Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Özet

Mitokondriyal ağ son derece karmaşıktır ve analiz edilmesini çok zorlaştırır. Yeni bir MATLAB aracı, hızlandırılmış görüntülerde canlı konfokal görüntülenen mitokondriyi analiz eder, ancak bireysel manuel dikkat gerektiren büyük bir çıktı hacmine neden olur. Bu sorunu çözmek için, hızlı dosya analizine olanak tanıyan rutin bir optimizasyon geliştirildi.

Özet

Karmaşık mitokondriyal ağ, canlı hücreleri segmentlere ayırmayı, takip etmeyi ve analiz etmeyi çok zorlaştırır. MATLAB araçları, timelapse dosyalarında mitokondrinin analizine izin vererek görüntü işleme sürecini önemli ölçüde basitleştirir ve hızlandırır. Bununla birlikte, mevcut araçlar, bireysel manuel dikkat gerektiren büyük bir çıktı hacmi üretir ve temel deney kurulumları, her biri kapsamlı ve zaman alıcı işlem gerektiren binlerce dosyadan oluşan bir çıktıya sahiptir.

Bu sorunları ele almak için, hem MATLAB kodunda hem de canlı komut dosyası formlarında, hızlı dosya analizine olanak tanıyan ve belge okuma ve veri işlemeyi önemli ölçüde azaltan rutin bir optimizasyon geliştirildi. 100 dosya/dk hızıyla optimizasyon, genel olarak hızlı bir analize izin verir. Optimizasyon, zaman dilimleri boyunca bireysel mitokondri için çerçeveye özgü verilerin ortalamasını alarak, verileri mevcut araçlardan elde edilen çıktılarla tutarlı olarak tanımlanmış bir şekilde analiz ederek sonuç çıktısını elde eder. Tetrametilrodamin metil ester boyası kullanılarak canlı konfokal görüntüleme yapıldı ve nöronal mitokondri üzerindeki etkileri literatürde ortaya konan retinoik asit reseptörü (RAR) agonistleri ile nöronal hücrelerin tedavi edilmesiyle rutin optimizasyon doğrulandı. Sonuçlar literatürle tutarlıydı ve izoforma özgü RAR modülasyonuna yanıt olarak mitokondriyal ağ davranışının daha fazla karakterizasyonuna izin verdi.

Bu yeni metodoloji, tüm nöron mitokondri ağının hızlı ve doğrulanmış karakterizasyonuna izin verdi, ancak aynı zamanda sinirbilim alanında uygulanacak önemli bir özellik olan akson ve hücre gövdesi mitokondrileri arasında farklılaşmaya da izin veriyor. Ayrıca, bu protokol, hızlı etkili tedaviler kullanan deneylere uygulanabilir ve tedavilerden önce ve sonra aynı hücrelerin görüntülenmesine izin vererek, sinirbilim alanını aşar.

Giriş

Hücresel mitokondri, tüm fizyolojik durumların merkezinde yer alır ve kanser ve Alzheimer hastalığı da dahil olmak üzere çok çeşitli hastalıklar için farmakolojik tedavinin belirlenmesine yardımcı olmak için homeostazlarının (mitostaz) ve davranışlarının tam olarak anlaşılması çok önemlidir 1,2.

Mitokondri, enerji homeostazı, ATP üretimi, kalsiyum tamponlama ve ROS regülasyonunda çok önemli hücresel roller oynar ve moleküler şaperonlar enerjiye bağımlı olduğundan protein homeostazını korumak için mitostaz gereklidir3. Bunlar, hücresel ihtiyaçları verimli bir

Protokol

NOT: Bu protokolün iki ana adımı vardır: canlı mitokondri görüntülerini elde etmek için hücre kültürü ve canlı konfokal mikroskopi içeren ıslak bir laboratuvar adımı (Şekil 1) ve elde edilen görüntüleri analiz etmek için in silico bir adım (Şekil 2). 3D canlı görüntülenen mitokondrinin otomatik veri analizi için, Lefebvre ve ark.9 tarafından sağlanan MATLAB uygulaması Mitometre kullanıldı. Rutin optimizasyon MATLAB'da yazılmıştır. Yazılım, güncellenmiş sürümler ve ImageJ Makrolarının işlenmesi, GitHub aracılığıyla çevrimiçi olarak ücretsiz olarak https://github.com/JoseJoaoMV/

Sonuçlar

Çıktı dosyalarının .txt formatta analizini geliştirmek ve hızlandırmak için, bir çerçeveyi temsil eden sütunlar ve tanımlanmış mitokondriyi temsil eden çizgiler ile Mitometre .txt çıktı dosyalarıyla tutarlı verileri okuyan rutin bir optimizasyon kodlandı. Rutin optimizasyon, tanımlanan her mitokondri için çerçevelerin ortalamasını alarak ve ardından görsel alan başına tüm mitokondri sonuçlarının ortalamasını alarak parametre başına tek bir değerde veri üretir. Geliştirilen rutin...

Tartışmalar

Canlı hücre görüntüleme, ciddi bilgi işlem gerektiren büyük dosyalar üretir, ancak en yeni araçlar bile işlemek için kapsamlı manuel girdi gerektirir. Bu rutin optimizasyon, Mitometre'de mitokondri analizi sürecini basitleştirmeye odaklanmıştır çünkü bu araç, kullanıcı girdisi ve veri çıkışı arasında çok iyi bir denge sunar. Mitokondri görüntü analizi için farklı araçlar arasında kapsamlı bir karşılaştırma daha önce gözden geçirilmiştir10. Diğer boru...

Açıklamalar

Yazarların beyan edecek herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

Görüntü alımı, PPBI'nin (Portekiz Biyogörüntüleme Platformu) bir düğümü olan iBiMED'in LiM tesisinde gerçekleştirildi: POCI-01-0145-FEDER-022122. Bu çalışma, Ministério da Educação e Ciência'nın Fundação para a Ciência e Tecnologia'sından DT'ye bir hibe olan FCT (EXPL/BTM-SAL/0902/2021) LCF (CI21-00276) tarafından desteklenmiştir (2020.02006.CEECIND), ATG-Gabba Mezunlar Derneği'nden VP'ye bir hibe ve Aveiro Üniversitesi Biyotıp Enstitüsü-iBiMED.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
AM580Sigma-AldrichA8843
BDNF Thermo-FisherRP8642
BMS493Tocris Bioscience 3409
CD2314Tocris Bioscience3824
Ch55Tocris Bioscience 2020
Foetal Bovine SerumThermo-Fisher10270106
GraphPad Prism v4.0GraphPad Software, La Jollan/a
Ham’s F12 Nutrient MixThermo-Fisher21765029
MATLAB R2022a MathWorksn/a
Minimal Essential MediumThermo-Fisher31095
Nunc Glass Bottom DishesThermo-Fisher150680
Phosphate Buffer Saline SolutionThermo-Fisher28372
Retinoic acidSigma-Aldrich R2625
TMRM Thermo-FisherT668
Zeiss LSM 510Carl Zeissn/aEquiped with live-cell imaging culture chamber and 63x oil immersion objective 

Referanslar

  1. Trigo, D., Avelar, C., Fernandes, M., Sa, J., da Cruz, E. S. O. Mitochondria, energy, and metabolism in neuronal health and disease. FEBS Letters. 596 (9), 1095-1110 (2022).
  2. Zong, W. X., Rabinowitz, J. D., White, E. Mitochondria and cancer.

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

This article has been published

Video Coming Soon

Sitemizdeki deneyiminizi iyileştirmek için çerezleri kullanıyoruz

Sitemizi kullanmaya devam ederek ya da "Devam et" butonuna tıklayarak, çerezleri kabul edebilirsiniz.