Vi er takknemlige for New York State Department of Health Wadsworth Center for å støtte dette prosjektet.

Følgende protokoll er godkjent for etisk bruk av menneskelige prøver av New York State Department of Health Wadsworth Center for analyseutvikling, protokollgodkjenningsnummer #03-019.
1. Sikkerhet
<ol><li>Ta på deg personlig verneutstyr (PPE), minimum øyevern (briller eller ansiktsskjerm), en kirurgisk maske og ikke-latekshansker.</li>
	<li>Sørg for at personell er vaksinert for rabies og at en titer på ≥0,5 IE / ml er påvist i løpet av de siste 6 månedene.</li>
<...

Rask og tidlig påvisning av rabiesantistoffer for å evaluere immunresponsen hos en pasient

<ol>
	<li>Rupprecht, C. E., Fooks, A. R., Abela-Ridder, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laboratory+Techniques+in+Rabies.+Volume+1.">Laboratory Techniques in Rabies. Volume 1.</a> World Health Organization. , 232-245 (2018).</li><li>Moore, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+of+rabies+serology:+defining+context+of+interpretation.">Challenges of rabies serology: defining context of interpretation.</a> Viruses. 13 (8), 1516 (2021).</li><li>Zajac, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+evaluation+of+a+rabies+enzyme-linked+immunosorbent+assay+(ELISA)+targeting+IgM+and+IgG+in+human+sera.">Development and evaluation of a rabies enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) targeting IgM and IgG in human sera.</a> Viruses. , 40-49 (2019).</li><li>Mills, D. J., Lau, C. L., Mills, C., Furuya-Kanamori, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+persistence+of+antibodies+and+boostability+after+rabies+intradermal+pre-exposure+prophylaxis.">Long-term persistence of antibodies and boostability after rabies intradermal pre-exposure prophylaxis.</a> Journal of Travel Medicine. 29 (2), (2022).</li><li>Ramakrishnan, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+50%+endpoint+titer+using+a+simple+formula.">Determination of 50% endpoint titer using a simple formula.</a> World Journal of Virology. 5 (2), 85-86 (2016).</li><li>Rudd, R. J., Appler, K. A., Wong, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presence+of+cross-reactions+with+other+viral+encephalitides+in+the+indirect+fluorescent-antibody+test+for+diagnosis+of+rabies.">Presence of cross-reactions with other viral encephalitides in the indirect fluorescent-antibody test for diagnosis of rabies.</a> Journal of Clinical Microbiology. 51 (12), 4079-4082 (2013).</li><li>Fooks, A. R., Jackson, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Rabies: scientific basis of the disease and its management. , (2020).</li><li>Paldanius, M., Bloigu, A., Leinonen, M., Saikku, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+Chlamydia+pneumoniae-specific+immunoglobulin+A+(IgA)+antibodies+by+the+microimmunofluorescence+(MIF)+method:+comparison+of+seven+fluorescein-labeled+anti-human+IgA+conjugates+in+an+in-house+MIF+test+using+one+commercial+MIF+and+one+enzyme+immunoassay+kit.">Measurement of Chlamydia pneumoniae-specific immunoglobulin A (IgA) antibodies by the microimmunofluorescence (MIF) method: comparison of seven fluorescein-labeled anti-human IgA conjugates in an in-house MIF test using one commercial MIF and one enzyme immunoassay kit.</a> Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 10 (1), 8-12 (2003).</li><li>Rodriguez, M. C., Fontana, D., Garay, E., Prieto, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+and+quantification+of+anti-rabies+glycoprotein+antibodies:+current+state+and+perspectives.">Detection and quantification of anti-rabies glycoprotein antibodies: current state and perspectives.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 105 (18), 6547-6557 (2021).</li><li>Katz, I. S. S., Guedes, F., Fernandes, E. R., Dos Ramos Silva, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunological+aspects+of+rabies:+a+literature+review.">Immunological aspects of rabies: a literature review.</a> Archives of Virology. 162 (1), 3251-3268 (2017).</li><li>Moore, S. M., Hanlon, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rabies-specific+antibodies:+measuring+surrogates+of+protection+against+a+fatal+disease.">Rabies-specific antibodies: measuring surrogates of protection against a fatal disease.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 4 (3), 595 (2010).</li></ol>

IFA-testen utnytter et antigen-antistoffkompleks, noe som gjør det mulig for et merkingssted å visualisere rabiesspesifikke antistoffer. Neuroblastom- eller BHK-celler blir sådd på flerbrønns PTFE-belagte mikroskopglass og inokulert med rabiesviruslaboratoriestamme CVS-11. Når monolaget er konfluent og cellene når ønsket smittsomhet på ca. 50%, lagres lysbildene til de er klare til bruk6.
Pasientserum eller CSF påføres det infiserte cellemonolaget og inkubere...

Rabies indirekte fluorescerende antistoff (IFA) test brukes til å oppdage ulike rabiesspesifikke antistoffisotyper i sera eller cerebral spinalvæske. Det er en av et arsenal av tester tilgjengelig for overvåking av en antemortem rabies pasient. Det er spesielt nyttig for tidlig påvisning av antistoffer for å evaluere pasientens immunrespons mot rabiesinfeksjon. Når den brukes sammen med andre tester, sakshistorie og pasientens vaksinasjonsstatus, kan IFA-testen hjelpe til med å bestemme eksponering for rabiesvirus eller en vaksine1. Som IFA-testen måler IgM og / eller IgG, kan verdiene av det spesifikke antistoffet indikere en omtrentlig tidsramme fra eksponering for antigenet1. Denne testen kan være nyttig i de listede applikasjonene eller andre som ennå ikke er utforsket.
Det finnes flere rabieserologiske analyser. Den raske fluorescerende fokusinhiberingstesten (RFFIT), fluorescerende antistoffvirusnøytraliseringstest (FAVN) eller modifikasjoner av disse er de primære metodene for å måle rabiesvirusnøytraliserende antistoffer (RVNA)1. Imidlertid skiller disse testene ikke IgM- og IgG-antistoffer. Når differensiering av antistoffisotype er viktig for å overvåke rabiesimmunresponsen, brukes rabies IFA og rabies enzymbundet immunosorbentanalyse (ELISA) tester, men de måler ikke RVNA. Selv om IFA- og ELISA-testene kan brukes til å bestemme tilstedeværelsen av rabiesspesifikke antistoffer i en prøve, er det noen forskjeller i hvordan de utføres. IFA-testen benytter et cellekulturert levende virus som antigensubstrat, mens en typisk ELISA for rabiesdeteksjon bruker ett eller flere av virusproteinene. I en laboratorieinnstilling hvor rabiesviruset kan dyrkes, kan IFA-testen lettere utføres i stedet for å kjøpe eller dyrke individuelle virale proteiner for ELISA. Formålet med testingen og informasjonen som er oppnådd fra resultatene av en hvilken som helst rabieserologisk analyse, bør vurderes når man bestemmer hvilken som skal velges2.
IgM er den første som reagerer, og øker til klassebytte observeres rundt dag 28, da IgG blir det dominerende sirkulerende antistoffet3. Derfor vil IgM bare forventes i en begrenset periode etter eksponering for rabiesvirus eller vaksinasjon. Testing av både serum og cerebrospinalvæske (CSF) kan indikere om eksponeringen var gjennom vaksinasjon, der antistoffer bare ville bli sett i sera, eller fra en virusinfeksjon, som potensielt ville vise antistoffer i CSF1.
Det er fastslått at rabiesantistoffer vedvarer i flere år etter preeksponeringsprofylakse (PrEP)4. IFA-testen kan være et nyttig verktøy for å demonstrere dette på forskjellige tidspunkter etter vaksinasjon eller eksponering.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>25x55mm glass cover slips</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human IgG Labeled Conjugate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F9512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human IgM Labeled Conjugate</td>
			<td>SeraCare</td>
			<td>5230-0286</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aspirating pipette tip</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BHK-21 Cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BION IFA Diluent</td>
			<td>MBL BION</td>
			<td>DIL-9993</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture water</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>W3500</td>
			<td>EGM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coplin Jars</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F2442</td>
			<td>EGM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent microscope with FITC filter</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7893</td>
			<td>Mountant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gullsorb IgM inactivation reagent</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>23-043-158</td>
			<td>IgG Inactivation Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G-7513</td>
			<td>EGM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minimum Essential Media Eagle &#8211; w/Earle&#8217;s salts, L-glutamine, and non-essential amino acids, w/o sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M0643</td>
			<td>EGM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Neuroblastoma Cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-well Teflon coating glass slides</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
			<td>pH 7.6&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P-3032</td>
			<td>EGM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabies Direct Fluorescent Antibody Conjugate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>5100, 5500 or 6500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S-5761</td>
			<td>EGM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride crystals</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5886</td>
			<td>Mountant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile dropper</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptomycin sulfate salt</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9137</td>
			<td>EGM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma pre-set crystals pH 9.0</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9693</td>
			<td>Mountant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptose Phosphate Broth</td>
			<td>BD</td>
			<td>260300</td>
			<td>EGM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitamin mix</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M6895</td>
			<td>EGM</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of rabies igg and igm antibodies using the rabies indirect fluorescent antibody test

Rabies indirekte fluorescerende antistoff (IFA) -testen ble utviklet for å oppdage forskjellige rabiesspesifikke antistoffisotyper i sera eller cerebral spinalvæske. Denne testen gir raske resultater og kan brukes til å oppdage rabiesantistoffer i flere forskjellige scenarier. Rabies IFA-testen er spesielt nyttig for rask og tidlig påvisning av antistoffer for å evaluere immunresponsen hos en pasient som har utviklet rabies. Selv om andre metoder for antemortem rabiesdiagnose har forrang, kan denne testen brukes til å demonstrere nylig rabiesviruseksponering gjennom antistoffdeteksjon. IFA-testen gir ikke et virusnøytraliserende antistoff (VNA) titer, men preeksponeringsprofylakse (PrEP) respons kan evalueres gjennom positiv eller negativ antistofftilstedeværelse. Denne testen kan brukes i ulike situasjoner og kan gi resultater for en rekke ulike siktemål. I denne studien brukte vi flere parrede serumprøver fra personer som fikk PrEP og demonstrerte deres rabiesantistofftilstedeværelse over tid ved bruk av IFA-testen.

The rabies indirect fluorescent antibody (IFA) test is used to detect various rabies-specific antibody isotypes in sera or cerebral spinal fluid. It is one of an arsenal of tests available for monitoring an antemortem rabies patient. It is especially useful for the early detection of antibodies to evaluate a patient's immune response to rabies infection. When used in conjunction with other tests, case history, and the patient's vaccination status, the IFA test can assist in determining exposure to rabies virus or a vaccine1. As the IFA test measures IgM and/or IgG, the values of the specific antibody can indicate an approximate time frame from exposure to the antigen1. This test may be useful in the listed applications or others not yet explored.
There are several rabies serological assays available. The rapid fluorescent focus inhibition test (RFFIT), fluorescent antibody virus neutralization (FAVN) test, or modifications of these are the primary methods for measuring rabies virus neutralizing antibodies (RVNAs)1. However, these tests do not differentiate IgM and IgG antibodies. When differentiating antibody isotype is important in monitoring the rabies immune response, the rabies IFA and the rabies enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) tests are used, but they do not measure RVNAs. Although the IFA and ELISA tests can be used to determine the presence of rabies-specific antibodies in a sample, there are some differences in how they are executed. The IFA test utilizes a cell-cultured live virus as its antigen substrate, whereas a typical ELISA for rabies detection uses one or more of the viral proteins. In a laboratory setting where the rabies virus can be cultured, the IFA test may be more easily performed instead of purchasing or cultivating individual viral proteins for the ELISA. The purpose of testing and the information garnered from the results of any rabies serological assay should be considered when determining which to choose2.
IgM is the first to respond, increasing until class switching is observed at around day 28, at which point IgG becomes the predominant circulating antibody3. Hence, IgM would only be expected for a limited amount of time following exposure to rabies virus or vaccination. Testing both serum and cerebrospinal fluid (CSF) can indicate if the exposure was through vaccination, in which antibodies would be seen only in sera, or from a viral infection, which would potentially show antibodies in CSF1.
It has been established that rabies antibodies persist for several years following pre-exposure prophylaxis (PrEP)4. The IFA test can be a useful tool to demonstrate this at different time points following vaccination or exposure.

Forfatter Spotlight: Rabies-spesifikke antistoffisotyper deteksjon i sera eller cerebral spinalvæske ved bruk av en IFA-test 

Påvisning av Rabies IgG og IgM antistoffer ved hjelp av Rabies indirekte fluorescerende antistoff test

The IFA test assesses antibody response during rabies infection or evaluates the immune response from vaccines. It can be used to establish antibody presence in a sample and distinguish which antibody isotypes are present. Neutralizing antibody assays are the gold standard for rabies antibody detection to assess antibody titer in a person who has received pre or post-exposure prophylaxis.Although an IFA test may yield different results than a neutralizing antibody assay, it can still provide valuable information when used as an alternative. Typically, assays that measure rabies neutralizing antibodies evaluate immune response. However, these tests take multiple days, requiring virus and live cell culture.The IFA test allows advanced preparation of antigen slides for testing with results in a few hours compared to days. Using the IFA tests in human rabies cases may lead to more answers about how an individual's immune system responds to rabies infection. There is great variation amongst cases, and this test can provide results in a real-time manner during the disease.

Alle serumprøver ble samlet inn fra pasientene på omtrent samme tidsramme etter PrEP. Prøvene ble testet fra fem forskjellige pasienter på følgende tidspunkter: 2 uker etter den endelige rabiesvaksineinokulasjonen, 6 måneder etter rabiesvaccineserien og 18 måneder etter rabiesvaccineserien. Hver serumprøve ble fortynnet i serier og gradert for både IgM- og IgG-tilstedeværelse, som beskrevet i protokolltrinn 5.2 og 5.3. Den tildelte antistoffverdien representerer fortynningsfaktoren der prøven nådde et sluttpu...

Watch this Scientific Journal Video about Rabies-Specific Antibody Isotypes Detection in Sera or Cerebral Spinal Fluid Using an IFA Test at JoVE.com

Målet med dette manuskriptet er å undersøke bruken av rabies indirekte fluorescerende antistofftest for påvisning av rabiesspesifikke IgG- og IgM-antistoffer.

The rabies indirect fluorescent antibody (IFA) test was developed to detect various rabies-specific antibody isotypes in sera or cerebral spinal fluid. ...

IFA-testen vurderer antistoffrespons under rabiesinfeksjon eller evaluerer immunresponsen fra vaksiner. Det kan brukes til å etablere antistofftilstedeværelse i en prøve og skille hvilke antistoffisotyper som er tilstede. Nøytraliserende antistoffanalyser er gullstandarden for påvisning av rabiesantistoffer for å vurdere antistofftiter hos en person som har fått pre- eller posteksponeringsprofylakse.Selv om en IFA-test kan gi forskjellige resultater enn en nøytraliserende antistoffanalyse, kan den fortsatt gi verdifull informasjon når den brukes som et alternativ. Vanligvis analyser som måler rabies nøytraliserende antistoffer evaluere immunrespons. Imidlertid tar disse testene flere dager, og krever virus og levende cellekultur.IFA-testen tillater avansert klargjøring av antigen-lysbilder for testing med resultater på få timer sammenlignet med dager. Ved hjelp av IFA-tester i menneskelige rabies tilfeller kan føre til flere svar om hvordan individets immunsystem reagerer på rabiesinfeksjon. Det er stor variasjon mellom tilfellene, og denne testen kan gi resultater i sanntid under sykdommen.

Påvisning av Rabies IgG og IgM antistoffer ved hjelp av Rabies indirekte fluorescerende antistoff test

Abstract