בדיקת יחידה להקמת מושבות מיקרו להערכת יעילות חיסונים נגד שחפת

Summary

קביעת יחידות יוצרות מושבות (CFU) היא הטכניקה הסטנדרטית לכימות חיידקים, כולל Mycobacterium tuberculosis אשר יכול לקחת שבועות כדי ליצור מושבות גלויות. כאן אנו מתארים מיקרו-CFU לקביעת CFU עם יעילות זמן מוגברת, שטח מעבדה מופחת ועלות מגיב, ומדרגיות לניסויים בתפוקה בינונית וגבוהה.

Abstract

שחפת, סיבת המוות המובילה בעולם על ידי גורם זיהומי, הרגה 1.6 מיליון בני אדם בשנת 2022, רק עקף על ידי COVID-19 במהלך המגיפה 2019-2021. המחלה נגרמת על ידי החיידק Mycobacterium tuberculosis (M.tb). זן Mycobacterium bovis Bacillus Calmette-Guérin (BCG), החיסון היחיד לשחפת, הוא החיסון המורשה העתיק ביותר בעולם, שעדיין נמצא בשימוש. נכון לעכשיו, ישנם 12 חיסונים בניסויים קליניים ועשרות חיסונים בפיתוח פרה-קליני. שיטת הבחירה המשמשת להערכת היעילות של חיסוני שחפת במחקרים פרה-קליניים היא ספירת מושבות חיידקים על ידי בדיקת יחידות יוצרות מושבה (CFU). בדיקה זו גוזלת זמן רב ואורכת 4 עד 6 שבועות, דורשת שטח מעבדה ואינקובטור משמעותי, יש לה עלויות ריאגנטים גבוהות והיא מועדת לזיהום. כאן אנו מתארים שיטה אופטימלית לספירת מושבות, מיקרו-CFU (mCFU), המציעה פתרון פשוט ומהיר לניתוח תוצאות יעילות החיסון M.tb . בדיקת mCFU דורשת פי עשרה פחות ריאגנטים, מפחיתה את תקופת הדגירה פי שלושה, לוקח שבוע עד שבועיים לסיים, מפחיתה את שטח המעבדה ואת עלות המגיב, וממזערת את סיכוני הבריאות והבטיחות הקשורים לעבודה עם מספר גדול של M.tb. יתר על כן, כדי להעריך את יעילותו של חיסון נגד שחפת, ניתן לקבל דגימות ממגוון מקורות, כולל רקמות מבעלי חיים מחוסנים הנגועים במיקובקטריה. אנו מתארים גם שיטה אופטימלית לייצור תרבית מיקובקטריאלית חד-תאית, אחידה ואיכותית למחקרי זיהום. לבסוף, אנו מציעים לאמץ שיטות אלה באופן אוניברסלי למחקרים פרה-קליניים של קביעת יעילות החיסון, מה שיוביל בסופו של דבר לקיצור זמן בפיתוח חיסונים נגד שחפת.

Introduction

שחפת היא סיבת המוות המובילה בעולם על ידי גורם זיהומי יחיד, חיידק Mycobacterium tuberculosis (M.tb), והורגת יותר אנשים מכל פתוגן אחר. בשנת 2021, שחפת הייתה אחראית ל -1.6 מיליון מקרי מוות ועקפה את COVID-19 במהלך המגיפה 2019-2021¹. יתר על כן, על פי דו"ח השחפת העולמי של ארגון הבריאות העולמי לשנת 2022, מגפת COVID-19 הייתה אחראית לעלייה במקרי שחפת חדשים. ארגון הבריאות העולמי מדווח גם על ירידה גדולה במספר האנשים שאובחנו עם שחפת בתקופה זו, מה שעלול להגדיל עוד יותר את מספר מקרי השחפת¹.

Bacillus Calmette-Guérin (BCG) הוא זן חי מוחלש של Mycobacterium bovis הפתוגני ששימש לראשונה....

Protocol

הערה: הפרוטוקול המתואר כאן מיועד ל-BCG, אך ניתן להחיל אותו על כל מיקובקטריה. BCG יכול לשמש כחיידק חלופי לניסויי שחפת כאשר מתקני BSL3 אינם זמינים²². יש לבצע את ההליכים הבאים באמצעות BCG תחת מעבדת בטיחות ביולוגית ברמה 2 (BSL2) ולעקוב אחר הנחיות הבטיחות הביולוגית המתאימות ונוהלי מעבדה טובים.......

Discussion

שחפת היא בעיה חשובה בבריאות הציבור עם חשיבות גוברת, במיוחד במדינות בעלות הכנסה נמוכה ובינונית. השיבוש במסגרות הבריאות לאבחון וטיפול בשחפת במהלך מגפת COVID-19 גרם להשפעה שלילית על שכיחות המקרים החדשים¹. בנוסף, יש לטפל בדחיפות בזני M.tb הרב-תרופתיים והעמידים לתרופות, ובהדבקה המ?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
96-well plates	VWR	734-2781
DSLR 15-55 mm lens	Nikon	AF-P DX NIKKOR 18-55mm f/3.5-5.6G VR
DSLR camera	Nikon	D3400
DSLR macro lens	Sigma	MACRO 105mm F2.8 EX DG OS HSM
Fetal calf serum	Gibco	10270106
Fiji Software		https://fiji.sc/	Fiji is an open-source software supported by several laboratories, institutions, and individuals. All the required plugins are included.
Igepal CA-630	Sigma-Aldrich	18896
L-glutamine	Gibco	25030-081
Middlebrook 7H10	BD	262710
Middlebrook 7H9	BD	271310
Multichannel pipette (0.5 - 10 µl)	Gilson	FA10013
Multichannel pipette (20 - 200 µl)	Gilson	FA10011
Mycobacterium bovis BCG	American Type Culture Collection	ATCC35734	strain TMC 1011 [BCG Pasteur]
OADC enrichment	BD	211886
Phosphate buffered saline (PBS)	NZYTech	MB25201
RPMI 1640 medium	Gibco	21875091
Sodium pyruvate	Gibco	11360-070
Spectrophotometer UV-6300PC	VWR	634-6041
Square Petri dish 120 x 120 mm	Corning	BP124-05
Tyloxapol	Sigma-Aldrich	T8761
Ultrasound bath Elma P 30 H	VWR	142-0051