Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

קביעת יחידות יוצרות מושבות (CFU) היא הטכניקה הסטנדרטית לכימות חיידקים, כולל Mycobacterium tuberculosis אשר יכול לקחת שבועות כדי ליצור מושבות גלויות. כאן אנו מתארים מיקרו-CFU לקביעת CFU עם יעילות זמן מוגברת, שטח מעבדה מופחת ועלות מגיב, ומדרגיות לניסויים בתפוקה בינונית וגבוהה.

Abstract

שחפת, סיבת המוות המובילה בעולם על ידי גורם זיהומי, הרגה 1.6 מיליון בני אדם בשנת 2022, רק עקף על ידי COVID-19 במהלך המגיפה 2019-2021. המחלה נגרמת על ידי החיידק Mycobacterium tuberculosis (M.tb). זן Mycobacterium bovis Bacillus Calmette-Guérin (BCG), החיסון היחיד לשחפת, הוא החיסון המורשה העתיק ביותר בעולם, שעדיין נמצא בשימוש. נכון לעכשיו, ישנם 12 חיסונים בניסויים קליניים ועשרות חיסונים בפיתוח פרה-קליני. שיטת הבחירה המשמשת להערכת היעילות של חיסוני שחפת במחקרים פרה-קליניים היא ספירת מושבות חיידקים על ידי בדיקת יחידות יוצרות מושבה (CFU). בדיקה זו גוזלת זמן רב ואורכת 4 עד 6 שבועות, דורשת שטח מעבדה ואינקובטור משמעותי, יש לה עלויות ריאגנטים גבוהות והיא מועדת לזיהום. כאן אנו מתארים שיטה אופטימלית לספירת מושבות, מיקרו-CFU (mCFU), המציעה פתרון פשוט ומהיר לניתוח תוצאות יעילות החיסון M.tb . בדיקת mCFU דורשת פי עשרה פחות ריאגנטים, מפחיתה את תקופת הדגירה פי שלושה, לוקח שבוע עד שבועיים לסיים, מפחיתה את שטח המעבדה ואת עלות המגיב, וממזערת את סיכוני הבריאות והבטיחות הקשורים לעבודה עם מספר גדול של M.tb. יתר על כן, כדי להעריך את יעילותו של חיסון נגד שחפת, ניתן לקבל דגימות ממגוון מקורות, כולל רקמות מבעלי חיים מחוסנים הנגועים במיקובקטריה. אנו מתארים גם שיטה אופטימלית לייצור תרבית מיקובקטריאלית חד-תאית, אחידה ואיכותית למחקרי זיהום. לבסוף, אנו מציעים לאמץ שיטות אלה באופן אוניברסלי למחקרים פרה-קליניים של קביעת יעילות החיסון, מה שיוביל בסופו של דבר לקיצור זמן בפיתוח חיסונים נגד שחפת.

Introduction

שחפת היא סיבת המוות המובילה בעולם על ידי גורם זיהומי יחיד, חיידק Mycobacterium tuberculosis (M.tb), והורגת יותר אנשים מכל פתוגן אחר. בשנת 2021, שחפת הייתה אחראית ל -1.6 מיליון מקרי מוות ועקפה את COVID-19 במהלך המגיפה 2019-20211. יתר על כן, על פי דו"ח השחפת העולמי של ארגון הבריאות העולמי לשנת 2022, מגפת COVID-19 הייתה אחראית לעלייה במקרי שחפת חדשים. ארגון הבריאות העולמי מדווח גם על ירידה גדולה במספר האנשים שאובחנו עם שחפת בתקופה זו, מה שעלול להגדיל עוד יותר את מספר מקרי השחפת1.

Bacillus Calmette-Guérin (BCG) הוא זן חי מוחלש של Mycobacterium bovis הפתוגני ששימש לראשונה....

Protocol

הערה: הפרוטוקול המתואר כאן מיועד ל-BCG, אך ניתן להחיל אותו על כל מיקובקטריה. BCG יכול לשמש כחיידק חלופי לניסויי שחפת כאשר מתקני BSL3 אינם זמינים22. יש לבצע את ההליכים הבאים באמצעות BCG תחת מעבדת בטיחות ביולוגית ברמה 2 (BSL2) ולעקוב אחר הנחיות הבטיחות הביולוגית המתאימות ונוהלי מעבדה טובים.......

Representative Results

בדיקת mCFU המתוארת כאן מגדילה את כמות המידע שניתן לאחזר מצלוחית פטרי בודדת לפחות פי 96. איור 5 מתאר השוואה בין שתי שיטות למתן תרופות לשימוש מחדש בסקינביר (SQV)31,32 כתרופה המכוונת על ידי המאכסן לטיפול בשחפת. בניסוי זה, ארבעה זנים שונים של Mycobacterium tub.......

Discussion

שחפת היא בעיה חשובה בבריאות הציבור עם חשיבות גוברת, במיוחד במדינות בעלות הכנסה נמוכה ובינונית. השיבוש במסגרות הבריאות לאבחון וטיפול בשחפת במהלך מגפת COVID-19 גרם להשפעה שלילית על שכיחות המקרים החדשים1. בנוסף, יש לטפל בדחיפות בזני M.tb הרב-תרופתיים והעמידים לתרופות, ובהדבקה המ?.......

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי מימון פנימי מהפקולטה לרפואה, Universidade Católica Portuguesa, ומימון חיצוני מ- Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT), במסגרת המענקים UIDP/04279/2020, UIDB/04279/2020 ו- EXPL/SAU-INF/0742/2021.

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
96-well platesVWR734-2781
DSLR 15-55 mm lensNikonAF-P DX NIKKOR 18-55mm f/3.5-5.6G VR
DSLR cameraNikonD3400
DSLR macro lensSigmaMACRO 105mm F2.8 EX DG OS HSM
Fetal calf serumGibco10270106
Fiji Softwarehttps://fiji.sc/Fiji is an open-source software supported by several laboratories, institutions, and individuals. All the required plugins are included.
Igepal CA-630Sigma-Aldrich18896
L-glutamineGibco25030-081
Middlebrook 7H10BD262710
Middlebrook 7H9BD271310
Multichannel pipette (0.5 - 10 µl)GilsonFA10013
Multichannel pipette (20 - 200 µl)GilsonFA10011
Mycobacterium bovis BCG American Type Culture CollectionATCC35734strain TMC 1011 [BCG Pasteur]
OADC enrichmentBD211886
Phosphate buffered saline (PBS)NZYTechMB25201
RPMI 1640 mediumGibco21875091
Sodium pyruvateGibco11360-070
Spectrophotometer UV-6300PCVWR634-6041
Square Petri dish 120 x 120 mmCorningBP124-05
TyloxapolSigma-AldrichT8761
Ultrasound bath Elma P 30 HVWR142-0051

References

  1. World Health Organization. . Global Tuberculosis Report 2022. , (2022).
  2. Bettencourt, P. J. G., Joosten, S. A., Lindestam Arlehamn, C. S., Behr, M. A., Locht, C., Neyrolles, O. 100 years of the Bacillus Calmette-Guérin vaccine. Vaccine. 39 (50), 7221-7222 (2021).....

Explore More Articles

197Bacillus calmette Gu rinMCFU

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved