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  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

A determinação de unidades formadoras de colônias (UFC) é a técnica padrão-ouro para quantificar bactérias, incluindo o Mycobacterium tuberculosis , que pode levar semanas para formar colônias visíveis. Aqui descrevemos uma micro-UFC para determinação de UFC com maior eficiência de tempo, redução do espaço de laboratório e custo do reagente, e escalabilidade para experimentos de médio e alto rendimento.

Abstract

A tuberculose (TB), principal causa de morte no mundo por um agente infeccioso, matou 1,6 milhão de pessoas em 2022, só sendo superada pela Covid-19 durante a pandemia de 2019-2021. A doença é causada pela bactéria Mycobacterium tuberculosis (M.tb). A cepa de Mycobacterium bovis Bacillus Calmette-Guérin (BCG), única vacina contra a tuberculose, é a mais antiga vacina licenciada no mundo, ainda em uso. Atualmente, há 12 vacinas em testes clínicos e dezenas de vacinas em desenvolvimento pré-clínico. O método de escolha para avaliar a eficácia das vacinas contra TB em estudos pré-clínicos é a enumeração de colônias bacterianas pelo ensaio de unidades formadoras de colônias (UFC). Este ensaio demorado leva de 4 a 6 semanas para ser concluído, requer espaço substancial no laboratório e na incubadora, tem altos custos de reagentes e é propenso a contaminação. Aqui descrevemos um método otimizado para enumeração de colônias, a micro-UFC (mCFU), que oferece uma solução simples e rápida para analisar os resultados de eficácia da vacina M.tb . O ensaio de mCFU requer dez vezes menos reagentes, reduz o período de incubação três vezes, levando de 1 a 2 semanas para ser concluído, reduz o espaço do laboratório e o custo do reagente e minimiza os riscos de saúde e segurança associados ao trabalho com um grande número de M.tb. Além disso, para avaliar a eficácia de uma vacina contra a TB, amostras podem ser obtidas de uma variedade de fontes, incluindo tecidos de animais vacinados infectados com micobactérias. Também descrevemos um método otimizado para produzir uma cultura de micobactérias unicelular, uniforme e de alta qualidade para estudos de infecção. Finalmente, propomos que esses métodos sejam universalmente adotados para estudos pré-clínicos de determinação da eficácia vacinal, levando à redução do tempo no desenvolvimento de vacinas contra TB.

Introduction

A tuberculose (TB) é a principal causa de morte no mundo por um único agente infeccioso, a bactéria Mycobacterium tuberculosis (M.tb), matando mais pessoas do que qualquer outro patógeno. Em 2021, a tuberculose foi responsável por 1,6 milhão de mortes e foi superada pela Covid-19 durante a pandemia1 de 2019-2021. Além disso, de acordo com o relatório global de TB da Organização Mundial da Saúde de 2022, a pandemia de COVID-19 foi responsável por um aumento de novos casos de TB. A OMS também relata grandes quedas no número de pessoas diagnosticadas com TB nesse período, o que poderia aumentar ainda mais o número de casos de TB<....

Protocol

NOTA: O protocolo descrito aqui é para BCG, mas pode ser aplicado a qualquer micobactéria. A BCG pode ser usada como bactéria substituta para experimentos de TB quando os recursos de BSL3 não estão disponíveis22. Os procedimentos a seguir usando BCG devem ser realizados em um laboratório de nível de biossegurança 2 (BSL2) e seguir as diretrizes de biossegurança apropriadas e boas práticas de laboratório para a manipulação de microrganismos do grupo de risco 2.

Representative Results

O ensaio de mUFC descrito aqui aumenta a quantidade de informação que pode ser recuperada de uma única placa de Petri para pelo menos 96 vezes. A Figura 5 mostra a comparação de dois métodos de liberação de fármacos para o uso reaproveitado do saquinavir (SQV)31,32 como droga dirigida ao hospedeiro para o tratamento da tuberculose. Neste ensaio, quatro cepas diferentes de Mycobacterium tuberculosis foram usadas para.......

Discussion

A TB é um importante problema de saúde pública com importância crescente, particularmente em países de baixa e média renda. A interrupção dos serviços de saúde para diagnosticar e tratar a TB durante a pandemia COVID-19 causou um impacto negativo na incidência de novos casos1. Além disso, as cepas M.tb multidrogas e extensivamente resistentes e a co-infecção de M.tb e HIV devem ser urgentemente abordadas para o controle dessa epidemia 1,.......

Acknowledgements

Este trabalho foi apoiado por financiamento interno da Faculdade de Medicina da Universidade Católica Portuguesa e financiamento externo da Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT), no âmbito das bolsas UIDP/04279/2020, UIDB/04279/2020 e EXPL/SAU-INF/0742/2021.

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
96-well platesVWR734-2781
DSLR 15-55 mm lensNikonAF-P DX NIKKOR 18-55mm f/3.5-5.6G VR
DSLR cameraNikonD3400
DSLR macro lensSigmaMACRO 105mm F2.8 EX DG OS HSM
Fetal calf serumGibco10270106
Fiji Softwarehttps://fiji.sc/Fiji is an open-source software supported by several laboratories, institutions, and individuals. All the required plugins are included.
Igepal CA-630Sigma-Aldrich18896
L-glutamineGibco25030-081
Middlebrook 7H10BD262710
Middlebrook 7H9BD271310
Multichannel pipette (0.5 - 10 µl)GilsonFA10013
Multichannel pipette (20 - 200 µl)GilsonFA10011
Mycobacterium bovis BCG American Type Culture CollectionATCC35734strain TMC 1011 [BCG Pasteur]
OADC enrichmentBD211886
Phosphate buffered saline (PBS)NZYTechMB25201
RPMI 1640 mediumGibco21875091
Sodium pyruvateGibco11360-070
Spectrophotometer UV-6300PCVWR634-6041
Square Petri dish 120 x 120 mmCorningBP124-05
TyloxapolSigma-AldrichT8761
Ultrasound bath Elma P 30 HVWR142-0051

References

  1. World Health Organization. . Global Tuberculosis Report 2022. , (2022).
  2. Bettencourt, P. J. G., Joosten, S. A., Lindestam Arlehamn, C. S., Behr, M. A., Locht, C., Neyrolles, O. 100 years of the Bacillus Calmette-Guérin vaccine. Vaccine. 39 (50), 7221-7222 (2021).....

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