* These authors contributed equally
מחקר זה מציג שיטה לניתוח המורפולוגיה של המיטוכונדריה בהתבסס על אימונוסטיין וניתוח תמונה ברקמת מוח עכבר באתרה. הוא גם מתאר כיצד זה מאפשר לזהות שינויים במורפולוגיה המיטוכונדריאלית הנגרמים על ידי צבירת חלבונים במודלים של מחלת פרקינסון.
מיטוכונדריה ממלאים תפקיד מרכזי בחילוף החומרים האנרגטי של תאים, ותפקודם חשוב במיוחד עבור תאי עצב בשל דרישת האנרגיה הגבוהה שלהם. לכן, תפקוד לקוי של המיטוכונדריה הוא סימן היכר פתולוגי של הפרעות נוירולוגיות שונות, כולל מחלת פרקינסון. הצורה והארגון של הרשת המיטוכונדריאלית הם פלסטיים מאוד, מה שמאפשר לתא להגיב לרמזים ולצרכים סביבתיים, וגם מבנה המיטוכונדריה קשור קשר הדוק לבריאותם. כאן, אנו מציגים פרוטוקול לחקר מורפולוגיה מיטוכונדריאלית באתרה המבוסס על אימונוסטיין של החלבון המיטוכונדריאלי VDAC1 וניתוח תמונה לאחר מכן. כלי זה יכול להיות שימושי במיוחד לחקר הפרעות נוירודגנרטיביות מכיוון שהוא יכול לזהות הבדלים עדינים בספירות מיטוכונדריאליות ובצורה הנגרמת על ידי צברים של α-סינוקלאין, חלבון נוטה לצבירה המעורב במידה רבה בפתולוגיה של מחלת פרקינסון. שיטה זו מאפשרת לדווח כי נוירונים דופמינרגיים בעלי נגעי pS129 מראים פיצול מיטוכונדריאלי (כפי שהוצע על ידי יחס גובה-רוחב מופחת שלהם, AR) בהשוואה לנוירונים שכנים בריאים שלהם במודל פרקינסון הזרקת פיבריל תוך גולגולתי שנוצר מראש.
למערכת העצבים המרכזית יש ביקוש אינטנסיבי ל-ATP: תאי עצב משתמשים ב-ATP כדי לתמוך בשיפועים יוניים, סינתזת מוליכים עצביים, ניוד שלפוחית סינפטית, שחרור ומיחזור, וכדי לאפשר תרגום ופירוק מקומי של חלבונים. יותר מ-95% מה-ATP המשמש את המוח מיוצר על-ידי המיטוכונדריה1. לכן, אין זה מפתיע שתפקוד לקוי של המיטוכונדריה מזיק במיוחד לנוירונים. למעשה, ליקויים בתפקוד המיטוכונדריה ממלאים תפקיד חשוב במספר מחלות נוירולוגיות, כולל מחלות נוירודגנרטיביות, כגון מחלת פרקינסון (PD) ואלצהיימר (AD)2,3.
גנים מרובים קשורים באופן חד משמעי לחלבונים מקודדי PD הרלוונטיים לתפקוד המיטוכונדריה ולהומאוסטזיס, כגון פרקין 4,5,6, קינאז המושרה על ידי PTEN 1 (PINK1)7,8 ו- DJ-19. ראיות נוספות לתפקוד לקוי של המיטוכונדריה בפרקינסון הן שטיפולים במעכבי קומפלקס I של שרשרת הובלת האלקטרונים במיטוכונדריה (כגון רוטנון ו-MPTP) משחזרים מספר היבטים של פרקינסון במבחנה ו-in vivo10. עם זאת, חשוב לציין כי תהליכים פתולוגיים רבים עשויים לגרום לאובדן עצבי בפרקינסון, יחד עם ליקויים מיטוכונדריאליים: עקה חמצונית, שינוי הומאוסטזיס סידן, כישלון של יוביקוויטין-פרוטאזום ושל מערכות אוטופגיה-ליזוזומליות, וצבירת חלבונים הם בין הנחקרים ביותר (נסקרו ב 11,12,13 ו).
מיטוכונדריה הם הטרוגניים בצורתם: בנוסף ליחידות בודדות, הם נמצאים בדרך כלל כרשתות רשתית וצינורית מורחבות. המבנה והמיקום התאי של המיטוכונדריה קריטיים לתפקודם14; למעשה, רשתות מיטוכונדריאליות הן דינמיות ביותר, ועוברות תהליכים תכופים של ביקוע, איחוי ומיטופגיה על מנת לענות על צרכי התאים ולהגיב לרמזים סביבתיים15,16. בנוסף, המורפולוגיה של המיטוכונדריה קשורה קשר הדוק למצב הבריאותי שלהם. לדוגמה, באטרופיה אופטית אנושית, מוטציות גנטיות המפחיתות את פעילות המיטוכונדריה מובילות למיטוכונדריה חריגה, דקה והיפר-פיוזית17. מצד שני, מגוון מחלות אנושיות מציגות מורפולוגיה מיטוכונדריאלית חריגה, כולל פיצול מיטוכונדריאלי או איחוי מיטוכונדריאלי מוגזם, שיש להם השפעות מזיקות על תפקוד המיטוכונדריה (נסקר ב-18). בהקשר של פרקינסון, אנו ואחרים הראינו בעבר כי צורה מיטוכונדריאלית חריגה נמצאת בקורלציה עם תפקוד לקוי בתגובה לצברי α-סינוקלאין19. בעוד שמורפולוגיה מיטוכונדריאלית נחקרה בהרחבה במבחנה הן בהקשר של פרקינסון והן בהקשר של מחלות אחרות 20,21,22, חסרים פרוטוקולים להערכת מורפולוגיה מיטוכונדריאלית מקטעי in vivo. זה הופך את המחקר in vivo של מיטוכונדריה בהקשר של מחלות כגון PD תלוי מאוד בבעלי חיים טרנסגניים23 או הערכה של תמציות המוח התיכון שאינם יכולים לספק פתרון תאי.
כאן, מוצג פרוטוקול לחקר המורפולוגיה המיטוכונדריאלית באתרה כאינדיקטור למצבם התפקודי ובריאותם, בהתבסס על אימונוסטיין של החלבון המיטוכונדריאלי VDAC124 ואחריו ניתוח תמונה בקטעי רקמה משובצים פרפין. אנו גם מראים את התוצאות של פרוטוקול זה במודלים של PD in vitro ו-in vivo : תאי נוירובלסטומה בעלי ביטוי יתר של SNCA (Synuclein Alpha) ורקמת מוח מעכברים שנחשפו להזרקה תוך-גולגולתית של α-synuclein Pre-Formed Fibrils (PFFs). Co-immunostaining עם נוגדן נגד α-synuclein (בתאים) או phosphoSer129- α-synuclein pS129 (במוחות עכברים) אפשרה לנו לזהות תאים עם פתולוגיה מצטברת של חלבונים (ביטוי יתר של סיבי α-synuclein ו-α-synuclein, בהתאמה) בדגימות, בעוד שתאים שליליים שימשו כבקרה לא פתולוגית בתוך אותן דגימות. באמצעות ניתוח זה והנתונים המתוארים כאן, נצפה יחס גובה-רוחב מופחת, המצביע על פיצול מיטוכונדריה בתאים המבטאים יתר על המידה SNCA או מציגים נגעי pS129.
כל ההליכים המתוארים בסעיף זה בוצעו על פי המסגרת האתית שסופקה על ידי אוניברסיטת ארץ הבסקים התייחסות M20/2022/212, ממשלת ארץ הבסקים, ממשלת ספרד והאיחוד האירופי.
1. ניתוח מורפולוגיה מיטוכונדריאלית בתאי SH-SY5Y בעלי ביטוי יתר של SNCA
הערה: כאן, תיאור קצר של הדור של חומר במבחנה עבור המחקר, אשר ישמש השוואה עבור התוצאות באתרו שהתקבלו, מסופק. מומלץ לבצע ניתוח מסוג זה לפני השקת ניסוי in vivo למורפולוגיה מיטוכונדריאלית, מכיוון שהוא יבטיח שכל מערכי ההדמיה והניתוח המתאימים נמצאים במקום.
2. יצירת PFFs וזריקות PFF תוך גולגולתיות בעכברים
הערה: יצירת חומר ההזרקה ותהליך ההזרקה התוך גולגולתית מוצגים כאן. פרוטוקול זה נלקח מ Luk et al.25.
3. ניתוח מורפולוגיה מיטוכונדריאלית על ידי אימונוהיסטוכימיה על פרוסות מוח משובצות פרפין מעכברים בהזרקת PFF
על מנת להבטיח כי מתקיימים תנאי הדמיה וניתוח מתאימים להערכה באתרו של מורפולוגיה מיטוכונדריאלית ברקמות, מומלץ לחקור במבחנה את המורפולוגיה המיטוכונדריאלית בתגובה למודולטור ידוע של מורפולוגיה מיטוכונדריאלית (סעיף 1). לדוגמה, SNCA התבטא יתר על המידה גנטית בתאי SH-SY5Y כדי לגרום לשינויים במורפולוגיה של המיטוכונדריה כפי שתואר קודם לכן26. עלבונות אחרים שיכולים לשמש כבקרה להחמרת המורפולוגיה של המיטוכונדריה יהיו רעב או שימוש במעכבי פעילות מיטוכונדריאלית כגון MPP+. התאים עברו טרנספורמציה ונצבעו עבור α-סינוקלאין (AS) כדי להפריד בין תאי SNCA+ (AS+) ו-SNCA- (AS-). הם גם הוכתמו עם TOMM2027 כדי להמחיש את רשת התאים המיטוכונדריאלית. כדי להפוך את הניתוח הזה לדומה ככל האפשר לזה של חתך רקמה של 5 מיקרומטר, נותח מישור קונפוקלי אחד בניגוד להקרנה מקסימלית של מספר מישורים. ניתוח מורפולוגי של מישור קונפוקלי אחד של TOMM20 גילה שגם המספר הכולל של המיטוכונדריה וגם יחס הממדים שלהם או AR (שנמצא בקורלציה עם התארכות האברון) הופחתו בתגובה לביטוי יתר של SNCA (איור 1).
Immunostaining בוצע עבור חלבון מיטוכונדריאלי VDAC1 בקטעי מוח עכבר משובצים פרפין 5 מיקרומטר מבעלי חיים שהוזרקו עם PFFs כמתואר בסעיף הפרוטוקול לעיל. Substantia nigra pars compacta (SNc) נוירונים דופמינרגיים, שעוברים ניוון בפרקינסון, התגלו באמצעות קו-אימונוסטיין עם אנטי-טירוזין הידרוקסילאז (TH) והופרדו אזורית מאזור הטגמנטל הגחוני וה-substantia nigra pars lateralis. מצד שני, צביעה נגד פוספוסר 129-α-סינוקלאין (pS129) אפשרה לנו להבחין בין תאים שמכילים נגעי pS129 לבין תאים בריאים (pS129+ לעומת pS129-). צולמו תמונות SNc של שלוש חיות שונות, וניתוח תמונות עוקב של צביעת VDAC1 של תאי עצב חיוביים ל-TH גילה ירידה הן בספירת המספרים המיטוכונדריאליים והן ביחס הממדים בין תאי עצב הנושאים נגעי pS129 לבין תאי עצב החסרים אותם (איור 2). תוצאות אלה מצביעות על כך שהמורפולוגיה המיטוכונדריאלית של תאי עצב בעלי נגעי pS129 נפגעת בהשוואה לזו של תאים חסרי נגעי pS129.
בעוד שהניסוי הספציפי הזה מראה ירידה במציאות הרבודה, ובכך מדגיש ירידה בהתארכות המיטוכונדריה יחד עם ירידה בספירה העולמית, מה שמצביע על החמרה במורפולוגיה של המיטוכונדריה, הפרשנות של הנתונים צריכה להיות תלויה בניסוי. לדוגמה, ירידה במציאות רבודה ובספירות יכולה להצביע על ירידה גלובלית בתכולת המיטוכונדריה כמו גם פיצול, בעוד שירידה במציאות רבודה אך עלייה בספירה הגלובלית תצביע על פנוטיפ פיצול מיטוכונדריאלי. לכן, חשוב לפרש את הנתונים בהקשר של שני המדדים.
איור 1: מורפולוגיה מיטוכונדריאלית במודל SNCA-overexpressioning in vitro . Co-immunostaining עבור TOMM20 (ירוק), α-synuclein (AS, אדום) ו- DAPI (כחול) על SNCA-overexpressioning ולא overexpressing (AS+ ו- AS-, בהתאמה) תאים (A). פירוט של תא AS- (B) ותא AS+ (C). תמונות בשחור-לבן בחלוניות (B) ו-(C) מייצגות את המסיכות של אות TOMM20 לאחר החלת הפונקציה Fiji המתוארת בסעיף Protocol. מסיכה זו מאפשרת לכמת את צורת המבנים המתקבלים. ספירות מיטוכונדריאליות וערכי יחס גובה-רוחב (AR) של תאי AS- ו- AS+ (N = 25 תאים לכל תנאי) כומתו ויוצגו כערכים בודדים וכן כממוצע ± SEM; **ערך p < 0.05 t-test (D). הנורמליות הוערכה באמצעות מבחני הנורמליות של ד'אגוסטינו ופירסון. מוטות קנה מידה: A, 30 מיקרומטר; B,C, 5 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: מורפולוגיה מיטוכונדריאלית מושפעת בתאי עצב שמכילים נגעי pS129. Co-immunostaining עבור TH (ירוק), VDAC1 (אדום), phosphoS129-α-synuclein (מגנטה), ו- DAPI (כחול) של SNc של עכברים בהזרקת PFF (A). הפרטים של נוירון דופמינרגי פוספוס129-α-סינוקלאין-שלילי (pS129-) (B) ושל נוירון דופמינרגי פוספוס129-α-סינוקלאין-חיובי (pS129+) (C). תמונות בשחור-לבן בחלוניות (B) ו-(C) מייצגות את המסיכות של אות TOMM20 לאחר החלת הפונקציה Fiji המתוארת בסעיף Protocol. מסיכה זו מאפשרת לכמת את צורת המבנים המתקבלים. תאים שליליים וחיוביים נספרו בדגימות משלוש חיות שונות, כפי שמודגם על ידי הצבעים השונים של ערכי הגרפים הבודדים (כחול, ירוק וכתום). ספירות מיטוכונדריאליות וכימות AR של pS129- (N = 29) לעומת pS129+ (N = 22) בנוירונים דופמינרגיים יוצגו כממוצע ± SEM וכן כערכי תאים בודדים; **ערך p < 0.05 t-test (D). הנורמליות הוערכה באמצעות מבחני הנורמליות של ד'אגוסטינו ופירסון. מוטות קנה מידה: A, 30 מיקרומטר; B,C, 5 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
בסך הכל, מחקר זה מראה כי immunostaining בשילוב עם ניתוח תמונה היא שיטה אמינה לניתוח מורפולוגיה מיטוכונדריאלית. למעשה, הוא מאפשר לכמת את מספר המיטוכונדריה, כמו גם כמה פרמטרים מורפולוגיים כגון יחס גובה-רוחב הן בתרבית התא והן ברקמה. מספר המיטוכונדריה קשור ישירות למצב התפקודי של מנגנוני הביקוע והאיחוי של הדגימות, בעוד שערך AR מסתמך על התארכות האברון. שיטה זו עשויה להיות בעלת ערך רב במיוחד להערכה מהירה של הפרעות מיטוכונדריאליות במודלים של פרקינסון שבהם שינויים במורפולוגיה, דינמיקה ותפקודים של המיטוכונדריה הם מנגנונים פתולוגיים ידועים28,29. α-סינוקלאין ממלא תפקיד רלוונטי גם בפרקינסון: אכן, α-סינוקלאין הוא אחד המרכיבים של גופי לוי, אגרגטים ציטופלסמטיים פיברילריים המשמשים לאבחון לאחר המוות של חולי פרקינסון30. יתר על כן, מוטציות בגן SNCA נמצאו בחולים עם פרקינסון מוכר וספורדי כאחד (נסקר ב-31). זרחן של α-סינוקלאין ב-Ser129 הוכח בהרחבה כפתולוגיה דמוית גוף לוי, המתגלה לאחר עלבון PFF ומעוררת השפעות רעילות שונות32,26.
באמצעות הכלי שהוצג כאן, הצלחנו לזהות ירידה במספר המיטוכונדריה ובערכי AR בנוכחות α-סינוקלאין (תאים עם צביעה α-סינוקלאין ותאי עצב הנושאים נגעים חיוביים ל-phosphoSer129α-synuclein, בהתאמה) בהשוואה לתאים חסרי נגעים כאלה (תאים שליליים α-synuclein ו-phosphoS129α-synuclein). תוצאות אלה תואמות דיווחים קודמים המראים כיצד אינטראקציות ישירות של α-סינוקלאין-מיטוכונדריה מייצרות השפעות רעילות על תפקוד המיטוכונדריה והומאוסטזיס במחלת פרקינסון26,33 34. ואכן, דווח כי עכברים עם מוטציות α-סינוקלאין מפגינים נזק מוגבר לדנ"א מיטוכונדריאלי35 ומיטופגיה36,37. יתר על כן, תואר כי רמות מוגברות של α-סינוקלאין מקדמות ביקוע/פיצול מיטוכונדריאלי, גורמות למיני חמצן תגובתי במיטוכונדריה, ומווסתות את ביטוי החלבונים המיטוכונדריאליים בשורות תאים ובמודלים של עכברים המבטאים יתר על המידה α-סינוקלאין 26,38,39.
חשוב להדגיש כי כלי זה תלוי מאוד בנוגדנים המשמשים למחקר; הערכה מורפולוגית זהירה של כתם הנוגדנים המשמש היא הכרחית כדי לזהות את התא התת-תאי המתאים. מכיוון שטכניקה זו מבוססת על חתכים של 5 מיקרומטר ולכן דורשת מישורי מוקד בודדים לניתוח המבנים המיטוכונדריאליים, היעדר פנוטיפ לא ישלול את קיומו של פנוטיפ, שכן ייתכן שהבדלים עדינים במורפולוגיה המיטוכונדריאלית לא יתגלו בשיטה זו.
בעוד שעבודה זו ואחרות השתמשו בעבר בגישות דומות להערכת מורפולוגיה מיטוכונדריאלית in vivo40, יש צורך בפרוטוקול מפורט שיהיה נגיש לקהילת המחקר לצורך הערכה זו. משמעות מחקר זה היא שניתן ליישם שיטה זו על מודלים שונים של מחלות in vivo כדי להעריך הפרעות מורפולוגיות מיטוכונדריאליות ולזהות פתולוגיה פוטנציאלית, אשר עשויה בסופו של דבר להקל על סינון תרכובות עופרת לטיפול בהפרעות כאלה. בעוד ניתוח זה מוגבל כיום לרקמה משובצת פרפין, היתרון של השיטה הוא שניתן ליישם אותה על כל מודל מחלה לאחר איסוף רקמות סופניות, מה שהופך אותה לכלי רב-תכליתי מאוד.
ברצוננו להודות למממני מחקר זה, במיוחד Ikerbasque, משרד המדע והחדשנות הספרדי, קרן מייקל ג'יי פוקס, IBRO והמרכז הבאסקי אצ'וקרו למדעי המוח.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
32 G Hamilton syringe | Hamilton | 7632-01 | |
4',6-diamidino-2-fenilindol, dihidrocloruro (DAPI) | Invitrogen | D1306 | |
4/0 USP 45 cm suture | SSa90 pga | 32345n-36u | |
Alexa fluor 488/594-Donkey anti-Mouse | Invitrogen | A21202; A21203 | green/red dye-Donkey anti-Mouse |
Alexa fluor 594/647-Donkey anti-Rabbit | Invitrogen | A21207 A31573 | red/far red dye-Donkey anti-Rabbit |
AlexaFluor 488-Donkey anti-Chicken | Jackson ImmunoResearch | 703-545-155 | green dye-Donkey anti-Chicken |
Anti-PSer129 α-synuclein EP1536Y (Rabbit) antibody | Abcam | ab51253 | |
Anti-TOM 20 (Mouse) antibody | Santa Cruz | sc-17764 | |
Anti-Tyrosine Hydroxylase (Chicken) antibody | Abcam | ab76442 | |
Anti-VDAC1 (Mouse) antibody | Santa Cruz | sc-390996 | |
Anti-α-synuclein antibody MJFR1 (Rabbit) | Abcam | ab138501 | |
Citrate buffer 100X stock: 120mM citrate buffer, 5% Tween in water (pH 6) | Home-made | ||
Disposable base mold for tissue embedding | Fisher | 22-363-553 | Plastic embedding boxes |
D-MEM F12 | Gibco | A321331020 | |
EVOS M7000 Imaging System | ThermoFisher Scientific | High-content automated fluorescence microscope | |
Fetal Bovine Serum | Gibco | 10270106 | |
Flat optical bottom 96 well plates | Greiner | 675090 | |
FluorSave Reagent | Millipore | 345789-20ML | Mounting reagent |
Glutamine 200 mM | Gibco | 25030-024 | |
ImmEdge Hydrophobic Barrier Pen | Vector Laboratories | H-4000 | PAP-pen |
Lipofectamine and Plus Reagent | Invitrogen | 11668-019; 11514-015 | Transfection reagent and transfection adjuvant |
Matrigel | Corning | 354230 | Coating matrix |
Microtome | ThermoFisher Scientific | ||
Normal Donkey Serum | Gibco | PCN5000 | |
Opti-MEM | Gibco | 31985070 | Transfection medium |
PCDNA4 plasmid (backbone) | Addgene | 41036 | |
Penicillin/Streptomycin solution | Gibco | 15140-122 | |
SH-SY5Y cells/well | ATCC | HTB-11 | |
Xylene substitute | Labbox | 22L36504 | |
Zeiss Axio Imager Apotome 2 | Carl Zeiss | Structured illumination fluorescence imaging system | |
α-synuclein peptide | rpeptide | S-1010-2 |
Explore More Articles
This article has been published
Video Coming Soon
ABOUT JoVE
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved