עבודה זו נתמכה על ידי R01AR075773 ל- GAM.

כימות חדירת שומן בשרירי השלד באמצעות דה-צלולריזציה

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

כתב יד זה מתאר שיטות לדמיין ולכמת באופן איכותי הסננה של שומן בשרירי השלד במודלים של בעלי חיים קטנים, שניתן ליישם כדי להבין עוד יותר את הפתוגנזה של התפתחות רקמת שומן תוך שרירית (IMAT) והתרחבות פתולוגית. השימוש בדה-צלולריזציה של כל השרירים וצביעה מסיסים בשומנים מאפשר מתודולוגיה חסכונית, ניתנת לשחזור ופשוטה להערכה מקיפה של נוכחות IMAT בשרירים שלמים. 
הבסיס לפרוטוקול זה הוא שדה-צלולריזציה של שריר עם SDS מסירה את המרכיבים התאיים של מיופייבר, כולל טיפות השומנים הקטנות של IMCL, אך חוסכת את טיפות השומנים הגדולות באדיפוציטים תוך-תאיים. SDS נמצא בשימוש נרחב42 בהנדסת רקמות כדי לבצע דה-צלולריזציה של מטריצות. רקמות כגון שומן ושרירי השלד דורשות בדרך כלל דיסוציאציה מכנית נוספת ו / או מיצוי אלכוהול כדי להסיר את שאריות שומני האדיפוציט42,43. הראינו בעבר כי הסיבה לכך היא כי בעוד decellularization עם SDS מבטל IMCL, זה חוסך את טיפת שומנים גדולה אדיפוציט37. הדמיה של שריר שלם מוכתם בטטרוקסיד אוסמיום לפני ואחרי decellulariztion עם μCT אימתה כי התבנית המרחבית של IMAT לא הופרעה על ידי דה-צלולריזציה. יתר על כן, כימות טריגליצרידים תוך שרירי בשריר נטול תאים עם IMAT זניח היה ~ 5% מערכי השרירים השלמים, מה שאימת את הסרת IMCL. לכן, מתודולוגיה זו שומרת על טיפות שומנים IMAT בפיזור האנטומי המקורי שלהן באמצעות מטריצת שרירים שקופה למחצה.
דה-צלולריזציה נכונה היא השלב הקריטי ביותר בפרוטוקול זה. אם הדה-צלולריזציה אינה שלמה, יהיה קשה לדמיין טיפות שומנים ב-IMAT ו-IMCL שיורי יגרום לצביעת רקע גבוהה עם ORO או BODIPY (איור 2). טעויות נפוצות של משתמשים לא מנוסים הן כיסוי SDS לקוי לכל שריר (בתוך כל באר), כך שכל שריר אינו מכוסה לחלוטין בתמיסת SDS, לא משתמש בנדנדה כדי לעורר את התמיסה במהלך דה-צלולריזציה, ולא מבצע שינויי תמיסה בתדירות מספקת. בכתב יד זה, המלצנו על כמות SDS הדרושה ליחידת מסת שריר, אך המשתמש עדיין יצטרך לוודא שהשרירים מכוסים לחלוטין בתמיסות, שכן לכל שריר יש גיאומטריה ייחודית. כמו כן, מומלץ למשתמשים להחליף את הפתרונות באופן חופשי (עד פעמיים ביום) כדי להבטיח שהדה-סלולרזציה תושלם. צביעה באיכות טובה של טיפות שומנים IMAT הושגה לאחר עד 4 ימים של טיפול SDS. לקבלת תוצאות צביעת ORO באיכות גבוהה, קיבוע הולם והכנת פתרון ORO חשובים גם הם. בדומה לטיפול SDS שתואר לעיל, יש צורך בכיסוי הולם של תמיסת פורמלדהיד 3.7% לכל דגימת שריר. אם השריר מוסר מהקיבוע מוקדם מדי, טיפות שומנים יכתימו רק חלש עם ORO. סה"כ 1-2 שעות אמור להספיק, אך מומלץ לבצע קיבוע בן לילה כדי להבטיח שהקיבוע חודר למרכז השריר ומקבע באופן מלא את כל טיפות השומנים. אתגר נוסף עם צביעת ORO הוא שכאשר ריכוז האלכוהול מופחת ל -60%, חלקיק מתחיל להיווצר. חלקיק זה יכול להתיישב על פני השטח ולהיתקע על גבול השריר. הדרך הטובה ביותר להימנע מכך היא ליצור פתרון עבודה רענן לכל צביעה ולהשתמש הן במסננים של 40 מיקרומטר רשת והן במסננים של 0.22 מיקרומטר. לאחר מכן, שמירה על תסיסה עם הנדנדה והגבלת זמן הכתמים ל -10 דקות יעזרו למנוע מכל חלקיק שנוצר לשקוע. אם הבעיה נמשכת, יצירת פתרון חדש של מניית ORO עשויה לעזור. אם חפץ כלשהו נשאר דבוק למשטח השריר נטול התא, ניתן להשתמש במיקרוסקופ סטריאו, מלקחיים ומספריים כירורגיים כדי להסיר את החפץ הזה. כישלון בחיסול ממצאים ישפיע על איכות התמונה של השרירים והערכת יתר של תוכן IMAT במהלך חלק מיצוי השומנים כהכנה לקריאת OD. 
בסך הכל, טכניקה זו היא פשוטה ומציעה מספר יתרונות על פני שיטות תקן זהב להדמיה וכימות של חדירת שומן שרירי השלד. טכניקות לא פולשניות, כגון CT, MRI ו- US, שנמצאות בשימוש נרחב בבני אדם ולעיתים במודלים של בעלי חיים, הן בעלות רזולוציה מרחבית מוגבלת ואינן מסוגלות להבחין בין טיפות שומנים לסיבי שריר. לפיכך, פיקסל או ווקסל בעוצמת אות ביניים מוקצה כ"שריר" או "שומן", בעוד שבפועל סביר להניח שמדובר בשילוב של מיופייבר ואדיפוציטים. בדרך כלל, חדירת שומן בשריר בעלי חיים מוערכת על ידי היסטולוגיה, לרוב על ידי ORO בהקפאת שרירים. עם זאת, זה מבוצע בדרך כלל רק בקטע מייצג אחד וקשה לכמת אותו בגלל פיזור שומנים על פני הסעיף. לעומת זאת, צביעת ORO של שריר שלם נטול תאים מספקת הערכה מקיפה של IMAT עם עלויות ומאמץ דומים למורפולוגיה שלמה. יתר על כן, בנוסף לשיפור ההדמיה, צביעת ORO של דה-צלולריזציה מאפשרת כימות של חדירת שומן על ידי מיצוי שומנים. לצלילה עמוקה יותר לתוך התכונות של חדירת שומן, כתם פלואורסצנטי, BODIPY, ניתן להשתמש בשילוב עם מיקרוסקופ קונפוקלי. זה מאפשר שחזור של טיפות שומנים IMAT בודדות כדי למפות את הנוף התלת-ממדי, דבר שאינו אפשרי עם היסטולוגיה אלא אם כן מנותחים חלקים לאורך השריר. בעוד מיקרוסקופ קונפוקלי אינו ציוד מעבדה סטנדרטי, סביר יותר שהוא יהיה נגיש בסביבה אוניברסיטאית או תעשייתית מאשר MRI או CT של בעלי חיים קטנים. יתר על כן, חלק גדול מתהליך זה יכול להיות אוטומטי, הפחתת עלות הזמן בהשוואה להיסטולוגיה רציפה. אופטימיזציה של ההגדרות במיקרוסקופ קונפוקלי היא שיקול נוסף לצביעת BODIPY. אלה ייחודיים לכל מיקרוסקופ. הערך הקריטי הוא עוצמת הלייזר, שחייבת להיות גבוהה מספיק כדי לזהות את טיפות השומנים על פני השטח המרוחקים של השריר וגם לא להרוות את האות מטיפות השומנים בצד הקרוב. בגלל זה, מוצע כי באמצעות צביעת BODIPY עם מיקרוסקופ קונפוקלי הוא המתאים ביותר על שרירים דקים יותר, כולל EDL או הסרעפת. 
מספר מגבלות של גישה זו מצדיקות דיון. ראשית, בעוד שצפוי שלטכניקה זו ישימות רחבה מעבר למודלים של פציעה (קרדיוטוקסין וגליצרול) בעכברים המוצגים כאן, יישומים חדשים (למשל, מודל MDX) עשויים לדרוש אופטימיזציה, שכן גודל והרכב השריר (למשל, פיברוזיס) עשויים להשפיע על דה-צלולריזציה, הדורשת ריכוז SDS מוגבר או זמני דגירה. מודלים אחרים של מחלות עם שינוי במסת השריר ידרשו גם ניתוח של מדדים מוחלטים ומנורמלים (למסת שריר) של הסננה שומנית כדי לקבוע את הכמות האבסולוטית של שומנים או אחוז שומנים ביחס לנפח השריר כדי לספק מדד תוצאה משמעותי יותר. יתר על כן, טכניקה זו צפויה להיות ישימה באופן נרחב עבור מודלים גדולים יותר של בעלי חיים וביופסיות אנושיות, אבל זה עשוי לדרוש אופטימיזציה עבור כל יישום חדש. שנית, באסטרטגיה זו, השריר כולו חייב להיות מוקדש לבדיקה זו ולא ניתן להשתמש בו כדי להעריך תכונה פתולוגית אחרת. מחקרים שמטרתם להעריך שינויים אורכיים ב- IMAT מוגשים טוב יותר עם טכניקות הדמיה לא פולשניות ומחקרים שמטרתם העיקרית דורשת את השריר למטרות אחרות (היסטולוגיה, תגובת שרשרת פולימראז כמותית, כתם מערבי) מקבלים שירות טוב יותר על ידי הערכה היסטולוגית, שכן ניתן להקצות את שאר השריר הקפוא לבדיקות אחרות. עם זאת, בדיקה זו מתאימה היטב לזיווג עם בדיקות in vivo, כגון ריצת הליכון, או בדיקת כיווץ ex vivo , שכן אמצעים אלה יכולים להתבצע לפני decellularization44. שלישית, למרות שהשימוש בכתם BODIPY עם מיקרוסקופ קונפוקלי מספק הדמיה וכימות ברזולוציה גבוהה של טיפות שומנים, הוא אינו יכול לזהות באופן חד משמעי טיפות שומנים כאדיפוציטים בודדים, כאשר קרום התא מוסר וחלבוני אדיפוציט אנדוגניים אובדים. אדיפוציטים מולטילוקולריים, המייצגים אדיפוציטים לא בשלים או פנוטיפ "חום/בז'", עשויים להיות מזוהים כטיפות שומנים מרובות. לבסוף, הפרוטוקול לא עובד טוב על שריר קפוא בעבר. מגבלות אלה הן כנראה העמוקות ביותר עבור ביופסיות אנושיות, שכן בעוד הביופסיה כולה יכולה להיות decellularized, ההתפלגות המרחבית של IMAT בביופסיה לא צפוי להיות מייצג יותר של השריר כולו מאשר פרוסה היסטולוגית. עם זאת, מכיוון שטכניקה זו אינה רגישה יחסית לתנאי טיפול בביופסיה לא קפואה (למשל, שעות על קרח ב- PBS), ניתן לחלק את הביופסיה מאוחר יותר לבדיקות שונות, כולל חלק לדצלולריזציה, אשר יספק רזולוציה טובה יותר של טיפות שומנים בודדות.
לסיכום, פותחה שיטה חדשנית לניתוח איכותי וכמותי של חדירת שומן בשרירי השלד על ידי צביעה והדמיה של השומנים השמורים של מבנים דה-תאיים. מתודולוגיה זו מציעה שיפורים לעומת גישות סטנדרטיות זהב, בכך שהיא מאפשרת הדמיה מקיפה של חדירת שומן תלת מימדית בתוך שריר וכימות מהיר וזול עם צביעת ORO. למדידות מפורטות יותר, כתם BODIPY מסיס שומנים שני מספק כימות מפורט יותר של מספר טיפות השומנים, נפחם ותבנית הפיזור, כפי שצולם במיקרוסקופ קונפוקלי. יחד, אמצעים אלה מספקים לחוקרים דרך למדוד במדויק את חדירת השומן בשרירי השלד ברמת טיפות השומנים הבודדות ללא דגימה או הדמיה לא פולשנית יקרה.

הצטברות של אדיפוציטים בין שרירי שריר השלד היא מאפיין בולט של מצבים שונים, מסוכרת מסוג 2, דרך סרקופניה ועד פגיעה בשרירים ושלד 1,2,3,4,5,6,7. הערכה מקיפה של רקמת שומן תוך שרירית זו (IMAT) היא קריטית להבנת הפתוגנזה של מצבים אלה, שכן תצהיר IMAT נמצא בקורלציה חזקה עם עמידותלאינסולין 3,8,9,10 ותפקוד שרירי שלד לקוי 11,12,13,14,15 . למרות שקשרים אלה צוינו במשך עשרות שנים, המנגנונים הקשורים ל- IMAT ומקורו עדיין נותרו תחום של חקירה אינטנסיבית. זאת בין היתר משום שרוב המחקרים להערכת חדירת שומן בשרירי השלד בוצעו בבני אדם, שם החקירות המכניסטיות מוגבלות16,17. עם זאת, לאחרונה, מודלים של בעלי חיים קטנים, כולל עכברים, שימשו כדי לסייע באיתור ויסות תאי של התפתחות IMAT ואיתות18,19,20. עבודה זו נועדה לספק כלי חדש לשימוש עם מודלים של בעלי חיים קטנים להדמיה איכותית וכימות של חדירת שומן בשרירי השלד.
מבחינה קלינית באוכלוסיות אנושיות, הסננה שומנית מוערכת בשיטות לא פולשניות, כולל טומוגרפיה ממוחשבת (CT) 6,21, דימות תהודה מגנטית (MRI) 16,17,22,23, ואולטרסאונד (US)17,24. טכניקות הדמיה אלה בדרך כלל מזהות אזור עניין מוגדר (ROI) בשריר ורוכשות פרוסות תמונה בתוך אזור זה, אם כי גישות מקיפות שימשו גם 25,26,27. פרוסות תמונה אלה כפופות לדירוג איכותי6 ומכומתות באמצעות סף פיקסלים28. גישות דומות יושמו בעבר בבעלי חיים29,30; עם זאת, הם יקרים ודורשים גישה למערכות הדמיה של בעלי חיים קטנים. רזולוציה מרחבית באמצעות שימוש ב- CT ו- MRI מציגה גם בעיה מרכזית, מכיוון שהם אינם מסוגלים להפריד אדיפוציטים IMAT מסיבי שרירי השלד בתוך ווקסל ובמקום זאת מסתמכים על הפרדה סובייקטיבית של אזורי שריר בעיקר ובעיקר אזורי IMAT31,32. ככזה, חוסר היכולת לזהות במדויק שומן או רקמת שריר מציג גם כימות לא מדויק של כמויות מייצגות של רקמות אלה.
בשל מגבלות אלה, הטכניקות הנוכחיות להערכת חדירת שומן בשרירי השלד במודלים של בעלי חיים קטנים מסתמכות בדרך כלל על היסטולוגיה כחלופה זולה ונגישה33,34. הליכי צביעה סטנדרטיים, כולל המטוקסילין ואאוזין (H&E), שמן אדום O (ORO), וצביעה חיסונית לסמני אדיפוציט כגון פריליפין, מאפשרים זיהוי והדמיה פשוטים של אדיפוציטים הכוללים חדירת שומן בתוך השריר. עם זאת, גישות היסטולוגיה הן לעתים רחוקות מקיפות, ובדרך כלל, הערכה איכותית או כמותית של IMAT מוגבלת לסעיף34 יחיד. מיצוי שומנים שימש גם לכימות סך שומני השריר35; עם זאת, טכניקה זו אינה מצליחה להבחין בין שומנים תוך שריריים (IMCL) לבין מאגרי רקמת שומן תוך שרירית (IMAT)36. לסיכום, המתודולוגיות הנוכחיות לדמיין ולכמת שומן בשריר נותרו מוגבלות על ידי עלויות כספיות או זיהוי ספציפי של IMAT.
כאן, אנו מתארים שיטה מפורטת להערכת הסננה שומנית בשרירי השלד הן על ידי הדמיה איכותית והן על ידי כימות רב-ממדי. מתודולוגיה זו משתמשת בטכניקת דה-צלולריזציה פשוטה המסירה מבנים מיותאיים, כולל IMCL, אך שומרת על טיפות השומנים הגדולות יותר שמקורן באדיפוציט IMAT ללא פגע. אימות הספציפיות של טכניקה זו פורסם37, כולל שימוש במיצוי שומנים כדי להראות את הדלדול של IMCL עם דה-צלולריזציה, μCT כדי להראות את השימור של דפוסי IMAT עם דה-צלולריזציה, והיסטולוגיה כדי להראות את התפלגות הגודל הדומה של טיפות שומנים IMAT בהשוואה לאלה שזוהו עם דה-צלולריזציה. לאחר ביטול התא, ניתן להכתים את השרירים בצבעים מסיסים בשומנים לצורך הדמיה איכותית של הדפוס ומידת ההסננה השומנית ו/או הדמיה כמותית של טיפות שומנים בודדות של IMAT. לאחר מכן ניתן לחלץ צבעים עם איזופרופנול, וניתן להשתמש בצפיפות האופטית (OD) של התמיסה המתקבלת כדי להעריך את נפח השומנים של IMAT. האימות המחמיר של טכניקה זו פורסם במקום אחר37. מאמר זה מספק פרוטוקול מפורט לשימוש במתודולוגיה זו עם שרירי עכבר ומספק עצות לפתרון בעיות לתמיכה באימוץ שיטה זו ביישומים אחרים, כגון שרירים ממינים אחרים או רקמות אחרות.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m Syringe Filter</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SLGP033RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL LuerLock Syringes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14823434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 mm Coverslips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12545F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 well plates</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-772-29</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well plates</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-772-1H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Propanol (Isopropanol)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>I9516</td>
			<td>0.5 mg/mL stock solution can be stored at room temperature for 1 month.&#160; Working solution must be made fresh.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37% Formaldehyde Solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>8187081000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 &#181;m Mesh Filter</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>87711</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 well plates</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-772-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well plates</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-772-2C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BODIPY 493/503</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D-3922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6J Mice</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>000664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Imaging Dish</td>
			<td>VWR</td>
			<td>734-2905</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>TCS SPEII</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting/stereo Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>4107009123001000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14060-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11254-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>033361.K2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matlab</td>
			<td>Mathworks</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oil Red O Powder</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>O0625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate reader</td>
			<td>Bio-tek</td>
			<td>Synergy II&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rocker/Shaker</td>
			<td>Reliable Scientific</td>
			<td>55D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L3771</td>
			<td>1% Solution can be stored at room temperature for 1 month</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer pipettes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>137119D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas spring scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15000-00</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

decellularization-based quantification of skeletal muscle fatty infiltration

חדירת שומן היא הצטברות של אדיפוציטים בין שרירי שרירי השלד והיא מאפיין בולט של מיופתיות רבות, הפרעות מטבוליות וניוון. מבחינה קלינית באוכלוסיות אנושיות, הסננה שומנית מוערכת בשיטות לא פולשניות, כולל טומוגרפיה ממוחשבת (CT), דימות תהודה מגנטית (MRI) ואולטרסאונד (US). למרות שמחקרים מסוימים השתמשו ב- CT או MRI כדי לכמת הסננה שומנית בשריר העכבר, עלויות ורזולוציה מרחבית לא מספקת נותרו מאתגרות. שיטות אחרות של בעלי חיים קטנים משתמשות בהיסטולוגיה כדי לדמיין אדיפוציטים בודדים; עם זאת, מתודולוגיה זו סובלת מהטיה דגימה בפתולוגיה הטרוגנית. פרוטוקול זה מתאר את המתודולוגיה לצפייה איכותית ומדידה כמותית של חדירת שומן באופן מקיף לאורך שרירי עכבר שלמים וברמת האדיפוציטים הבודדים באמצעות דה-צלולריזציה. הפרוטוקול אינו מוגבל לשרירים ספציפיים או למינים ספציפיים וניתן להרחיב אותו לביופסיה אנושית. בנוסף, ניתן לבצע הערכות איכותיות וכמותיות ברוטו עם ציוד מעבדה סטנדרטי בעלות נמוכה, מה שהופך הליך זה לנגיש יותר במעבדות מחקר.

The accumulation of adipocytes between myofibers within the skeletal muscle is a prominent feature of disparate conditions, from type 2 diabetes to sarcopenia to musculoskeletal injury1,2,3,4,5,6,7. Comprehensive assessment of this intramuscular adipose tissue (IMAT) is critical to understanding the pathogenesis of these conditions, as IMAT deposition is strongly correlated with insulin resistance3,8,9,10 and poor skeletal muscle function11,12,13,14,15. Although these associations have been noted for decades, the mechanisms associated with and the origin of IMAT still remain an area of intense investigation. This is partly because most studies assessing skeletal muscle fatty infiltration have been performed in humans, where mechanistic investigations are limited16,17. However, more recently, small animal models, including mice, have been utilized to help pinpoint cellular regulation of IMAT development and signaling18,19,20. This work aims to provide a new tool for use with small animal models for qualitatively visualizing and quantifying skeletal muscle fatty infiltration.
Clinically in human populations, fatty infiltration is assessed using noninvasive methods, including computed tomography (CT)6,21, magnetic resonance imaging (MRI)16,17,22,23, and ultrasound (US)17,24. These imaging techniques typically identify a defined region of interest (ROI) in a muscle and acquire image slices within that region, although comprehensive approaches have also been employed25,26,27. These image slices are subjected to qualitative grading6 and quantified via pixel thresholding28. Similar approaches have been utilized in animals previously29,30; however, they are costly and require access to small animal imaging systems. Spatial resolution via CT and MRI use also presents a major issue, as they are unable to delineate IMAT adipocytes from skeletal muscle fibers within a voxel and instead rely on subjective separation of primarily muscle regions and primarily IMAT regions31,32. As such, the inability to accurately identify fat or muscle tissue also presents inaccurate quantification of representative amounts of these tissues.
Due to these limitations, current techniques to assess skeletal muscle fatty infiltration in small animal models most commonly rely on histology as an inexpensive and accessible alternative33,34. Standard staining procedures, including hematoxylin and eosin (H&#38;E), oil red O (ORO), and immunostaining for adipocyte markers such as perilipin, allow for simple detection and visualization of adipocytes comprising fatty infiltration within the muscle. However, histology approaches are rarely comprehensive, and typically, IMAT qualitative or quantitative assessment is limited to a single section34. Lipid extraction has also been used to quantify total muscle lipids35; however, this technique fails to distinguish between intramyocellular lipid (IMCL) and intramuscular adipose tissue (IMAT) stores36. In summary, current methodologies to visualize and quantify fat in muscle remain limited either by financial costs or the specific detection of IMAT.
Here, we describe a detailed method for assessing skeletal muscle fatty infiltration both by qualitative visualization and multi-scale quantification. This methodology employs a simple decellularization technique that removes myocellular structures, including IMCL, but keeps the larger IMAT adipocyte-derived lipid droplets intact. Validation of the specificity of this technique has been published37, including using lipid extraction to show the depletion of IMCL with decellularization, &#181;CT to show the retention of IMAT patterning with decellularization, and histology to show the similar size distribution of IMAT lipid droplets compared with those identified with decellularization. Once decellularized, muscles can be stained with lipid-soluble dyes for qualitative visualization of the pattern and the extent of fatty infiltration and/or quantitative imaging of individual IMAT lipid droplets. Dyes can subsequently be extracted with isopropanol, and the optical density (OD) of the resulting solution can be used to estimate the IMAT lipid volume. The stringent validation of this technique has been published elsewhere37. This article provides a detailed protocol to use this methodology with mouse muscles and provides troubleshooting tips to support the adoption of this method in other applications, such as muscles from other species or other tissues.

מחבר זרקור: כימות מבוסס דה-צלולריזציה של חדירת שומן בשרירי השלד  

כימות מבוסס דה-צלולריזציה של חדירת שומן בשרירי השלד

We are interested in crosstalk between contracting muscle and the adipocytes that form between muscle fibers in injury and disease called intramuscular adipose tissue, or IMAT. Genetic engineering in cells in mice is a powerful tool for mechanistically dissecting fat muscle crosstalk. Analysis of signaling via transcriptomics and proteomics identifies mediators, and then biomaterial based drug delivery can intervene in these pathways.One of the primary challenges is isolating and quantifying IMAT adipocytes. Especially in small animal models, the IMAT signal is washed out by whole muscle analysis like transcriptomics or lipidomics, and quantifying IMAT by noninvasive imaging suffers from similar washout, as most voxels contain a mixture of muscle and IMAT. We recently used this technique described in this article to demonstrate that IMAT directly impairs muscle contractility.With precise measures of IMAT deposition, we showed that it does not just replace contractile material, but impedes a contraction in the remaining lean muscle. This protocol addresses challenges with quantifying IMAT. The current standard to measure IMAT in small animals is single section histology, which is not comprehensive or non-invasive imaging, which is expensive and low resolution.We believe this has limited our understanding of IMAT muscle crosstalk. This technique provides a comprehensive and inexpensive method for assessing IMAT by qualitative visualization and multi-scale quantification. We hope this technique's simplicity will encourage more investigators to measure IMAT in their animal models.Also, this technique will provide a higher precision tool for the investigators interested in IMAT to uncover more subtle relationships between IMAT adipocytes and other cells.

הדמיה איכותית של הסננה שומנית בשרירי השלד שרירים נטולי תאים כראוי הם לבנים ושקופים למחצה (סעיף 1; איור 1). כאשר שרירים דה-צלולריים מוכתמים ב-ORO כדי להמחיש IMAT (סעיף 2), טיפות שומנים של IMAT ניכרות בתוך מבני השרירים השקופים ככדורים אדומים (איור 1). לשרירי הגפיים האחוריות של עכבר בריאים יש מעט IMAT טבעי, עדות לכך היא מעט מאוד שומנים חיוביים ל-ORO (איור 1A). לשם השוואה, שרירי הגפיים האחוריות הוזרקו עם קרדיוטוקסין (CTX; איור 1B) או גליצרול (GLY; איור 1C) 14 יום לפני decellularization יש הצטברות מוגברת של IMAT, עם ריכוז גדול יותר של IMAT לאחר CTX לעומת GLY כפי שצוין קודם37.
דה-צלולריזציה חלקית יכולה להיות מזוהה מיד לאחר הטיפול הראשוני ב-SDS או לאחר שטיפה של צביעת ה-ORO כסיבים אטומים למחצה בצבע ורוד בהיר (איור 2B בהשוואה לאיור 2A). ניתן לזהות פינוי חלקי של ORO לאחר שטיפת ORO כרקע אחיד ורוד או אדום, ולא כקווי סיבים נפרדים (איור 2C). איור 2A,B מכיל גם שומן אפימוסקולרי (כוכביות), גוש של טיפות שומנים מחוץ לשריר הדה-צלולרי. איור 2C גם מדגים את קיפול השרירים שיכול להתרחש אם השרירים אינם מפוזרים במהלך דה-צלולריזציה. דה-צלולריזציה חלקית, פינוי ORO לא שלם ושאריות שומן אפימוסקולרי מגדילים באופן מלאכותי את (OD) של שומנים שחולצו, אך אינם בהכרח מעכבים הערכה איכותית של חדירת שומן אם הם מוכרים כחפץ.
הדמיה כמותית של חדירת שומן בשרירי השלד ניתן לצלם טיפות שומנים עם תווית פלואורסצנטית של BODIPY באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי להערכה מפורטת יותר של מדדים ופיזור של טיפות שומנים בודדות (איור 3). תהליך זה הוא אוטומטי למחצה, כפי שתואר קודם לכן, כולל קוד Matlab37. צביעת BODIPY טובה יוצרת צורות אליפטיות בהירות המופרדות מצורות שכנות כאשר הן מצולמות במישור (איור 3A). פילוח סף וצורה מספק מעבר ראשון טוב ליצירת ROI עבור כל טיפת שומנים (איור 3B), אולם יש צורך בעריכות ידניות כדי לתקן שגיאות. השגיאה הנפוצה ביותר היא טיפות שומנים שנמצאות עמוק בתוך הרקמה ולכן אינן בהירות על פרוסות כלשהן (איור 3B; חיצים כפולים ורודים). ניתן לתקן זאת על-ידי הוספת החזר השקעה ידני באמצעות הכלי הסגלגל ב-ImageJ (איור 3C). השני הוא זיהוי קבוצה של טיפות שומנים כהחזר השקעה יחיד (איור 3B; כוכבית אדומה). ניתן לתקן זאת על-ידי מחיקה והחלפה של החזר ההשקעה המקורי במספר ROI חדש (איור 3D). לבסוף, טיפת שומנים אחת מזוהה כהחזר השקעה ייחודי במספר פרוסות, כך שיש לאחד את ה-ROI הכפול ל-ROI יחיד (איור 3E; חץ כחול). זה נעשה בקלות רבה באמצעות כלי עיבוד נתונים כגון Matlab, אבל יכול להיעשות גם ביד על ידי זיהוי החזר ההשקעה הגדול ביותר ומחיקת השאר. ערכים ממוצעים עבור כל מדד בעכבר C57BL6/J ו- 129Sv ניתן למצוא ב- Biltz et al.37.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65461/65461fig01.jpg"> איור 1: דוגמה לצביעת שמן אדום O (ORO) של שרירים דה-צלולריים. שרירים מוכתמים באורו 14 יום לאחר ההזרקה עם מי מלח (SAL), קרדיוטוקסין (CTX) או גליצרול (GLY). לשרירים Mouse extensor digitorum longus (EDL) ולשרירי tibialis anterior (TA) יש מעט IMAT (כדורים אדומים) עם טיפול SAL (A), אך הם צוברים IMAT בתגובה לטיפול CTX (B) ו- GLY (C). יש דה-צלולריזציה מלאה ושטיפת ORO, עדות לכך היא טיפות שומנים חיוביות מובהקות של ORO על רקע שריר לבן שקוף. פסי קנה מידה = 500 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65461/65461fig01large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65461/65461fig02.jpg"> איור 2: דוגמאות לתוצאות צביעה גרועות של ORO. דה-צלולריזציה חלקית או פינוי ORO לא שלם מובילים לרקע ורוד/אדום אטום למחצה. בהשוואה לרקע הלבן השקוף של שריר הסרעפת של עכבר שעבר דה-צלולריזציה מלאה (A), דה-צלולריזציה חלקית מאופיינת בפסי סיבים ורודים/אדומים בהירים (B), ופינוי ORO חלקי מאופיין ברקע ורוד/אדום מפוזר (C). פסי קנה מידה: לוחות עליונים = 1 מ"מ; לוחות תחתונים = 500 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65461/65461fig02large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65461/65461fig03.jpg"> איור 3: דוגמאות לזיהוי טיפות שומנים בודדות עם צביעת BODIPY פלואורסצנטית ומיקרוסקופ קונפוקלי ניתן לזהות ולכמת טיפות שומנים מוכתמות בודדות של BODIPY בשרירים דה-סלולריים באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי. פרוסות בודדות דרך ערימה קונפוקלית מציגות טיפות שומנים במישור כאליפסות ירוקות בהירות, וטיפות שומנים מחוץ למישור כצורות חיוורות יותר (A; חיצים כחולים). סף בשילוב עם פילוח אובייקטים בקו פרשת המים וזיהוי ROI יכול למפות ROI מוכתמים BODIPY (B). הסף עלול להחמיץ כמה טיפות שומנים חיוורות יותר (B; חץ כפול ורוד), הדורשות זיהוי ביד (C). פילוח קו פרשת המים עשוי לקבץ יחד מספר טיפות שומנים (B; כוכבית אדומה), מה שדורש מחיקה של החזר ההשקעה והערכה מחדש ביד (D). אותה טיפת שומנים מזוהה במספר פרוסות הדורשות רישום תמונה (E) כדי למחוק את החזר ההשקעה הכפול. פסי קנה מידה = 100 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65461/65461fig03large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Decellularization-Based Quantification of Skeletal Muscle Fatty Infiltration at JoVE.com

המחקר הנוכחי מתאר מתודולוגיות מבוססות דה-צלולריזציה להדמיה וכימות של שקיעת רקמת שומן תוך-שרירית (IMAT) באמצעות נפח שריר שלם, כמו גם כימות מדדים של אדיפוציטים בודדים המרכיבים IMAT.

Fatty infiltration is the accumulation of adipocytes between myofibers in skeletal muscle and is a prominent feature of many myopathies, metabolic ...

אנו מעוניינים בהצלבה בין שריר מתכווץ לבין האדיפוציטים הנוצרים בין סיבי שריר בפציעה ובמחלה הנקראת רקמת שומן תוך שרירית, או IMAT. הנדסה גנטית בתאים בעכברים היא כלי רב עוצמה לניתוח מכניסטי של דיבור צולב של שרירי שומן. ניתוח של איתות באמצעות תעתיק ופרוטאומיקה מזהה מתווכים, ואז אספקת תרופות מבוססות ביו-חומרים יכולה להתערב במסלולים אלה.אחד האתגרים העיקריים הוא בידוד וכימות אדיפוציטים של IMAT. במיוחד במודלים של בעלי חיים קטנים, אות ה- IMAT נשטף על ידי ניתוח שרירים שלמים כמו שעתוק או ליפידומיה, וכימות IMAT על ידי הדמיה לא פולשנית סובל משטיפה דומה, מכיוון שרוב הווקסלים מכילים תערובת של שרירים ו- IMAT. לאחרונה השתמשנו בטכניקה זו המתוארת במאמר זה כדי להדגים כי IMAT פוגע ישירות בהתכווצות השרירים.עם מדידות מדויקות של שקיעת IMAT, הראינו שהוא לא רק מחליף חומר מתכווץ, אלא מעכב התכווצות בשריר הרזה שנותר. פרוטוקול זה מטפל באתגרים בכימות IMAT. התקן הנוכחי למדידת IMAT בבעלי חיים קטנים הוא היסטולוגיה של חתך יחיד, שאינה הדמיה מקיפה או לא פולשנית, שהיא יקרה וברזולוציה נמוכה.אנו מאמינים שזה הגביל את הבנתנו את ה- IMAT muscle crosstalk. טכניקה זו מספקת שיטה מקיפה וזולה להערכת IMAT על ידי הדמיה איכותית וכימות בקנה מידה רב. אנו מקווים שהפשטות של טכניקה זו תעודד חוקרים נוספים למדוד IMAT במודלים של בעלי החיים שלהם.כמו כן, טכניקה זו תספק כלי דיוק גבוה יותר עבור החוקרים המעוניינים ב- IMAT לחשוף יחסים עדינים יותר בין אדיפוציטים IMAT ותאים אחרים.

כימות מבוסס דה-צלולריזציה של חדירת שומן בשרירי השלד

Abstract