Análisis automatizado optimizado de la modulación de la homeostasis de las mitocondrias neuronales vivas mediante receptores de ácido retinoico específicos de isoformas

Resumen

La red mitocondrial es extremadamente compleja, lo que hace que sea muy difícil de analizar. Una novedosa herramienta de MATLAB analiza mitocondrias con imágenes confocales en vivo en imágenes timelapse, pero da como resultado un gran volumen de salida que requiere atención manual individual. Para solucionar este problema, se desarrolló una optimización de rutina que permite un análisis rápido de los archivos.

Resumen

La compleja red mitocondrial hace que sea muy difícil segmentar, seguir y analizar las células vivas. Las herramientas de MATLAB permiten el análisis de mitocondrias en archivos timelapse, simplificando y agilizando considerablemente el proceso de procesamiento de imágenes. No obstante, las herramientas existentes producen un gran volumen de salida, lo que requiere atención manual individual, y las configuraciones experimentales básicas tienen una salida de miles de archivos, cada uno de los cuales requiere un manejo extenso y lento.

Para abordar estos problemas, se desarrolló una optimización rutinaria, tanto en código de MATLAB como en forma de scripts en vivo, lo que permite un análisis rápido de archivos y reduce significativamente la lectura de documentos y el procesamiento de datos. Con una velocidad de 100 archivos/min, la optimización permite un análisis rápido en general. La optimización logra la salida de resultados promediando los datos específicos del marco para las mitocondrias individuales a lo largo de los marcos de tiempo, analizando los datos de una manera definida, consistente con la salida de las herramientas existentes. Se realizaron imágenes confocales en vivo utilizando el colorante tetrametilrodamina metil éster, y la optimización de rutina se validó mediante el tratamiento de células neuronales con agonistas del receptor de ácido retinoico (RAR), cuyos efectos sobre las mitocondrias neuronales están establecidos en la literatura. Los resultados fueron consistentes con la literatura y permitieron una mayor caracterización del comportamiento de la red mitocondrial en respuesta a la modulación de RAR específica de isoformas.

Esta nueva metodología permitió una caracterización rápida y validada de la red de mitocondrias de toda la neurona, pero también permite la diferenciación entre las mitocondrias axónicas y las del cuerpo celular, una característica esencial para aplicar en el campo de la neurociencia. Además, este protocolo se puede aplicar a experimentos que utilizan tratamientos de acción rápida, permitiendo la obtención de imágenes de las mismas células antes y después de los tratamientos, trascendiendo el campo de la neurociencia.

Introducción

Las mitocondrias celulares se encuentran en el centro de todos los estados fisiológicos, y una comprensión profunda de su homeostasis (mitástasis) y comportamiento es primordial para ayudar a identificar el tratamiento farmacológico para una amplia gama de enfermedades, incluyendo el cáncer y la enfermedad de Alzheimer ^1,2.

Las mitocondrias desempeñan un papel celular crucial en la homeostasis energética, la generación de ATP, la amortiguación del calcio y la regulación de ROS, y la mitostasis es esencial para mantener la homeostasis de las proteínas, ya que las chaperonas molecular....

Protocolo

NOTA: Este protocolo tiene dos pasos principales: un paso de laboratorio húmedo, que involucra cultivo celular y microscopía confocal viva para obtener imágenes de mitocondrias vivas (Figura 1) y un paso in silico para analizar las imágenes obtenidas (Figura 2). Para el análisis automatizado de datos de mitocondrias en vivo en 3D, se utilizó la aplicación Mitometer de MATLAB proporcionada por Lefebvre et ^al.9. La optimización de la rutina está escrita en MATLAB. El software, las versiones actualizadas y el procesamiento de macros de ImageJ están disponibles gratuitamente en lí....

Resultados

Para mejorar y acelerar el análisis de los archivos de salida en formato .txt, se codificó una optimización de rutina que lee datos consistentes con los archivos de salida de Mitómetro .txt, con columnas que representan un marco y líneas que representan mitocondrias identificadas. La optimización de rutina produce datos en un solo valor por parámetro promediando los fotogramas de cada mitocondria identificada y, a continuación, promediando los resultados de todas las mitocondrias por campo visual. La rutina desar.......

Discusión

Las imágenes de células vivas producen archivos de gran tamaño que requieren un procesamiento informático serio, pero incluso las herramientas más recientes requieren una amplia entrada manual para procesarlas. Esta optimización rutinaria se centra en simplificar el proceso de análisis de mitocondrias en el mitómetro, ya que esta herramienta presenta un muy buen equilibrio entre la entrada del usuario y la salida de datos. Previamente se ha revisado una comparación exhaustiva entre diferentes herramientas para e.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
AM580	Sigma-Aldrich	A8843
BDNF	Thermo-Fisher	RP8642
BMS493	Tocris Bioscience	3409
CD2314	Tocris Bioscience	3824
Ch55	Tocris Bioscience	2020
Foetal Bovine Serum	Thermo-Fisher	10270106
GraphPad Prism v4.0	GraphPad Software, La Jolla	n/a
Ham’s F12 Nutrient Mix	Thermo-Fisher	21765029
MATLAB R2022a	MathWorks	n/a
Minimal Essential Medium	Thermo-Fisher	31095
Nunc Glass Bottom Dishes	Thermo-Fisher	150680
Phosphate Buffer Saline Solution	Thermo-Fisher	28372
Retinoic acid	Sigma-Aldrich	R2625
TMRM	Thermo-Fisher	T668
Zeiss LSM 510	Carl Zeiss	n/a	Equiped with live-cell imaging culture chamber and 63x oil immersion objective