándar. Inserte el soporte en el TEM y localice una región de interés (nanopartículas de zeolita cristalina).</li>
	<li>Abra la aplicación de software MVS y seleccione Otro. NOTA: Se puede agregar información adicional sobre la muestra (por ejemplo, identificador y descripción de la muestra, el nombre del operador y notas del experimento) al campo de parámetros experimentales.</li>
	<li>Repita el paso 1.3 para conectarse al software MVS y navegue hasta la pestaña de metadatos de imagen en la interfaz del software MVS para seleccionar los siguientes metadatos para superponer en la secuencia de imágenes que se muestra en la visualización en vivo: Ampliación, Dosis máxima y Tasa de dosis. Se pueden incluir otros metadatos si el usuario lo desea. En el Archivo Suplementario 1 se proporciona una captura de pantalla de la interfaz del software MVS que muestra los controles de gestión de dosis.</li>
	<li>Abra la pestaña Dosis y seleccione Administración de dosis y Habilitar monitoreo de dosis para activar el seguimiento automatizado de la dosis de electrones. Seleccione Mostrar capa de dosis para mostrar la superposición de color de dosis.</li>
	<li>Establezca los valores para el nivel de dosis alto y la tasa de dosis alta y presione Guardar (en este ejemplo, se usaron valores de 60,000 e-/Å 2 y 500 e-/Å2·s, respectivamente).</li>
	<li>Vaya a la pestaña Configuración, seleccione Dosis y establezca los valores de Opacidad del mapa de navegación de dosis y Opacidad de superposición de imagen de dosis (en este ejemplo, se usaron valores de 0,50 y 0,30, respectivamente).</li>
	<li>En la ventana Live Image Viewer , active la corrección de deriva haciendo clic en Drift Correct.</li>
	<li>Desplácese hasta la pestaña Vista de datos y trace los valores de metadatos Desenfocar y Cociente de enfoque en el eje Y. NOTA: Cualquiera de los valores de metadatos disponibles se puede trazar en tiempo real durante el experimento desde la tabla de vista de datos.</li>
	<li>Active Focus Assist y, a continuación, seleccione Calibrar Focus para ejecutar la calibración automatizada del asistente de enfoque. Una vez completada la rutina Calibrar enfoque , cierre la pestaña Vista de datos .</li>
	<li>Abra la pestaña Análisis de imágenes en el software MVS y active las opciones Live FFT y Quadrants 1 & 2 .</li>
	<li>Usando los controles de software del microscopio, ajuste las condiciones del haz para que el flujo de electrones sea ~ 500 e-/Å2 · s. y muévase a una nueva región en la muestra y centre el ROI de la muestra en la vista en vivo del software MVS. NOTA: Al realizar grandes movimientos en el escenario, el control de deriva y la asistencia de enfoque se desactivarán automáticamente y deben volver a activarse una vez que se seleccione el nuevo ROI.</li>
	<li>Anote las condiciones de dosis en el software utilizando la función Etiqueta . Resalte el icono Etiqueta e introduzca el texto deseado para indicar una serie específica de imágenes dentro de la línea de tiempo. Las imágenes se etiquetarán con este texto hasta que se anule la selección del icono Etiqueta .</li>
	<li>Mantenga una tasa de dosis constante mientras obtiene continuamente imágenes del mismo ROI hasta que los picos correspondientes a la estructura atómica en el gráfico FFT hayan desaparecido.</li>
	<li>Reduzca la ampliación, abra la ficha Gestión de dosis y active Mostrar capa de dosis para superponer un mapa de dosis codificado por colores. NOTA: Esta característica proporciona una referencia visual de las áreas de la muestra que han sido expuestas al haz de electrones y su exposición a la dosis relativa. Resaltar estas áreas en imágenes individuales con el cursor indicará sus respectivos valores de dosis.</li>
	<li>Desconecte y finalice la sesión anulando la selección de Conectar y, a continuación, seleccione Cerrar sesión. Guarde una copia de los datos de sesión en una fuente externa para evitar que los datos guardados en el software MVS se sobrescriban durante experimentos posteriores (Archivo complementario 2).</li>
</ol>3. Método 3: Análisis de metadatos y tendencias y exportación de datos utilizando el software de análisis
<ol><li>Inicie el software de análisis (el software sin conexión para ver los conjuntos de datos totalmente sincronizados) y abra el archivo de sesión del experimento seleccionándolo de la biblioteca de archivos. NOTA: Los usuarios también pueden acceder al software de análisis a través del icono Sesión de revisión en el software MVS durante un experimento.</li>
	<li>Muestre las imágenes corregidas por deriva activando la pestaña DC debajo del puerto de vista de imagen y seleccione las superposiciones de datos deseadas marcando sus respectivas casillas Datos de superposición en la pestaña Metadatos de imagen (en este ejemplo, se utilizaron Microscopio, Fecha / hora, Tasa de dosis, Dosis máxima y Ampliación). Otros metadatos se pueden trazar como el usuario desee.</li>
	<li>Marque la casilla Línea de tiempo para Dosis máxima y Tasa de dosis para agregar un gráfico de estos valores a la línea de tiempo. Resalte o desplácese por estos gráficos para actualizar la imagen que se muestra en la ventana gráfica. Acceda a una variedad de herramientas a través de las pestañas Notas, Análisis de imágenes, Caja de herramientas y Vista de datos.<ol><li>Acceda al FFT para cada imagen a través de la pestaña Análisis de imagen y haga clic en Live FFT para actualizar el FFT mientras se desplaza por las imágenes.</li>
		<li>Utilice el desvanecimiento de los picos FFT para determinar el punto de tiempo en el que la estructura de zeolita pierde cristalinidad. Registre el valor de dosis máxima registrado con esa imagen.</li>
	</ol></li>
	<li>Utilice la opción Filtro para filtrar fácilmente conjuntos de datos grandes en conjuntos de datos más pequeños y compartibles sin perder sus metadatos asociados. Abra el panel de filtros y ajuste los controles deslizantes para que solo se seleccionen los datos con una tasa de dosis igual o superior a ~ 500 e-/Å2 ·s, y guarde la nueva colección con el nombre Estudio de umbral de dosis. NOTA: Se pueden aplicar filtros para cualquiera de los tipos de metadatos asociados.</li>
	<li>Exporte las imágenes y los metadatos de la sesión a otros tipos de archivos enriquecidos con barras de escala y superposiciones de metadatos.<ol><li>Resalte la colección en el panel de biblioteca y seleccione Publicar haciendo clic con el botón secundario en la selección. En la ventana Publicar , seleccione las opciones deseadas para la exportación del tipo de archivo.</li>
		<li>Seleccione la pestaña de datos corregidos por deriva y aplique superposiciones de los metadatos deseados y la FFT (coloque la superposición FFT como desee; en la figura 3 se muestran ejemplos de imágenes exportadas con la FFT).</li>
	</ol></li>
	<li>Exporte la serie de imágenes como un archivo de película utilizando la misma opción Publicar . Seleccione las imágenes resaltándolas en la línea de tiempo, utilizando las opciones de filtro o exportando el archivo de base de datos completo. Seleccione el formato de película, la velocidad de fotogramas y la ubicación del archivo deseados. En el Archivo Suplementario 3 se proporciona una película del experimento de degradación de zeolita obtenido utilizando un TEM de 200 kV.</li>
	<li>Exporte los metadatos por separado de las imágenes adquiridas como un archivo CSV seleccionando la opción Metadatos (CSV) durante la publicación. NOTA: Las imágenes sin procesar y corregidas por deriva se exportan como CSV independientes (Archivo complementario 4 y Archivo complementario 5).</li>
</ol>4. Método 4: Estudio de calentamiento in situ de oro sobre nanopartículas de óxido de hierro
<ol><li>Coloque un nanocatalizador (Au/FeOx) suspendido en etanol en un chip E calentador in situ , un soporte de muestra micoelectromecánico (MEM), y deje que se seque al aire. Monte la muestra en el soporte de calefacción in situ , inserte el soporte con la muestra en el TEM y conecte el soporte a la fuente de alimentación utilizando el cable suministrado. Localice un ROI de ejemplo mediante los controles TEM. NOTA: Este experimento utilizó un soporte de calefacción que está totalmente integrado con el software MVS, lo que permite incrustar metadatos de temperatura con las imágenes.</li>
	<li>Seleccione la opción de flujo de trabajo adecuada del software MVS (en este ejemplo, se utilizó Fusion Workflow , pero se pueden usar soportes de calefacción de otros fabricantes seleccionando Otro).</li>
	<li>Siga las indicaciones del flujo de trabajo para confirmar la conexión eléctrica entre el soporte y el chip electrónico de calefacción cargando el archivo de calibración y realizando una comprobación del dispositivo. </li>
	<li>Conecte el microscopio al software MVS, como se mostró anteriormente en los pasos 2.3-2.10 (en este ejemplo, se seleccionaron los valores de metadatos para la tasa de dosis, la dosis máxima, la correlación de coincidencia, la tasa de deriva y la temperatura del canal A) y centre el ROI de la muestra en el campo de visión.</li>
	<li>Abra la pestaña Fusion AX y configure y aplique una temperatura.</li>
	<li>Haga clic en el botón Configuración del canal A para acceder a la configuración del control de temperatura. Seleccione la función Temperatura y el modo de control manual .</li>
	<li>Haga clic en el botón Experimento para acceder a los controles experimentales. Ajuste la velocidad de rampa a 10 °C/s y el objetivo a 600 °C. Haga clic en Aplicar para iniciar el experimento. NOTA: El experimento se puede pausar o detener en cualquier momento utilizando los botones de acceso rápido en la esquina inferior derecha del software MVS, sin abrir la pestaña Fusion AX .</li>
	<li>Una vez alcanzada la temperatura establecida de 600 °C, abra la pestaña Fusion AX y seleccione Experimento. Cambie la velocidad de rampa a 2 °C y el objetivo a 800 °C. Haga clic en Aplicar para iniciar el experimento. NOTA: El procedimiento para aplicar una rampa de calentamiento depende del sistema de calefacción in situ que se utilice. Los pasos resaltados anteriormente para aplicar la rampa de temperatura se aplican al sistema utilizado en este ejemplo.</li>
	<li>Resalte cualquier evento o punto de interés durante el experimento mediante la función de etiquetado, como se muestra en el paso 2.10. Continúe tomando imágenes de la muestra y ajuste el perfil de temperatura como desee. Cuando haya terminado, haga clic en Finalizar sesión y guarde el archivo de datos utilizando el software de análisis (una parte del archivo de base de datos discutido en los resultados representativos se suministra como Archivo complementario 6).</li>
	<li>Abra el software de análisis para revisar la sesión. Trazar la temperatura, el factor de transformación de la plantilla, la tasa de dosis y la dosis acumulada en la línea de tiempo. Exporte imágenes y vídeos como desee siguiendo los pasos descritos en los pasos 3.6 y 3.7. Las imágenes y los vídeos pueden exportarse con o sin las superposiciones del mapa de dosis (Figura 4).</li>
</ol>

Flujos de trabajo TEM, análisis de resultados y gestión de datos mediante un enfoque de visión artificial

<ol>
	<li>Thomas, J. M., Leary, R. K., Eggeman, A. S., Midgley, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+rapidly+changing+face+of+electron+microscopy.">The rapidly changing face of electron microscopy.</a> Chemical Physics Letters. 631, 103-113 (2015).</li><li>Spurgeon, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+data-driven+next-generation+transmission+electron+microscopy.">Towards data-driven next-generation transmission electron microscopy.</a> Nature Materials. 20 (3), 274-279 (2021).</li><li>Gai, P. L., Boyes, E. 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D., Erni, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+Au+nanoparticles+in+liquid+cell+transmission+electron+microscopy:+From+a+systematic+study+to+engineered+nanostructures.">Formation of Au nanoparticles in liquid cell transmission electron microscopy: From a systematic study to engineered nanostructures.</a> Chemistry of Materials. 29 (24), 10518-10525 (2017).</li></ol>

Todos los autores son empleados de Protochips, Inc.

La interpretación de los resultados experimentales de TEM a menudo depende de muchos parámetros experimentales interconectados, como ajustes de microscopio, condiciones de imagen y, en el caso de experimentos operativos o in situ, cambios en el entorno o estímulos 1,23. El análisis preciso de grandes conjuntos de datos TEM, sobre los cuales estos parámetros pueden modificarse continuamente, requiere una atención significativa por parte del operador para registrar con precisión cada condición y configuración para cada imagen en un diario de laboratorio u otra fuente de documentación externa. A medida que los conjuntos de datos TEM crecen en tamaño y complejidad, el mantenimiento manual de registros se vuelve inmanejable y la información clave puede perderse o registrarse de manera inexacta. El software MVS descrito aquí consolida los metadatos generados durante un experimento desde el microscopio, el detector / cámara y otros sistemas (como los soportes de muestras in situ) y los alinea con sus respectivas imágenes.
Además de la consolidación de metadatos, el software aplica algoritmos de visión artificial para rastrear y estabilizar el campo de visión a través de una combinación de correcciones espaciales, de haz y digitales utilizando sus funciones Drift Correct y Focus Assist . Cuando se activa la función Drift Correct , se genera una imagen de "plantilla" de correlación cruzada utilizando la primera imagen extraída en el software MVS. La plantilla se compara con las imágenes entrantes para calcular la dirección y la magnitud de la deriva o el movimiento de la muestra. Con esta información, el software MVS aplica automáticamente las correcciones necesarias para mantener las características de la imagen en el mismo lugar ajustando al menos uno de tres parámetros: ubicación del escenario, haz o desplazamiento de imagen, y corrección de imagen digital. La función Focus Assist utiliza una combinación de algoritmos para asignar un valor de enfoque, llamado puntuación de enfoque a cada imagen, y esas puntuaciones se comparan para determinar la magnitud y la dirección del ajuste de desenfoque que se debe aplicar para mantener la muestra enfocada. En el modo de imagen STEM, el software MVS intenta maximizar el contraste a través de una versión patentada de varianza normalizada para asignar la puntuación de enfoque. En el modo TEM, se calcula una suma radial de intensidad en el FFT y se utiliza para calcular la puntuación de enfoque. Las limitaciones a la capacidad del software MVS para optimizar el enfoque ocurren cuando no puede calcular con precisión la puntuación de enfoque correcta para una imagen. Esto ocurre típicamente cuando el microscopio está desalineado o la muestra está significativamente desenfocada durante la calibración, lo que impide que el software calcule correctamente el valor correcto de la puntuación de enfoque inicial. El software MVS puede tener dificultades para calcular la puntuación de enfoque para muestras con franjas de celosía bien definidas, ya que las franjas de celosía en el FFT pueden "abrumar" el algoritmo de puntuación de enfoque; Por lo tanto, si una muestra se desenfoca, es posible que la puntuación de enfoque no refleje con precisión el cambio de enfoque. Por el contrario, trabajar con aumentos bajos o con una muestra que tiene una señal FFT baja también puede dificultar el cálculo de una buena puntuación de enfoque. Para mitigar estas dificultades, el software MVS contiene una serie de algoritmos adicionales que pueden ser seleccionados por el usuario para calcular la puntuación de enfoque si la configuración predeterminada no es adecuada para la muestra. Estos deben ser probados y aplicados caso por caso para determinar los mejores algoritmos para un experimento dado.
Los cambios morfológicos en la estructura de la muestra a lo largo del tiempo se tienen en cuenta utilizando un factor de transformación de plantilla. Este filtro es ajustable por el operador, de modo que los algoritmos de registro tienen en cuenta los cambios morfológicos a lo largo del tiempo. Además, el software monitorea la imagen continua, la configuración del microscopio y la configuración de la cámara o el detector para actualizar automáticamente la plantilla cuando se activa por cambios en la estructura de la muestra y después de cualquier cambio inducido por el operador en los parámetros del microscopio, la cámara o el detector. Como se muestra en la Figura 4, Figura 5, Archivo Suplementario 7 y Archivo Suplementario 8, el software MVS proporciona una estabilización efectiva e inmediata, lo que permite obtener imágenes de alta resolución de muestras que se mueven o cambian dinámicamente. Aunque el software es capaz de controlar tasas muy altas de deriva o movimiento de muestra, como las que ocurren al aplicar una rampa de calentamiento durante un experimento in situ, existen limitaciones a las correcciones máximas de etapa o cambios de haz que el software puede controlar si la muestra se mueve o se desplaza muy rápidamente. Este límite es una función de la tasa de actualización de la imagen, el tamaño del campo de visión y la velocidad de deriva. Para un campo de visión dado y la tasa de actualización de la imagen, hay una tasa de deriva máxima que se puede corregir, y si los movimientos físicos no pueden seguir el ritmo, entonces el proceso puede terminar o volverse inestable. A partir de las plantillas de registro generadas cuando se aplican características como Drift Correct, se pueden generar metadatos calculados adicionales. Por ejemplo, la correlación de coincidencias es un registro numérico del grado de cambio entre plantillas en una serie y se utiliza para identificar puntos en una línea de tiempo experimental en la que cambió la muestra. Un valor de correlación de coincidencia alto corresponde a una muestra que ha sufrido cambios en su morfología, y un valor de correlación de coincidencia baja corresponde a una muestra cuya estructura permanece relativamente estática. La correlación de coincidencias es particularmente valiosa para los estudios in situ, ya que se puede trazar gráficamente, lo que permite al usuario identificar rápidamente las imágenes de la serie correspondientes a un cambio significativo en la muestra. Sin embargo, es importante comprender que los valores de correlaciones de coincidencia alta también pueden corresponder a cambios en las condiciones de imagen, como mover el escenario o cambiar el aumento, si estas acciones se realizan mientras la función de corrección de deriva permanece activa.
El flujo de trabajo de calibración presentado aquí utiliza un soporte de calibración único y una rutina de calibración semiautomática para calibrar con precisión el haz en una variedad de condiciones de lente con una intervención mínima del operador. Se accede a la rutina de calibración de dosis a través del software MVS instalado en el TEM. El software MVS lee automáticamente la configuración del microscopio relevante para guardar todas las mediciones como referencia para experimentos posteriores. En algunos TEM, no es posible leer los ajustes de apertura o monocromador, y el operador debe introducirlos en los ajustes del software MVS durante las calibraciones y durante el uso. Hay recordatorios integrados en el software para ayudar a mantener actualizada esta configuración de entrada del operador siguiendo las instrucciones del programa. El desarrollo de un soporte con un colector de corriente incorporado, en lugar de depender de uno integrado en otra parte de la columna del microscopio, es una elección de diseño deliberada. Esto permite que el colector de corriente se coloque en el mismo plano que una muestra, eliminando errores en la medición de corriente causados por la desviación del haz o diferencias en la absorción de electrones por aberturas en diferentes posiciones del haz. El software MVS sigue una rutina automatizada para medir la corriente del haz y el área para cualquier combinación de condiciones de lente. El software puede correlacionar estas calibraciones medidas con la cámara o la corriente de la pantalla y extrapolar cualquier cambio en la ampliación, etc. al área del haz durante el experimento. Una vez generados, estos archivos de calibración se pueden utilizar inmediatamente y se guardan automáticamente para su uso posterior si el software detecta la misma configuración que se utiliza durante una sesión futura. Aunque la longevidad del archivo de calibración varía de un microscopio a otro, los autores han descubierto que pueden usar los mismos archivos de calibración durante varios meses sin observar cambios sustanciales en los valores actuales. Hay rutinas incorporadas que monitorean el perfil de emisión de las pistolas para ayudar a mantener estas calibraciones relevantes, especialmente en pistolas de emisión FEG frías.
La normalización de las mediciones de dosis entre microscopios y el seguimiento automatizado de la exposición del haz de una muestra son funciones críticas del software MVS, ya que permiten realizar comparaciones cuantitativas de las condiciones de dosis entre experimentos en diferentes sistemas de microscopio. La degradación inducida por la dosis de una muestra de zeolita (ZSM-5), obtenida durante experimentos idénticos utilizando diferentes microscopios, da como resultado la desaparición completa de las manchas FFT después de una dosis máxima acumulada o umbral de electrones (~ 60.000 e-/Å 2 cuando se aplica una tasa de dosis de ~ 500 e-/Å2 ·) para ambas configuraciones. Estos resultados comparativos demuestran que el software de dosis facilita mediciones de dosis cuantitativas reproducibles. La pequeña diferencia en la dosis acumulada a la que se observa la desaparición completa del punto FFT para cada experimento es probablemente el resultado de los diferentes voltajes de aceleración empleados por los dos microscopios, con voltajes de aceleración más bajos que resultan en más vías de daño por radiación y voltajes de aceleración más altos que generalmente resultan en más daños en cadena24. Los resultados de la literatura para la dosis crítica de nanopartículas ZSM-5 varían de 9.000 a 14.000 e-/Å2 utilizando las primeras desapariciones de puntos FFT, en lugar de la desaparición completa de todos los puntos FFT25,26. En nuestros resultados, la primera desaparición del punto FFT corresponde a una dosis acumulada de alrededor de 25.000 e-/Å2. Estudios anteriores se basaron en mediciones de corriente obtenidas utilizando una pantalla de fósforo, que está bien documentada para subestimar las mediciones de corriente del haz en comparación con una taza de Faraday15. La dosis crítica determinada puede variar en un factor de dos o más, dependiendo del pico de FFT que se utilice para rastrear la dosis. Esto indica que las frecuencias espaciales más altas se degradan primero, y pueden dar lugar a diferentes valores dependiendo de la zona de acceso utilizada durante las mediciones (nuestros resultados se centraron en los puntos FFT de todo el cristal de zeolita, en lugar de características estructurales específicas)25,26. Estas diferencias en las técnicas y la calibración actual explican la diferencia en los valores entre los dos experimentos informados en nuestros resultados y estudios previos de la literatura.
Aunque las interacciones de la dosis de electrones son un factor significativo en muchos experimentos TEM, los estudios in situ y específicamente los estudios de EM líquido son particularmente sensibles a sus efectos. La radiólisis de líquidos por el haz de electrones da como resultado una cascada de especies químicamente reactivas que pueden interactuar con la muestra, complicando el análisis. Tanto la tasa de dosis o fluencia utilizada durante un experimento de EM líquido como la dosis acumulada pueden influir en la concentración de especies radicales generadas debido a la radiólisis líquida27,28. Por lo tanto, la recopilación y el registro de metadatos de dosis acumulada y tasa de dosis a lo largo de un experimento permite la correlación directa entre las imágenes y el historial de dosis de una muestra, y es una forma más precisa de dilucidar y controlar el impacto del haz de electrones en estos experimentos. Aunque no está cubierto en este protocolo, en la Figura 6 se muestra un ejemplo de la utilidad de las características de gestión de dosis para EM líquido.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65446/65446fig06.jpg"> Figura 6: Crecimiento inducido por haz de nanopartículas de oro durante un experimento EM líquido in situ. (A) Descripción general de STEM de bajo aumento del crecimiento de partículas resultante con una superposición de color del mapa de dosis acumulativas en toda la región. Las áreas rojas en la superposición indican regiones de alta exposición a dosis acumuladas y las áreas amarillas indican regiones de menor exposición. Resaltar un píxel individual con el cursor o dibujar un cuadro sobre un área utilizando las herramientas de dibujo incluidas indica la dosis acumulada para ese píxel o área. La barra de escala es de 2 μm. (B,C) Imágenes STEM de mayor aumento de las áreas indicadas por los cuadros naranjas (b,c) en A. El área b, expuesta a una dosis acumulada más alta (10.811 e-/Å 2) contiene partículas más grandes que las encontradas en el área c, que fue expuesta a una dosis acumulativa más baja (0.032 e-/Å2). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65446/65446fig06large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
La tasa de dosis enriquecida y los metadatos de dosis acumulativas simplifican el análisis de las vías de crecimiento y degradación de nanomateriales dependientes de la dosis. La Figura 6 muestra la reducción inducida por haz de una solución de iones de cloruro áurico de oro (HAuCl3) en agua durante experimentos de EM líquido. A partir de la superposición del mapa de dosis de color en la Figura 6A, es fácil visualizar que la dosis acumulada de electrones influye en el tamaño y la forma resultantes de las nanopartículas 29,30,31,32. La descripción general de STEM de bajo aumento muestra regiones expuestas a una dosis acumulativa alta (roja) y baja (amarilla). Las partículas en la región expuesta a dosis más altas son más grandes que las de las regiones expuestas a dosis acumulativas más bajas. Debido a que los metadatos de dosis están directamente incrustados en cada imagen a nivel de píxel, los efectos complejos de la dosis de electrones en experimentos de EM líquido ahora se pueden analizar sistemáticamente de una manera que nunca antes se había logrado.
En este protocolo, hemos demostrado que el software MVS proporciona una solución integral para calibrar, monitorear y rastrear tanto la dosis de electrones como la dosis total entregada a una muestra píxel por píxel. Esta capacidad desbloquea un nuevo paradigma para obtener imágenes de muestras sensibles a la dosis y comprender las interacciones del haz de electrones. Es particularmente emocionante para los experimentos de EM líquido, ya que permitirá un interrogatorio más efectivo sobre el papel que desempeña la dosis de electrones y mejorará la reproducibilidad experimental. Esperamos que este nuevo marco permita la recopilación precisa de la tasa de dosis y la información de dosis acumulada, facilite el intercambio de estos datos con la comunidad para una interpretación más precisa de los resultados de TEM y avance en la colaboración científica y el intercambio de datos al permitir la presentación de informes y análisis principales de FAIR.

Los microscopios electrónicos de transmisión (TEM) y sus capacidades se han beneficiado enormemente de los avances en cámaras, detectores, portamuestras y tecnologías informáticas. Sin embargo, estos avances se ven obstaculizados por flujos de datos desconectados, limitaciones de la operación humana y análisis de datos engorrosos 1,2. Además, los experimentos in situ y operativos adaptan los TEM en laboratorios a nanoescala en tiempo real, lo que permite estudiar muestras en ambientes gaseosos o líquidos al tiempo que aplica una gama de estímulos externos 3,4,5. La adopción de flujos de trabajo tan complejos solo ha magnificado estas limitaciones, y el aumento resultante del tamaño y la complejidad de estos flujos de datos es un área de creciente preocupación. Por lo tanto, hay un énfasis creciente en la utilización de la accionabilidad de la máquina para encontrar, acceder, interoperar y reutilizar datos, una práctica conocida como los principios FAIR6. La publicación de datos de investigación de acuerdo con el concepto de principios FAIR ha recibido una atención favorable de las agencias gubernamentales de todo el mundo7,8, y la aplicación de los principios FAIR utilizando software de visión artificial es un paso clave en su adopción.
Se ha desarrollado una plataforma de software de sincronización de visión artificial (MVS) en respuesta a los puntos débiles específicos inherentes a la realización y análisis de experimentos TEM complejos y con muchos metadatos (particularmente experimentos in situ y operativos)9. Una vez instalado en el TEM, el software MVS se conecta, integra y se comunica con la columna del microscopio, los detectores y los sistemas integrados in situ . Esto le permite recopilar continuamente imágenes y alinearlas con sus metadatos experimentales, formando una base de datos de búsqueda completa, una línea de tiempo del experimento de principio a fin (Figura 1). Esta conectividad permite que el software MVS aplique algoritmos que rastrean y estabilizan inteligentemente una región de interés (ROI), incluso cuando las muestras están experimentando cambios morfológicos. El software aplica ajustes a la etapa, el haz y las correcciones digitales según sea necesario para estabilizar el ROI a través de sus funciones de Control de Deriva y Asistencia de Enfoque . Además de enriquecer las imágenes con los metadatos en bruto producidos a partir de los diferentes sistemas experimentales, el software puede producir nuevos metadatos computacionales utilizando algoritmos de análisis de imágenes para calcular variables entre imágenes, lo que le permite corregir automáticamente la desviación de la muestra o los cambios de enfoque.
Las imágenes TEM, y sus metadatos asociados recopilados a través del software MVS, se organizan como una línea de tiempo experimental que puede ser abierta y vista por cualquier persona a través de la versión gratuita y fuera de línea del software de análisis, Studio (en adelante, el software de análisis)10. Durante un experimento, el software MVS sincroniza y registra tres tipos de imágenes de la cámara o detector del microscopio, que se muestran en la parte superior de la línea de tiempo debajo del visor de imágenes: adquisición única (imágenes individuales de adquisición única adquiridas directamente del software TEM), raw (imágenes de la transmisión en vivo del detector / cámara que no han tenido ninguna corrección de deriva digital aplicada; estas imágenes pueden haber sido corregidas físicamente a través de movimiento de la etapa o desplazamiento del haz) y deriva corregida (imágenes de la transmisión en vivo del detector / cámara que se han desplazado digitalmente). Los datos recopilados durante un experimento o sesión se pueden refinar aún más en secciones más pequeñas o fragmentos de datos, conocidos como colecciones, sin pérdida de metadatos incrustados. Desde el software de análisis, las imágenes, las pilas de imágenes y los metadatos se pueden exportar directamente a una variedad de imágenes de formato abierto y tipos de hojas de cálculo para su análisis utilizando otras herramientas y programas.
El marco de control de microscopio, estabilización e integración de metadatos habilitado por el software MVS también permite la implementación de programas o módulos adicionales de visión artificial, diseñados para aliviar las limitaciones en los flujos de trabajo TEM actuales. Uno de los primeros módulos desarrollados para aprovechar esta plataforma de sincronización es la calibración de la dosis de electrones y el seguimiento espacial de las áreas expuestas al haz dentro de la muestra. Todas las imágenes TEM se forman a partir de la interacción entre la muestra y el haz de electrones. Sin embargo, estas interacciones también pueden resultar en impactos negativos e ineludibles en la muestra, como radiólisis y daños en cadena 11,12, y requieren un equilibrio cuidadoso entre la aplicación de una dosis de electrones lo suficientemente alta para generar la imagen y minimizar el daño resultante del haz 13,14.
Aunque muchos usuarios confían en las mediciones de corriente de pantalla para estimar la dosis de electrones, se ha demostrado que este método subestima ampliamente la corriente real del haz15. Los valores de dosis cualitativos se pueden obtener a través de la corriente de pantalla en el mismo microscopio con los mismos ajustes, pero reproducir estas condiciones de dosis utilizando diferentes microscopios o ajustes es muy subjetivo. Además, cualquier ajuste de parámetro de imagen realizado por el usuario durante el experimento, como el tamaño del punto, la apertura, la ampliación o la intensidad, requiere una medición separada de la corriente de la pantalla para calcular la dosis resultante. Los usuarios deben limitar rigurosamente las condiciones de imagen utilizadas durante un experimento dado o medir y registrar meticulosamente cada condición de lente utilizada, complicando y extendiendo significativamente el experimento más allá de lo que es factible para el funcionamiento normal del microscopio16,17.
Dose, denominado software de dosis para este protocolo, es un módulo de software de calibración de dosis que utiliza un soporte de calibración dedicado diseñado para permitir mediciones de corriente automatizadas. Una copa de Faraday, el estándar de oro para la calibración precisa de la corriente de haz15, está integrada en la punta del soporte de calibración. El software MVS realiza una serie de calibraciones de corriente de haz y área de haz para cada condición de lente e incrusta esos valores en las imágenes a nivel de píxel.
En este artículo de video, los protocolos de software MVS diseñados para mejorar todas las áreas del flujo de trabajo TEM se presentan utilizando muestras representativas de nanomateriales. Se utiliza una muestra de nanopartículas de zeolita sensible al haz14 para demostrar los flujos de trabajo de calibración y gestión de dosis. Realizamos un experimento de calentamiento in situ representativo utilizando una muestra de nanocatalizador Au/FeOx 18,19 que sufre cambios morfológicos significativos cuando se calienta. Este experimento in situ destaca los algoritmos de estabilización del software y su capacidad para recopilar múltiples flujos de metadatos, lo cual es un desafío inherente para los estudios in situ y operativos. Aunque no se describe en el protocolo, debido a su sensibilidad única a la dosis de electrones, discutimos ejemplos representativos de la utilidad del software para estudios de EM líquido (protocolos para los cuales se han informado previamente en la literatura20,21,22), y cómo estas técnicas se pueden aplicar para mejorar la comprensión del efecto de la dosis en experimentos de EM líquido. Finalmente, mostramos cómo se agiliza el análisis de datos utilizando el software de análisis fuera de línea para visualizar, filtrar y exportar una variedad de archivos de imagen, video y datos a otros formatos accesibles.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65446/65446fig01.jpg"> Figura 1: Ejemplos de interfaz de usuario para MVS y software de análisis. (A) El panel de visualización de imágenes del software de sincronización y el panel de control. Se establece una conexión entre el TEM y el software de sincronización activando el botón Conectar, que transmite las imágenes y los metadatos del microscopio al software de sincronización. Desde el visor de imágenes, el operador puede realizar una variedad de operaciones asistidas por visión artificial, como Drift Correct y Focus Assist. También proporciona la capacidad de aplicar imágenes de etiquetas y sesión de revisión sin interrumpir la recopilación de datos. (B) Captura de pantalla del software de análisis de imágenes que resalta la ubicación del puerto de vista de imagen, la línea de tiempo y el panel Metadatos y análisis. Se puede acceder al software de análisis en cualquier momento durante un experimento para revisar las imágenes adquiridas hasta ese momento utilizando el botón Revisar sesión. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65446/65446fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>ARM200F CFEG</td>
			<td>JEOL</td>
			<td></td>
			<td>Transmission Electron Microscope (200 kV)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AXON DOSE Calibration Holder</td>
			<td>Protochips, Inc.</td>
			<td>AXA-FC-TFS</td>
			<td>Dose calibration and management hardware package for ThermoFisher ScientificTEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AXON DOSE Software:&#160; Version 10.6.5.3</td>
			<td>Protochips, Inc.</td>
			<td>AX-MOD-DOSE-01-1YR</td>
			<td>Dose calibration and management software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AXON Studio Software: Version 10.6.5.3</td>
			<td>Protochips, Inc.</td>
			<td>No Part Number. 
			Available to download at&#160; success.protochips.com</td>
			<td>Offline analysis software for AXON datasets.&#160; A free copy of the AXON Studio software is available for down load at:&#160; success.protochips.com</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AXON Synchronicity Core</td>
			<td>Protochips, Inc.</td>
			<td>AXON-CORE</td>
			<td>Hardware component of the synchronization software.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AXON Synchronicity Software:&#160; Version 10.6.5.3</td>
			<td>Protochips, Inc.</td>
			<td>AX-MOD-SYNCPRO-01-1YR</td>
			<td>Synchronization software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fusion In-Situ Heating E-chip</td>
			<td>Protochips, Inc.</td>
			<td>E-FHDC-VO-10</td>
			<td>Sample Support E-chip with carbon film.&#160; Used with in situ heating system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fusion Select In Situ Heating System</td>
			<td>Protochips, Inc.</td>
			<td>FFAD-6200-EXP</td>
			<td>In-situ MEMs heating system for ThermoFisher Scientific TEM.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gold(III) chloride (50% gold basis) hydrate 50790</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>27988-77-8</td>
			<td>Used to prepare Au/FeOx nanocatalyst.&#160; Coprecipitation synthesis procedure followed in C. Sze et al. Materials Letters. 36 (1&#8211;4), 11&#8211;16 (1998)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iron (III) Oxide 310050 (Fe2O3)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>1309-37-1</td>
			<td>Used to prepare Au/FeOx nanocatalyst.&#160; Coprecipitation synthesis procedure followed in C. Sze et al. Materials Letters. 36 (1&#8211;4), 11&#8211;16 (1998)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Titan ChemiSTEM</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Transmission Electron Microscope (300 kV)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeolite ZSM-5</td>
			<td>Zeolyst</td>
			<td>CBV 8014</td>
			<td>&#160;Nanocatalyst sample:&#160; 80 SiO2/Al2O3 Mole Ratio</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a machine-vision approach to transmission electron microscopy workflows, results analysis and data management

La microscopía electrónica de transmisión (TEM) permite a los usuarios estudiar materiales a su escala atómica fundamental. Los experimentos complejos generan rutinariamente miles de imágenes con numerosos parámetros que requieren un análisis complicado y que requiere mucho tiempo. AXON synchronicity es una solución de software de sincronización de visión artificial (MVS) diseñada para abordar los puntos débiles inherentes a los estudios TEM. Una vez instalado en el microscopio, permite la sincronización continua de imágenes y metadatos generados por el microscopio, el detector y los sistemas in situ durante un experimento. Esta conectividad permite la aplicación de algoritmos de visión artificial que aplican una combinación de correcciones espaciales, de haz y digitales para centrar y rastrear una región de interés dentro del campo de visión y proporcionar estabilización de imagen inmediata. Además de la mejora sustancial en la resolución que ofrece dicha estabilización, la sincronización de metadatos permite la aplicación de algoritmos computacionales y de análisis de imágenes que calculan variables entre imágenes. Estos metadatos calculados se pueden utilizar para analizar tendencias o identificar áreas clave de interés dentro de un conjunto de datos, lo que lleva a nuevos conocimientos y al desarrollo de capacidades de visión artificial más sofisticadas en el futuro. Uno de estos módulos que se basa en estos metadatos calculados es la calibración y gestión de dosis. El módulo de dosis proporciona calibración, seguimiento y gestión de vanguardia tanto de la fluencia de electrones (e-/Å 2·s-1) como de la dosis acumulada (e-/Å2) que se administra a áreas específicas de la muestra píxel por píxel. Esto permite una visión general completa de la interacción entre el haz de electrones y la muestra. El análisis de experimentos se simplifica a través de un software de análisis dedicado en el que los conjuntos de datos que consisten en imágenes y metadatos correspondientes se visualizan, ordenan, filtran y exportan fácilmente. Combinadas, estas herramientas facilitan colaboraciones eficientes y análisis experimentales, fomentan la minería de datos y mejoran la experiencia de microscopía.

Transmission electron microscopes (TEMs) and their capabilities have benefited enormously from advances in cameras, detectors, sample holders, and computing technologies. However, these advances are hampered by disconnected data streams, limitations of human operation, and cumbersome data analysis1,2. Moreover, in situ and operando experiments adapt TEMs into real-time nanoscale laboratories, enabling samples to be studied in gas or liquid environments while simultaneously applying a range of external stimuli3,4,5. The adoption of such complex workflows have only magnified these limitations, and the resulting increase of the size and complexity of these data streams is an area of growing concern. Thus, there is a growing emphasis on utilizing machine-actionability to find, access, interoperate, and reuse data, a practice known as the FAIR principles6. Publishing research data in accordance with the FAIR principles concept has received favorable attention from governmental agencies around the world7,8, and application of the FAIR principles using machine-vision software is a key step in their adoption.
A machine-vision synchronization (MVS) software platform has been developed in response to the specific pain points inherent to performing and analyzing complex, metadata-heavy TEM experiments (particularly in situ and operando experiments)9. Once installed on the TEM, the MVS software connects, integrates, and communicates with the microscope column, detectors, and integrated in situ systems. This enables it to continuously collect images and align those images with their experimental metadata, forming a comprehensive searchable database, a timeline of the experiment from start to finish (Figure 1). This connectivity allows the MVS software to apply algorithms that intelligently track and stabilize a region of interest (ROI), even when samples are undergoing morphological changes. The software applies adjustments to stage, beam, and digital corrections as necessary to stabilize the ROI through its Drift Control and Focus Assist functions. In addition to enriching the images with the raw metadata produced from the different experimental systems, the software can produce new, computational metadata using image analysis algorithms to calculate variables between images, which allow it to automatically correct for sample drift or changes in focus.
TEM images, and their associated metadata collected through the MVS software, are organized as an experimental timeline which can be opened and viewed by anyone via the free, offline version of the analysis software, Studio (hereafter referred to as the analysis software)10. During an experiment, the MVS software syncs and records three types of images from the microscope&#39;s camera or detector, which are displayed at the top of the timeline below the image viewer: single acquisition (individual single aquisition images acquired directly from the TEM software), raw&#160;(images from the detector/camera live stream that have not had any digital drift corrections applied; these images may have been physically corrected via stage movement or beam shift), and drift corrected (images from the detector/camera live stream that have been digitally drift). Data collected during an experiment or session can be further refined into smaller sections or snippets of data, known as collections, with no loss of embedded metadata. From the analysis software, images, image stacks, and metadata can be directly exported into a variety of open format images and spreadsheet types for analysis using other tools and programs.
The framework of microscope control, stabilization, and metadata integration enabled by the MVS software also allows the implementation of additional machine-vision programs or modules, designed to alleviate limitations in current TEM workflows. One of the first modules developed to take advantage of this synchronization platform is electron dose calibration and spatial tracking of beam exposed areas within the sample. All TEM images are formed from the interaction between the sample and the electron beam. However, these interactions can also result in negative, inescapable impacts on the sample, such as radiolysis and knock-on damage11,12, and require a careful balance between applying a high enough electron dose to generate the image and minimizing the resulting beam damage13,14.
Although many users rely on screen current measurements to estimate the electron dose, this method has been shown to widely underestimate the actual beam current15. Qualitative dose values can be obtained via the screen current on the same microscope with the same settings, but reproducing these dose conditions using different microscopes or settings is highly subjective. Additionally, any imaging parameter adjustments made by the user during the experiment, such as spot size, aperture, magnification, or intensity, require a separate measurement of the screen current to calculate the resulting dose. Users must either rigorously limit the imaging conditions used during a given experiment or meticulously measure and record each lens condition used, significantly complicating and extending the experiment beyond what is feasible for normal operation of the microscope16,17.
Dose, referred to as dose software for this protocol, is a dose calibration software module that utilizes a dedicated calibration holder designed to enable automated current measurements. A Faraday cup, the gold standard for accurate beam current calibration15, is integrated into the tip of the calibration holder. The MVS software performs a series of beam current and beam area calibrations for each lens condition and embeds those values on the images at the pixel level.
In this video article, MVS software protocols designed to enhance all areas of the TEM workflow are presented using representative nanomaterial samples. A beam sensitive zeolite nanoparticle sample14 is used to demonstrate the calibration and dose management workflows. We perform a representative in situ heating experiment using an Au/FeOx nanocatalyst18,19 sample that undergoes significant morphological changes when heated. This in situ experiment highlights the software&#39;s stabilization algorithms and its ability to collate multiple streams of metadata, which is an inherent challenge for in situ and operando studies. Although not described in the protocol, because of its unique electron dose sensitivity, we discuss representative examples of the software&#39;s utility for liquid-EM studies (protocols for which have been previously reported in the literature20,21,22), and how these techniques can be applied to improve the understanding of the effect of dose on liquid-EM experiments. Finally, we show how data analysis is streamlined using the offline analysis software to visualize, filter, and export a variety of image, video, and data files into other accessible formats.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65446/65446fig01.jpg" /> 
Figure 1: User interface examples for MVS and analysis software. (A) The synchronization software image viewing pane and control panel. A connection between the TEM and the synchronization software is established by activating the Connect button, which streams the images and metadata from the microscope into the synchronization software. From the image viewer, the operator can perform a variety of machine-vision assisted operations, such as Drift Correct and Focus Assist. It also provides the ability to apply Tag Images and Review Session without disrupting data collection. (B) Screenshot of the image analysis software highlighting the location of the Image View Port, Timeline, and the Metadata and Analysis panel. The analysis software can be accessed at any point during an experiment to review the images acquired up to that time point using the Review Session button. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65446/65446fig01large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>

Autor destacado: Un enfoque de visión artificial para los flujos de trabajo de microscopía electrónica de transmisión, el análisis de resultados y la gestión de datos  

Un enfoque de visión artificial para flujos de trabajo de microscopía electrónica de transmisión, análisis de resultados y gestión de datos

This technology was developed to make high-performance TEM studies accessible to users of all skill levels. Furthermore, scientific advancements require the collaborative efforts of multiple investigators, so an efficient platform to share and analyze large, complex data sets is essential for successful research Operando and in situ studies transform a TEM into a real-time nanolaboratory, allowing researchers to explore the dynamic nano-scale processes that control materials'growth properties. One of the greatest challenges for in-situ TEM studies is isolating the beam irradiation effects from the intrinsic behavior of the sample.Accurate electron dose measurement and tracking is essential, but without dose management software, one can only measure electron dose rate rather than the total or critical dose Complex TEM workflows generate large data sets which must be manually aligned and indexed to their respective images. In this time-consuming process, the key information, such as adjustments to imaging conditions or samples environment, may be lost, complicating analysis and reproducibility. We have developed a machine-vision workflow to collect and index the images and metadata produced during an experiment into a data-enriched, searchable timeline.Computational and image analysis algorithms can calculate variables between images, apply corrections, and identify hidden trends. By calculating, synchronizing, and indexing new metadata into each image, multimodal analysis is suddenly a new possibility. For example, accurate accumulated dose and dose rate information in the zeolite images allows quantitative assessment of sample damage across thousands of images.We will continue to push the capabilities of in-situ TEM by making results accessible and interpretable and improving experimental reproducibility. This software is a platform to develop workflow-driven modules that target specific, historically difficult applications to make in-situ TEM experiments easier and more information rich.

Este trabajo destaca la utilidad de la adquisición de datos utilizando el software MVS para imágenes TEM y experimentos in situ. La alineación del microscopio y la configuración de la condición se realizaron y seleccionaron a través de los controles predeterminados del fabricante TEM. Después de la configuración inicial, los protocolos presentados en este artículo de video se llevaron a cabo a través del software MVS. Se utilizó un TEM de 300 kV para todos los experimentos presentados en el protocolo de video y datos representativos, excepto para los datos de zeolita de comparación que se adquirieron utilizando un FEG frío de 200 kV (Figura 3D-F y Tabla 1). Todos los metadatos fueron recopilados y alineados a sus respectivas imágenes automáticamente por el software MVS.
Después de iniciar el software y seleccionar el flujo de trabajo apropiado en el menú, se establece una conexión con el microscopio activando el botón Conectar en la barra de herramientas en el extremo izquierdo del visor de imágenes, como se muestra en la Figura 1A. Cuando se resalta el botón Conectar , las imágenes y los metadatos asociados del microscopio se transmiten automáticamente al software MVS y aparecen en el panel de vista de imagen. Estas imágenes y sus metadatos asociados se guardan cronológicamente en una línea de tiempo que se puede abrir, revisar y analizar sin interrumpir el registro de nuevos datos en la línea de tiempo (Figura 1B). El usuario puede interrumpir la transmisión en cualquier momento desactivando el icono Conectar .
Una vez que se activa la conexión, se puede acceder a otros flujos de trabajo que dependen del marco de software MVS. En los ejemplos que se muestran en este protocolo de video, se debe realizar una calibración de dosis antes de utilizar las otras funciones del software MVS. La calibración de dosis es un proceso automatizado controlado por el software MVS; utiliza un soporte de calibración de dosis de taza de Faraday dedicado para medir la corriente y el área del haz para la combinación de parámetros. El soporte de calibración de la copa de Faraday, que se muestra en la Figura 2, se conecta a un picoamperímetro externo, que mide con precisión la corriente del haz. Una vez insertado en el microscopio, el orificio de alineación fiducial se centra y las condiciones de haz deseadas para calibrar (tamaños de punto, aperturas y aumentos) se ingresan en el software. El software realiza una serie de pasos de calibración para cada combinación de las condiciones seleccionadas. Durante la calibración de la dosis, el soporte se mueve automáticamente entre la copa colectora de corriente de Faraday integrada y el orificio pasante. La medición de corriente para cada combinación de condiciones de lente se mide en la copa de Faraday por el picoamperímetro. Luego, el software traduce la etapa para centrar el haz en el orificio pasante y el área del haz se determina a través de algoritmos de visión artificial. Esta serie de mediciones construye un perfil de la relación entre la intensidad/brillo y el área del haz. Esto permite que el software extrapolar el área del haz a medida que se ajusta el ajuste de intensidad / brillo durante un experimento, independientemente del campo de visión. Los valores de dosis acumulada y tasa de dosis se calculan utilizando estas mediciones de corriente de haz y área de haz y se genera un archivo de calibración de dosis. Este proceso esencialmente define una "huella digital" de dosis para el TEM y sus condiciones individuales de la lente. Una vez calibrada la dosis para el TEM, el usuario puede operar normalmente y ajustar libremente el aumento y la intensidad sin pérdida de información sobre la dosis o toma de notas manual17. Una vez completada la calibración, se retira el soporte de calibración de dosis, lo que permite insertar la muestra como de costumbre. El proceso de calibración para los modos TEM y STEM normalmente toma menos de 10 minutos.
Después de calibrar las condiciones de dosis, se obtuvo una imagen de una muestra de nanopartículas de zeolita (ZSM-5) comprada comercialmente en condiciones de alta tasa de dosis para determinar la dosis umbral (acumulativa) a la que la muestra está demasiado dañada para proporcionar información estructural. Las nanopartículas ZSM-5 se suspendieron en etanol y se fundieron en una rejilla TEM de cobre convencional. Se obtuvieron imágenes continuamente a 300 kV en modo TEM utilizando un tamaño de punto de 3 y una apertura de condensador de 100 μm. La tasa de dosis leída por el software MVS en condiciones de alta tasa de dosis fue de 519 e-/Å2·s. Las nanopartículas en el campo de visión se visualizaron continuamente hasta que los picos en el FFT desaparecieron, lo que indica la degradación de la estructura cristalina, como se muestra en la Figura 3A-C y el Archivo Suplementario 3. Se aplicaron superposiciones (que se pueden agregar durante un experimento en vivo o después en el software de análisis) a las imágenes TEM para mostrar la fecha y la hora, la tasa de dosis, la dosis máxima (acumulativa) y la ampliación. La tasa de dosis se mantuvo constante durante los experimentos, con la dosis acumulada (dosis máxima) aumentando en función del tiempo. Los picos de FFT comenzaron a desaparecer después de 42 s de imágenes continuas (Figura 3B). A 1 min y 20 s y una dosis acumulada de ~60.000 e-/Å2, los picos FFT habían desaparecido por completo (Figura 3C).
Para demostrar que este método de calibración genera mediciones cuantitativas de dosis que se pueden aplicar a otros microscopios que operan bajo diferentes entornos, se realizó el mismo proceso de calibración y experimento de degradación de zeolita utilizando una pistola de emisión de campo frío (FEG) TEM de 200 kV y un tamaño de punto de 1. Este microscopio se calibró utilizando el mismo procedimiento descrito en el Método 1, y el mismo experimento descrito en el Método 2 se realizó utilizando los nuevos ajustes de tamaño de punto y apertura. Los ajustes del haz se ajustaron para que la diferencia en la tasa de dosis aplicada entre los dos experimentos fuera insignificante (499 e-/Å 2·s vs. 519 e-/Å2·s). Como se muestra en la Figura 3D-F y se resume en la Tabla 1, las manchas FFT desaparecen completamente después de 1 min y 50 s de imagen continua y una dosis acumulada de 58,230 e-/Å2, que se alinea con los valores obtenidos en el primer experimento.
Un ejemplo de cómo el software MVS puede beneficiarse de los experimentos in situ se mostró mediante la realización de un experimento de calentamiento. Una muestra representativa de nanocatalizador, Au/FeOx (sintetizada siguiendo un procedimiento publicado19), fue seleccionada como sistema de ejemplo porque sufre cambios morfológicos y estructurales dinámicos a altas temperaturas. Esta movilidad inducida por la temperatura hace que sea difícil mantener el ROI centrado dentro del campo de visión debido al propio movimiento de la muestra y la expansión térmica del propio soporte de la muestra durante los cambios de temperatura18. Con las funciones Drift Correct y Focus Assist habilitadas, se obtuvo una imagen de la muestra durante un período de ~30 s a 800 °C. A temperaturas elevadas, las nanopartículas de oro dentro del Au/FeOx migraron a lo largo de la superficie del soporte de óxido de hierro y se sinterizaron para formar partículas más grandes, como se muestra en la Figura 4 y como una película en el Archivo Suplementario 7. La Figura 5 muestra una serie de instantáneas TEM (Figura 5A-F) de una región porosa dentro de un nanocatalizadorAu/FeO x, registradas en varios puntos de tiempo (Figura 5G) durante un experimento de calentamiento in situ. El software calculó automáticamente el valor de deriva coordinada del ROI. Los valores coordinados de deriva y temperatura de las imágenes a lo largo de la serie se muestran gráficamente en la Figura 5G. Como era de esperar, la deriva coordinada de la muestra aumenta a medida que aumenta el perfil de temperatura, de una velocidad de ~ 9 nm / min a ~ 62 nm / min, y comienza a disminuir hacia la nivelación a medida que la temperatura se mantiene constante. A pesar de esta alta tasa de deriva y los cambios en la morfología de la muestra, las imágenes de alta resolución se obtienen fácilmente durante el aumento de la temperatura, revelando movimiento dentro de la región porosa, como se muestra en el Archivo Suplementario 8. Consulte el Archivo complementario 9 para obtener instrucciones de descarga y especificaciones informáticas.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65446/65446fig02.jpg"> Figura 2: Calibración y seguimiento de la dosis de electrones . (A) La dosis se calibra utilizando un soporte de muestra dedicado que contiene un colector de corriente colocado en el plano de muestra para mediciones de corriente de haz. (B) Ilustración de las características del diseño de la punta: Izquierda: taza de Faraday; Medio: agujero fiduciario; Derecha: orificio pasante (C). La dosis de electrones aplicada se puede visualizar en el software utilizando mapas codificados por colores para denotar diferentes exposiciones de dosis dentro de una imagen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65446/65446fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65446/65446fig03.jpg"> Figura 3: Degradación inducida por dosis de electrones de nanopartículas de zeolita (ZSM-5). (A-C) Instantáneas tomadas durante un período de 1 min y 20 s que muestran los datos de degradación obtenidos con un FEG de 300 kV y una tasa de dosis medida de 519 e-/Å2·s; la zeolita se degrada en 1 min y 20 s. (D-E) Instantáneas tomadas durante un período de 1 min y 50 s que muestran datos de degradación obtenidos con un TEM FEG frío de 200 kV y una tasa de dosis de electrones de 499 e-/Å2·s; los recuadros muestran que el punto FFT se desvanece con el tiempo. La barra de escala es de 60 nm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65446/65446fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65446/65446fig04.jpg"> Figura 4: La sincronicidad AXON aplica algoritmos de visión artificial para rastrear y estabilizar muestras en evolución dinámica. Los metadatos generados durante el experimento se pueden trazar a lo largo de la línea de tiempo, lo que permite al usuario emparejar rápidamente una imagen con sus metadatos asociados a medida que se desplaza por la serie de imágenes generada durante el experimento. (A-H) Imágenes de una muestra de nanocatalizador (Au/FeOx) a 800 °C registradas durante un período de 28 s con (A-D) y sin (E-H) la superposición del mapa de dosis. Las áreas rojas en la superposición indican regiones de alta exposición a dosis acumuladas, y las áreas amarillas indican regiones de menor exposición. El resaltado de un píxel individual indica la dosis acumulada para ese píxel. Las flechas blancas en los paneles E-H indican dos partículas que se fusionan durante el experimento, y la flecha naranja indica la trayectoria de una partícula de oro en movimiento. (I) La línea de tiempo del experimento generada por el software de análisis para la serie de imágenes que se muestra en A-H. Los puntos naranjas en la parte superior de la línea de tiempo denotan imágenes sin procesar (no corregidas digitalmente) y los puntos azules denotan imágenes corregidas por deriva. Las barras verticales naranjas indican los puntos en la línea de tiempo correspondientes a las imágenes que se muestran en los paneles A-H. La barra de escala es de 40 nm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65446/65446fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65446/65446fig05.jpg"> Figura 5: Instantáneas TEM de una región porosa dentro de un nanocatalizador Au/FeOx en varios puntos de tiempo. El software MVS estabiliza y centra la muestra incluso durante altas tasas de deriva, como las que ocurren durante una rampa de temperatura mediante la aplicación de la etapa, el desplazamiento del haz y las correcciones digitales, según lo indicado por los algoritmos de visión artificial. (A-F) Instantáneas TEM de una región porosa dentro de un nanocatalizador Au/FeOx, registradas en varios puntos de tiempo (G) durante un experimento de calentamiento in situ. La tasa de deriva del ROI se calcula automáticamente y se registra durante un experimento por el software MVS. Como se muestra en (G), a medida que se cambia el perfil de temperatura (la línea azul), la velocidad de deriva (línea naranja) aumenta a medida que aumenta la temperatura y disminuye a medida que la temperatura se mantiene constante. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65446/65446fig05large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Tipo de microscopio</td>
			<td>300 kV FEG TEM</td>
			<td>200 kV Frío FEG TEM</td>
		</tr><tr><td>Tamaño del punto/Condensador 2 Apertura</td>
			<td>3/100 μm</td>
			<td>1/100 μm</td>
		</tr><tr><td>Tasa de dosis</td>
			<td>519 e-/A2•s1</td>
			<td>499 e-/A2•s1</td>
		</tr><tr><td>Pérdida de estructura medida por FFT (Dosis acumulada)</td>
			<td>60.270 e-/A2 </td>
			<td>58.230 e-/A2 </td>
		</tr></tbody></table>Tabla 1: Comparación resumida de los resultados de degradación de zeolita obtenidos de diferentes microscopios.
Archivo complementario 1: Captura de pantalla de la interfaz del software MVS con la pestaña de administración de dosis abierta. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65446/Supplemental%20File%201%20-%20User%20Interface.pdf" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Archivo complementario 2: Archivo de base de datos de software MVS del experimento de degradación de zeolita inducida por haz. Este software de visualización/análisis está disponible para descargar de forma gratuita. Consulte el Archivo complementario 9 para obtener instrucciones de descarga y especificaciones informáticas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65446/Supplemental_File_2-Data_High_Dose_Zeolite_Degradation_TFS_compressed.zip" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Archivo complementario 3: Película de la degradación de la zeolita inducida por el haz. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65446/Supplemental%20File%203%20-%20Zeolite%20Degradation%20TFS.mp4" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Archivo complementario 4: Archivo CSV 1 (degradación de zeolita: datos sin procesar [solo corrección mecánica]) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65446/Supplemental%20File%204%20-%20Zeolite%20CSV%20Raw.csv" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Archivo complementario 5: Archivo CSV (degradación de zeolita: deriva corregida [corrección mecánica + digital]) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65446/Supplemental%20File%205%20-%20Zeolite%20CSV%20Drift%20Corrected.csv" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Archivo complementario 6: Archivo de base de datos de software MVS nanocatalizador experimento de calentamiento in situ. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65446/Supplemental%20File%206%20-%20AuFeOx%20800C%20Madeline%20Dressel%20Dukes.zip" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Archivo complementario 7: Película del nanocatalizador a 800 °C con superposiciones de dosis. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65446/Supplemental%20File%207%20-%20AuFeOx%20Dose%20Map%20800.mp4" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Archivo complementario 8: Película del nanocatalizador durante una rampa de temperatura con valores de deriva coordinados. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65446/Supplemental%20File%208%20-%20AuFeOx%20Temperature%20Ramp.mp4" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Archivo complementario 9: Instrucciones para descargar el software de análisis gratuito. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65446/Supplemental%20File%209%20-%20Download%20Instructions.pdf" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>

Watch this Scientific Journal Video about A Machine-Vision Approach to Transmission Electron Microscopy Workflows, Results Analysis and Data Management at JoVE.com

Aquí, presentamos un protocolo para utilizar software de visión artificial para estabilizar procesos dinámicos durante las imágenes TEM, mientras indexamos simultáneamente múltiples flujos de metadatos a cada imagen en una línea de tiempo navegable. Demostramos cómo esta plataforma permite la calibración automatizada y el mapeo de la dosis de electrones en el transcurso de un experimento.

Transmission electron microscopy (TEM) enables users to study materials at their fundamental, atomic scale. Complex experiments routinely generate ...

Esta tecnología fue desarrollada para hacer que los estudios TEM de alto rendimiento sean accesibles para usuarios de todos los niveles de habilidad. Además, los avances científicos requieren los esfuerzos de colaboración de múltiples investigadores, por lo que una plataforma eficiente para compartir y analizar conjuntos de datos grandes y complejos es esencial para una investigación exitosa. Los estudios operativos e in situ transforman un TEM en un nanolaboratorio en tiempo real, lo que permite a los investigadores explorar los procesos dinámicos a nanoescala que controlan las propiedades de crecimiento de los materiales. Uno de los mayores desafíos para los estudios TEM in situ es aislar los efectos de la irradiación del haz del comportamiento intrínseco de la muestra.La medición y el seguimiento precisos de la dosis de electrones son esenciales, pero sin un software de gestión de dosis, solo se puede medir la tasa de dosis de electrones en lugar de la dosis total o crítica. Los flujos de trabajo complejos de TEM generan grandes conjuntos de datos que deben alinearse e indexarse manualmente a sus respectivas imágenes. En este proceso que consume mucho tiempo, la información clave, como los ajustes a las condiciones de imagen o al entorno de las muestras, puede perderse, lo que complica el análisis y la reproducibilidad. Hemos desarrollado un flujo de trabajo de visión artificial para recopilar e indexar las imágenes y los metadatos producidos durante un experimento en una línea de tiempo enriquecida con datos y con capacidad de búsqueda.Los algoritmos computacionales y de análisis de imágenes pueden calcular variables entre imágenes, aplicar correcciones e identificar tendencias ocultas. Al calcular, sincronizar e indexar nuevos metadatos en cada imagen, el análisis multimodal es de repente una nueva posibilidad. Por ejemplo, la información precisa de dosis acumulada y tasa de dosis en las imágenes de zeolita permite la evaluación cuantitativa del daño de la muestra en miles de imágenes.Continuaremos impulsando las capacidades de TEM in situ haciendo que los resultados sean accesibles e interpretables y mejorando la reproducibilidad experimental. Este software es una plataforma para desarrollar módulos impulsados por el flujo de trabajo que se dirigen a aplicaciones específicas e históricamente difíciles para hacer que los experimentos TEM in situ sean más fáciles y más ricos en información.

Un enfoque de visión artificial para flujos de trabajo de microscopía electrónica de transmisión, análisis de resultados y gestión de datos

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