* These authors contributed equally
Este estudo apresenta um método para analisar a morfologia das mitocôndrias baseado em imunomarcação e análise de imagens em tecido cerebral de camundongos in situ. Também descreve como isso permite detectar alterações na morfologia mitocondrial induzidas pela agregação de proteínas em modelos da doença de Parkinson.
As mitocôndrias desempenham um papel central no metabolismo energético das células, e sua função é especialmente importante para os neurônios devido à sua alta demanda energética. Portanto, a disfunção mitocondrial é uma característica patológica de vários distúrbios neurológicos, incluindo a doença de Parkinson. A forma e organização da rede mitocondrial é altamente plástica, o que permite que a célula responda a pistas e necessidades ambientais, e a estrutura das mitocôndrias também está intimamente ligada à sua saúde. Apresentamos um protocolo para estudo da morfologia mitocondrial in situ baseado na imunomarcação da proteína mitocondrial VDAC1 e posterior análise de imagem. Esta ferramenta poderia ser particularmente útil para o estudo de doenças neurodegenerativas porque pode detectar diferenças sutis na contagem mitocondrial e na forma induzida por agregados de α-sinucleína, uma proteína propensa à agregação fortemente envolvida na patologia da doença de Parkinson. Este método permite relatar que os neurônios dopaminérgicos da parte compacta da substância negra que abrigam lesões pS129 mostram fragmentação mitocondrial (como sugerido por sua reduzida Aspect Ratio, AR) em comparação com seus neurônios vizinhos saudáveis em um modelo de Parkinson de injeção intracraniana de fibrila pré-formada.
O sistema nervoso central tem uma intensa demanda de ATP: os neurônios usam ATP para suportar gradientes iônicos, síntese de neurotransmissores, mobilização, liberação e reciclagem de vesículas sinápticas e para permitir a tradução e degradação de proteínas locais. Mais de 95% do ATP utilizado pelo cérebro é produzido pelas mitocôndrias1. Portanto, não é surpreendente que a disfunção mitocondrial seja particularmente prejudicial aos neurônios. De fato, o comprometimento da função mitocondrial desempenha um papel importante em diversas doenças neurológicas, incluindo condições neurodegenerativas, como a Doença de Parkinson (DP) e a Doença de Alzheimer (DA)2,3.
Múltiplos genes estão inequivocamente ligados a proteínas codificadoras de DP relevantes para a função mitocondrial e homeostase, como Parkin 4,5,6, quinase 1 induzida por PTEN (PINK1)7,8 e DJ-19. Outra evidência do papel da disfunção mitocondrial na DP é que tratamentos com inibidores do Complexo I da cadeia de transporte de elétrons mitocondrial (como Rotenone e MPTP) recapitulam vários aspectos da DP in vitro e invivo10. Entretanto, é importante afirmar que muitos processos patológicos podem conduzir à perda neuronal na DP, juntamente com déficits mitocondriais: estresse oxidativo, alteração da homeostase do cálcio, falência dos sistemas ubiquitina-proteassoma e autofagia-lisossomal e agregação proteica estão entre os mais estudados (revisado em 11,12,13 e).
As mitocôndrias são heterogêneas em forma: além de unidades individuais, são comumente encontradas como redes reticulares e tubulares estendidas. A estrutura e a localização celular das mitocôndrias são críticas para sua função14; De fato, as redes mitocondriais são extremamente dinâmicas, passando por frequentes processos de fissão, fusão e mitofagia para atender às necessidades das células e responder às pistas ambientais15,16. Além disso, a morfologia das mitocôndrias está intimamente ligada ao seu estado de saúde. Por exemplo, na atrofia óptica humana, mutações genéticas que reduzem a atividade mitocondrial levam a mitocôndrias anormais, delgadas e hiperfundidas17. Por outro lado, uma variedade de doenças humanas apresenta morfologia mitocondrial aberrante, incluindo fragmentação mitocondrial ou fusão mitocondrial excessiva, que têm efeitos deletérios sobre a função mitocondrial (revisado em18). No contexto da DP, nós e outros já demonstramos que a forma mitocondrial anormal se correlaciona com disfunção em resposta a agregados de α-sinucleína19. Embora a morfologia mitocondrial tenha sido extensivamente estudada in vitro, tanto no contexto da DP quanto de outras doenças20,21,22, faltam protocolos para avaliação da morfologia mitocondrial a partir de cortes in vivo. Isso torna o estudo in vivo de mitocôndrias no contexto de doenças como a DP altamente dependente de animais transgênicos23 ou da avaliação de extratos mesencefálicos que não podem fornecer resolução celular.
Neste trabalho, é apresentado um protocolo para estudar a morfologia mitocondrial in situ como indicador de seu estado funcional e de saúde, baseado na imunomarcação da proteína mitocondrial VDAC124 seguida de análise de imagens em cortes de tecido embebidos em parafina. Mostramos também os resultados deste protocolo em modelos de DP in vitro e in vivo : células de neuroblastoma superexpressando SNCA (Synuclein Alpha) e tecido cerebral de camundongos submetidos à injeção intracraniana de α-sinucleína Pre-Formed Fibrils (PFFs). A co-imunomarcação com um anticorpo contra α-sinucleína (em células) ou fosfoSer129-α-sinucleína pS129 (em cérebros de camundongos) permitiu identificar células com patologia proteica agregada (fibrilas de α-sinucleína e α-sinucleína superexpressas, respectivamente) nas amostras, enquanto células negativas serviram como controle não patológico dentro das mesmas amostras. Através desta análise e dos dados aqui descritos, observou-se uma relação de aspecto reduzida, indicando a fragmentação das mitocôndrias em células que superexpressam a SNCA ou apresentam lesões pS129.
Todos os procedimentos descritos nesta seção foram realizados de acordo com a estrutura ética fornecida pela Universidade do País Basco Referência M20/2022/212, o Governo do País Basco, o Governo espanhol e a União Europeia.
1. Análise da morfologia mitocondrial em células SH-SY5Y que superexpressam SNCA
NOTA: Aqui, uma breve descrição da geração do material in vitro para o estudo, que servirá de comparação para os resultados obtidos in situ , é fornecida. Recomenda-se que esse tipo de análise seja realizado antes do lançamento de um experimento in vivo para morfologia mitocondrial, pois garantirá que todas as configurações apropriadas de imagem e análise estejam em vigor.
2. A geração de FPFs e injeções intracranianas de PFF em camundongos
NOTA: A geração do material de injeção e o processo de injeção intracraniana são apresentados aqui. Esse protocolo é adaptado de Luk et al.25.
3. Análise da morfologia mitocondrial por imunohistoquímica em cortes cerebrais emblocados em parafina de camundongos injetados com PFF
A fim de assegurar que as condições de imagem e análise adequadas estão em vigor para a avaliação in situ da morfologia mitocondrial no tecido, recomenda-se uma exploração in vitro da morfologia mitocondrial em resposta a um modulador conhecido da morfologia mitocondrial (Secção 1). Como exemplo, o SNCA foi geneticamente superexpresso em células SH-SY5Y para induzir alterações na morfologia mitocondrial, como descrito anteriormente26. Outros insultos que poderiam ser usados como controle para piorar a morfologia mitocondrial seriam a fome ou o uso de inibidores da atividade mitocondrial, como MPP+. As células foram transfectadas e coradas para α-sinucleína (AS) para separar as células SNCA+ (AS+) e SNCA- (AS-). Também foram corados com TOMM2027 para visualização da rede mitocondrial de células. Para tornar essa análise o mais semelhante possível à de um corte de tecido de 5 μm, um plano confocal foi analisado em oposição a uma projeção máxima de múltiplos planos. A análise morfológica de um plano confocal do TOMM20 revelou que tanto o número total de mitocôndrias quanto sua razão de aspecto ou AR (que se correlaciona com o alongamento da organela) estavam reduzidos em resposta à superexpressão da SNCA (Figura 1).
A imunomarcação foi realizada para a proteína mitocondrial VDAC1 em cortes cerebrais de camundongos com 5 μm de parafina de animais injetados com PFFs, conforme descrito na seção de protocolo acima. Os neurônios dopaminérgicos da parte compacta da substância negra (SNc), que sofrem degeneração na DP, foram revelados através da co-imunomarcação com antitirosina hidroxilase (HT) e foram separados regionalmente da área tegmental ventral e da parte lateral da substância negra. Por outro lado, a coloração antifosfoSer129-α-sinucleína (pS129) permitiu discriminar células que abrigavam lesões pS129 de células saudáveis (pS129+ versus pS129-). Imagens SNc de três animais diferentes foram obtidas, e a análise subsequente de imagens da coloração VDAC1 de neurônios TH-positivos revelou uma redução tanto da contagem do número mitocondrial quanto da razão de aspecto entre neurônios portadores de lesões pS129 e neurônios sem lesões (Figura 2). Esses resultados indicam que a morfologia mitocondrial dos neurônios que abrigam lesões pS129 está comprometida em comparação com a morfologia das células sem lesões pS129.
Embora este experimento em particular mostre uma redução na RA, destacando uma redução no alongamento das mitocôndrias juntamente com uma redução na contagem global, o que indica uma piora da morfologia mitocondrial, a interpretação dos dados deve ser dependente do experimento. Por exemplo, uma redução na RA e contagens pode apontar para uma redução global no conteúdo mitocondrial, bem como fragmentação, enquanto uma redução na RA, mas um aumento nas contagens globais apontaria para um fenótipo de fragmentação mitocondrial. Portanto, é importante interpretar os dados no contexto de ambas as medidas.
Figura 1: Morfologia mitocondrial em modelo in vitro com superexpressão de SNCA. Co-imunomarcação para TOMM20 (verde), α-sinucleína (AS, vermelho) e DAPI (azul) em células SNCA superexpressando e não superexpressando (AS+ e AS-, respectivamente) (A). Detalhe de uma célula AS- (B) e uma célula AS+ (C). Imagens em preto e branco nos painéis (B) e (C) representam as máscaras do sinal TOMM20 após a aplicação da função Fiji descrita na seção Protocolo. Esta máscara permite quantificar a forma das estruturas resultantes. As contagens mitocondriais e os valores de Aspect Ratio (AR) das células AS- e AS+ (N = 25 células por condição) foram quantificados e representados como valores individuais, bem como média ± EPM; **Valor de p < teste t de 0,05 (D). A normalidade foi avaliada pelos testes de normalidade de D'Agostino e Pearson. Barras de escala: A, 30 μm; B,C, 5 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: A morfologia mitocondrial é afetada nos neurônios que abrigam lesões pS129. Co-imunomarcação para TH (verde), VDAC1 (vermelho), fosfoS129-α-sinucleína (magenta) e DAPI (azul) do SNc de camundongos injetados com PFF (A). O detalhe de um neurônio dopaminérgico (B) fosfoS129-α-sinucleína-negativo (pS129-) e de um neurônio dopaminérgico (C) fosfoS129-α-sinucleína-positivo (pS129+). Imagens em preto e branco nos painéis (B) e (C) representam as máscaras do sinal TOMM20 após a aplicação da função Fiji descrita na seção Protocolo. Esta máscara permite quantificar a forma das estruturas resultantes. Células negativas e positivas foram contadas em amostras de três animais diferentes, como ilustrado pelas diferentes cores dos valores gráficos individuais (azul, verde e laranja). A contagem mitocondrial e a quantificação de RA de pS129- (N = 29) versus pS129+ (N = 22) em neurônios dopaminérgicos foram representadas como média ± MEV, bem como valores celulares individuais; **Valor de p < teste t de 0,05 (D). A normalidade foi avaliada pelos testes de normalidade de D'Agostino e Pearson. Barras de escala: A, 30 μm; B,C, 5 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
De modo geral, este estudo mostra que a imunomarcação combinada com a análise de imagens é um método confiável para analisar a morfologia mitocondrial. De fato, permite quantificar o número de mitocôndrias, bem como alguns parâmetros morfológicos, como a razão de aspecto em cultura celular e tecido. O número de mitocôndrias está diretamente ligado ao estado funcional dos mecanismos de fissão e fusão das amostras, enquanto o valor do RA depende do alongamento da organela. Este método pode ser particularmente valioso para a rápida avaliação das anormalidades mitocondriais em modelos de DP nos quais a morfologia, dinâmica e funções mitocondriais alteradas são mecanismos patológicos bemconhecidos28,29. A α-sinucleína também desempenha um papel relevante na DP: de fato, a α-sinucleína é um dos componentes dos Corpos de Lewy, os agregados fibrilares citoplasmáticos que são usados para o diagnóstico post-mortem de pacientes com DP30. Além disso, mutações no gene SNCA foram encontradas em pacientes com DP familiar e esporádica (revisado em31). A fosforilação da α-sinucleína no Ser129 tem demonstrado extensivamente rotular a patologia Lewy-body-like, que surge após o insulto da FPF e provoca vários efeitos tóxicos 32,26.
Usando a ferramenta aqui apresentada, pudemos detectar uma redução no número mitocondrial e nos valores de RA na presença de α-sinucleína superexpressa e agregada (células com lesões positivas para α-sinucleína e neurônios portadores de fosfoSer129α-sinucleína-positiva, respectivamente) em comparação com células sem tais lesões (células negativas para α-sinucleína e fosfoS129α-sinucleína-negativas). Esses resultados concordam com relatos anteriores que mostram como interações diretas α-sinucleína-mitocôndrias produzem efeitos tóxicos sobre a função mitocondrial e a homeostase naDP26,33 34. De fato, foi relatado que camundongos com mutações na α-sinucleína exibem aumento do dano ao DNA mitocondrial35 e da mitofagia 36,37. Além disso, foi descrito que níveis aumentados de α-sinucleína promovem fissão/fragmentação mitocondrial, induzem espécies reativas de oxigênio dentro da mitocôndria e desregulam a expressão de proteínas mitocondriais em linhagens celulares e modelos de camundongos superexpressando α-sinucleína 26,38,39.
É importante ressaltar que essa ferramenta depende muito dos anticorpos utilizados para o estudo; A avaliação morfológica cuidadosa da coloração de anticorpos utilizada é imperativa para detectar o compartimento subcelular apropriado. Como esta técnica é baseada em cortes de 5 μm e, portanto, requer planos focais únicos para a análise das estruturas mitocondriais, a ausência de um fenótipo não excluirá a existência de um fenótipo, pois é possível que diferenças sutis na morfologia mitocondrial não possam ser detectadas por este método.
Embora este trabalho e outros tenham utilizado abordagens semelhantes para avaliar a morfologia mitocondrial in vivo40, há necessidade de que um protocolo detalhado seja disponibilizado à comunidade de pesquisa para essa avaliação. A importância deste estudo é que é possível aplicar este método a vários modelos de doenças in vivo para avaliar anormalidades morfológicas mitocondriais e identificar possíveis patologias, o que pode eventualmente facilitar a triagem de compostos de chumbo para o tratamento de tais distúrbios. Embora essa análise seja atualmente limitada ao tecido embebido em parafina, a vantagem do método é que ele pode ser aplicado a qualquer modelo de doença após a coleta de tecido terminal, tornando-se uma ferramenta muito versátil.
Gostaríamos de agradecer aos financiadores deste estudo, especificamente Ikerbasque, o Ministério da Ciência e Inovação da Espanha, a Fundação Michael J Fox, o IBRO e o Centro Basco de Neurociência Achucarro.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
32 G Hamilton syringe | Hamilton | 7632-01 | |
4',6-diamidino-2-fenilindol, dihidrocloruro (DAPI) | Invitrogen | D1306 | |
4/0 USP 45 cm suture | SSa90 pga | 32345n-36u | |
Alexa fluor 488/594-Donkey anti-Mouse | Invitrogen | A21202; A21203 | green/red dye-Donkey anti-Mouse |
Alexa fluor 594/647-Donkey anti-Rabbit | Invitrogen | A21207 A31573 | red/far red dye-Donkey anti-Rabbit |
AlexaFluor 488-Donkey anti-Chicken | Jackson ImmunoResearch | 703-545-155 | green dye-Donkey anti-Chicken |
Anti-PSer129 α-synuclein EP1536Y (Rabbit) antibody | Abcam | ab51253 | |
Anti-TOM 20 (Mouse) antibody | Santa Cruz | sc-17764 | |
Anti-Tyrosine Hydroxylase (Chicken) antibody | Abcam | ab76442 | |
Anti-VDAC1 (Mouse) antibody | Santa Cruz | sc-390996 | |
Anti-α-synuclein antibody MJFR1 (Rabbit) | Abcam | ab138501 | |
Citrate buffer 100X stock: 120mM citrate buffer, 5% Tween in water (pH 6) | Home-made | ||
Disposable base mold for tissue embedding | Fisher | 22-363-553 | Plastic embedding boxes |
D-MEM F12 | Gibco | A321331020 | |
EVOS M7000 Imaging System | ThermoFisher Scientific | High-content automated fluorescence microscope | |
Fetal Bovine Serum | Gibco | 10270106 | |
Flat optical bottom 96 well plates | Greiner | 675090 | |
FluorSave Reagent | Millipore | 345789-20ML | Mounting reagent |
Glutamine 200 mM | Gibco | 25030-024 | |
ImmEdge Hydrophobic Barrier Pen | Vector Laboratories | H-4000 | PAP-pen |
Lipofectamine and Plus Reagent | Invitrogen | 11668-019; 11514-015 | Transfection reagent and transfection adjuvant |
Matrigel | Corning | 354230 | Coating matrix |
Microtome | ThermoFisher Scientific | ||
Normal Donkey Serum | Gibco | PCN5000 | |
Opti-MEM | Gibco | 31985070 | Transfection medium |
PCDNA4 plasmid (backbone) | Addgene | 41036 | |
Penicillin/Streptomycin solution | Gibco | 15140-122 | |
SH-SY5Y cells/well | ATCC | HTB-11 | |
Xylene substitute | Labbox | 22L36504 | |
Zeiss Axio Imager Apotome 2 | Carl Zeiss | Structured illumination fluorescence imaging system | |
α-synuclein peptide | rpeptide | S-1010-2 |
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