アイソフォーム特異的レチノイン酸受容体による生きた神経細胞ミトコンドリアの恒常性調節の最適化された自動解析(英語)

要約

ミトコンドリアネットワークは非常に複雑で、解析が非常に困難です。新しいMATLABツールは、タイムラプス画像でライブ共焦点画像化されたミトコンドリアを解析しますが、出力量が大きく、個別の手動操作が必要です。この問題に対処するために、ルーチン最適化が開発され、迅速なファイル分析が可能になりました。

要約

ミトコンドリアネットワークが複雑なため、生細胞のセグメント化、追跡、解析が非常に困難です。MATLAB ツールを使用すると、タイムラプス ファイル内のミトコンドリアを解析できるため、画像処理のプロセスが大幅に簡素化され、高速化されます。それにもかかわらず、既存のツールは大量の出力を生成するため、個々の手作業による注意が必要であり、基本的な実験セットアップでは数千のファイルが出力され、それぞれが広範で時間のかかる処理を必要とします。

これらの問題に対処するために、MATLAB コードとライブ スクリプト形式の両方でルーチン最適化が開発され、迅速なファイル解析が可能になり、ドキュメントの読み取りとデータ処理が大幅に削減されました。100ファイル/分の速度で、最適化により全体的に迅速な分析が可能になります。最適化では、個々のミトコンドリアのフレーム固有のデータを時間枠全体で平均化し、既存のツールからの出力と一致する定義された方法でデータを分析することにより、結果出力を達成します。色素テトラメチルローダミンメチルエステルを使用してライブ共焦点イメージングを行い、神経細胞をレチノイン酸受容体(RAR)アゴニストで処理することにより、ルーチンの最適化を検証しました。結果は文献と一致しており、アイソフォーム特異的RAR調節に応答するミトコンドリアネットワークの挙動をさらに特徴付けることができました。

この新しい方法論により、ニューロン全体のミトコンドリアネットワークの迅速で検証済みの特性評価が可能になりましたが、神経科学分野に適用するために不可欠な機能である軸索と細胞体ミトコンドリアの分化も可能になりました。また、速効性治療を用いた実験にも適用でき、治療前後で同じ細胞のイメージングが可能で、神経科学の分野を超越しています。

概要

細胞ミトコンドリアはあらゆる生理状態の中心に位置しており、がんやアルツハイマー病など幅広い疾患の薬理学的治療法を特定するためには、ミトコンドリアの恒常性(ミトスタシス)と挙動を完全に理解することが最も重要です^1,2。

ミトコンドリアは、エネルギー恒常性、ATP生成、カルシウム緩衝、ROS調節において重要な細胞の役割を担っており、分子シャペロンはエネルギー依存性であるため、タンパク質の恒常性を維持するためには有糸分裂が不可欠です³。これらには、細胞のニーズを効率的に満たすために、一定かつ動的なネットワークの変調と適応が必要であり、ミトコンドリアの輸送はさまざまなシグナル伝達経路によって制御されています。以前の研究では、そのような経路の1つであるレチノイン酸受容体(^RAR)4,5が説明されています。レチノイン酸(RA)は、RAR活性化を介して軸索および神経突起の成長を促進します。マウスの初代皮質ニューロンでは、RAR-βの活性化により、^神経突起におけるミトコンドリアの成長、速度、および可動性が促進される6。

プロトコル

注:このプロトコルには、細胞培養とライブ共焦点顕微鏡検査で生きたミトコンドリア(図1)の画像を得るウェットラボステップと、得られた画像(図2)を分析するインシリコステップの2つの主要なステップがあります。3Dライブ画像化されたミトコンドリアの自動データ解析には、Lefebvreらが提供するMATLABアプリケーションMitometerを使用し^{ました9。}ルーチン最適化は MATLAB で記述されます。ソフトウェア、更新バージョン、および処理 ImageJ マクロは、https://github.com/JoseJoaoMV/Routine_Optimization_Mitometer_APP_MATLAB の GitHub からオンラインで無料で入手できます。

1. ライブ顕微鏡

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結果

.txtフォーマットの出力ファイルの分析を強化および高速化するために、マイトメータ.txt出力ファイルと一致するデータを読み取るルーチン最適化がコード化され、列はフレームを表し、線は識別されたミトコンドリアを表します。ルーチン最適化では、識別された各ミトコンドリアのフレームを平均化し、視野ごとにすべてのミトコンドリアの結果を平均化することにより、パラメーター?.......

ディスカッション

生細胞イメージングでは、本格的なコンピューティング処理を必要とする大きなファイルが生成されますが、最新のツールでさえ、処理に大量の手動入力が必要です。このルーチン最適化は、マイトメーターでのミトコンドリア分析のプロセスを簡素化することに重点を置いていますが、これは、このツールがユーザー入力とデータ出力のバランスが非常に良いためです。ミトコンドリア画?.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
AM580	Sigma-Aldrich	A8843
BDNF	Thermo-Fisher	RP8642
BMS493	Tocris Bioscience	3409
CD2314	Tocris Bioscience	3824
Ch55	Tocris Bioscience	2020
Foetal Bovine Serum	Thermo-Fisher	10270106
GraphPad Prism v4.0	GraphPad Software, La Jolla	n/a
Ham’s F12 Nutrient Mix	Thermo-Fisher	21765029
MATLAB R2022a	MathWorks	n/a
Minimal Essential Medium	Thermo-Fisher	31095
Nunc Glass Bottom Dishes	Thermo-Fisher	150680
Phosphate Buffer Saline Solution	Thermo-Fisher	28372
Retinoic acid	Sigma-Aldrich	R2625
TMRM	Thermo-Fisher	T668
Zeiss LSM 510	Carl Zeiss	n/a	Equiped with live-cell imaging culture chamber and 63x oil immersion objective