כימות מבוסס דה-צלולריזציה של חדירת שומן בשרירי השלד

Summary

המחקר הנוכחי מתאר מתודולוגיות מבוססות דה-צלולריזציה להדמיה וכימות של שקיעת רקמת שומן תוך-שרירית (IMAT) באמצעות נפח שריר שלם, כמו גם כימות מדדים של אדיפוציטים בודדים המרכיבים IMAT.

Abstract

חדירת שומן היא הצטברות של אדיפוציטים בין שרירי שרירי השלד והיא מאפיין בולט של מיופתיות רבות, הפרעות מטבוליות וניוון. מבחינה קלינית באוכלוסיות אנושיות, הסננה שומנית מוערכת בשיטות לא פולשניות, כולל טומוגרפיה ממוחשבת (CT), דימות תהודה מגנטית (MRI) ואולטרסאונד (US). למרות שמחקרים מסוימים השתמשו ב- CT או MRI כדי לכמת הסננה שומנית בשריר העכבר, עלויות ורזולוציה מרחבית לא מספקת נותרו מאתגרות. שיטות אחרות של בעלי חיים קטנים משתמשות בהיסטולוגיה כדי לדמיין אדיפוציטים בודדים; עם זאת, מתודולוגיה זו סובלת מהטיה דגימה בפתולוגיה הטרוגנית. פרוטוקול זה מתאר את המתודולוגיה לצפייה איכותית ומדידה כמותית של חדירת שומן באופן מקיף לאורך שרירי עכבר שלמים וברמת האדיפוציטים הבודדים באמצעות דה-צלולריזציה. הפרוטוקול אינו מוגבל לשרירים ספציפיים או למינים ספציפיים וניתן להרחיב אותו לביופסיה אנושית. בנוסף, ניתן לבצע הערכות איכותיות וכמותיות ברוטו עם ציוד מעבדה סטנדרטי בעלות נמוכה, מה שהופך הליך זה לנגיש יותר במעבדות מחקר.

Introduction

הצטברות של אדיפוציטים בין שרירי שריר השלד היא מאפיין בולט של מצבים שונים, מסוכרת מסוג 2, דרך סרקופניה ועד פגיעה בשרירים ושלד 1,2,3,4,5,6,7. הערכה מקיפה של רקמת שומן תוך שרירית זו (IMAT) היא קריטית להבנת הפתוגנזה של מצבים אלה, שכן תצהיר IMAT נמצא בקורלציה חזקה עם עמידות^{לאינסולין} 3,8,9,10 ותפקוד שרירי שלד לקוי 11,12,13,14,15 . למרות שקשרים אלה צוינו במשך עשרות שנים, המנגנונים הקשורים ל- IMAT ומקורו עדיין נותרו תחום של חקירה אינטנסיבית. זאת בין היתר משום שרוב המחקרים להערכת חדירת שומן בשרירי השלד בוצעו בבני אדם, שם החקירות המכניסטיות מוגבלות^16,17. עם זאת, לאחרונה, מודלים של בעלי חיים קטנים, כולל עכברים, שימשו כדי לסייע באיתור ויסות תאי של התפתחות IMAT ואיתות^18,19,20. עבודה זו נועדה לספק כלי חדש לשימוש עם מודלים של בעלי חיים קטנים להדמיה איכותית וכימות של חדירת שומן בשרירי השלד.

מבחינה קלינית באוכלוסיות אנושיות, הסננה שומנית מוערכת בשיטות לא פולשניות, כולל טומוגרפיה ממוחשבת (CT) ^6,21, דימות תהודה מגנטית (MRI) ^16,17,22,23, ואולטרסאונד (US)^17,24. טכניקות הדמיה אלה בדרך כלל מזהות אזור עניין מוגדר (ROI) בשריר ורוכשות פרוסות תמונה בתוך אזור זה, אם כי גישות מקיפות שימשו גם 25,26,27. פרוסות תמונה אלה כפופות לדירוג איכותי⁶ ומכומתות באמצעות סף פיקסלים²⁸. גישות דומות יושמו בעבר בבעלי חיים^29,30; עם זאת, הם יקרים ודורשים גישה למערכות הדמיה של בעלי חיים קטנים. רזולוציה מרחבית באמצעות שימוש ב- CT ו- MRI מציגה גם בעיה מרכזית, מכיוון שהם אינם מסוגלים להפריד אדיפוציטים IMAT מסיבי שרירי השלד בתוך ווקסל ובמקום זאת מסתמכים על הפרדה סובייקטיבית של אזורי שריר בעיקר ובעיקר אזורי IMAT^31,32. ככזה, חוסר היכולת לזהות במדויק שומן או רקמת שריר מציג גם כימות לא מדויק של כמויות מייצגות של רקמות אלה.

בשל מגבלות אלה, הטכניקות הנוכחיות להערכת חדירת שומן בשרירי השלד במודלים של בעלי חיים קטנים מסתמכות בדרך כלל על היסטולוגיה כחלופה זולה ונגישה^33,34. הליכי צביעה סטנדרטיים, כולל המטוקסילין ואאוזין (H&E), שמן אדום O (ORO), וצביעה חיסונית לסמני אדיפוציט כגון פריליפין, מאפשרים זיהוי והדמיה פשוטים של אדיפוציטים הכוללים חדירת שומן בתוך השריר. עם זאת, גישות היסטולוגיה הן לעתים רחוקות מקיפות, ובדרך כלל, הערכה איכותית או כמותית של IMAT מוגבלת לסעיף³⁴ יחיד. מיצוי שומנים שימש גם לכימות סך שומני השריר³⁵; עם זאת, טכניקה זו אינה מצליחה להבחין בין שומנים תוך שריריים (IMCL) לבין מאגרי רקמת שומן תוך שרירית (IMAT)³⁶. לסיכום, המתודולוגיות הנוכחיות לדמיין ולכמת שומן בשריר נותרו מוגבלות על ידי עלויות כספיות או זיהוי ספציפי של IMAT.

כאן, אנו מתארים שיטה מפורטת להערכת הסננה שומנית בשרירי השלד הן על ידי הדמיה איכותית והן על ידי כימות רב-ממדי. מתודולוגיה זו משתמשת בטכניקת דה-צלולריזציה פשוטה המסירה מבנים מיותאיים, כולל IMCL, אך שומרת על טיפות השומנים הגדולות יותר שמקורן באדיפוציט IMAT ללא פגע. אימות הספציפיות של טכניקה זו פורסם³⁷, כולל שימוש במיצוי שומנים כדי להראות את הדלדול של IMCL עם דה-צלולריזציה, μCT כדי להראות את השימור של דפוסי IMAT עם דה-צלולריזציה, והיסטולוגיה כדי להראות את התפלגות הגודל הדומה של טיפות שומנים IMAT בהשוואה לאלה שזוהו עם דה-צלולריזציה. לאחר ביטול התא, ניתן להכתים את השרירים בצבעים מסיסים בשומנים לצורך הדמיה איכותית של הדפוס ומידת ההסננה השומנית ו/או הדמיה כמותית של טיפות שומנים בודדות של IMAT. לאחר מכן ניתן לחלץ צבעים עם איזופרופנול, וניתן להשתמש בצפיפות האופטית (OD) של התמיסה המתקבלת כדי להעריך את נפח השומנים של IMAT. האימות המחמיר של טכניקה זו פורסם במקום אחר³⁷. מאמר זה מספק פרוטוקול מפורט לשימוש במתודולוגיה זו עם שרירי עכבר ומספק עצות לפתרון בעיות לתמיכה באימוץ שיטה זו ביישומים אחרים, כגון שרירים ממינים אחרים או רקמות אחרות.

Protocol

הטיפול וההקרבה של עכברים בוצעו בהתאם למדריך המכונים הלאומיים לבריאות לשימוש וטיפול בחיות מעבדה. כל העבודה אושרה על ידי הוועדה ללימודי בעלי חיים באוניברסיטת וושינגטון בבית הספר לרפואה של סנט לואיס. עכברי C57BL/6J זכרים בגילאי 2-3 חודשים (ראה טבלת חומרים) שימשו ליצירת התמונות לדוגמה הכלולות בפרוטוקול זה. כל השלבים המתוארים להלן מבוצעים בטמפרטורת החדר.

1. דה-צלולריזציה של שרירים

1. הכינו תמיסת סודיום דודציל סולפט 1% (SDS; ראו טבלת חומרים) במי מלח חוצצי פוספט (PBS). מערבבים את התמיסה עד לערבוב מלא.
   הערה: ניתן להכין SDS 1% בכמויות גדולות ולאחסן בטמפרטורת החדר למשך חודש אחד.
2. לנתח את השרירים של עניין כפי שתואר קודם^38,39.
   1. לחשוף את השרירים של עניין על ידי הרטבת השיער והעור עם תמיסת אתנול 70%, ולאחר מכן ביצוע חתך transcutaneous של כ 2 ס"מ ואחריו הסרת העור מכסה עם מלקחיים מספריים קפיץ.
      הערה: השרירים המעניינים כאן כוללים את הטיביאליס הקדמי (TA), extensor digitorum longus (EDL) וסרעפת. שרירים מסוימים עשויים להימצא עמוק בשרירים אחרים, מה שדורש דיסקציה של שרירים אחרים (למשל, ניתוח ה-EDL דורש הסרה של ה-TA).
   2. נתחו את השרירים המעניינים באמצעות מספריים או להבים חדים (ראו טבלת חומרים) כדי לוודא שכל היקף השריר מתקבל והקצוות חלקים.
      הערה: זה נעשה באופן אידיאלי תחת מיקרוסקופ מנתח כדי לשפר את ההדמיה.
   3. בדוק את השרירים כדי לוודא שאין שבבי עצם או קצוות משוננים, ולאחר מכן חתוך אותם עם מספריים חדים לפי הצורך.
   4. לשקול את השריר באמצעות איזון אנליטי ולרשום את המשקל.
3. מקם את השריר מנותח לפחות 0.1 מ"ל של 1% SDS לכל מיליגרם של משקל; לוחות 6, 12 או 24 בארות עובדים היטב עבור שרירי העכבר בסרעפת, TA ו- EDL, בהתאמה. נפחים אופייניים הם 6 מ"ל, 3 מ"ל ו -1.5 מ"ל עבור לוחות 6, 12 ו -24 בארות, בהתאמה.
   הערה: תמיסת SDS לעיתים תגרום לעיוות השרירים, לכן יש לוודא שהשריר שטוח/מורחב בטבילה הראשונית.
4. מניחים את צלחת הבאר (או כלים אחרים) על שייקר נדנדה להגדיר 50-80 הרץ.
5. בדוק חזותית את פתרון SDS מעת לעת. כאשר התמיסה הופכת מעוננת, להסיר את התמיסה עם פיפטה (נזהר לא לשאוף את השריר) ולהחליף אותו עם נפח שווה של 1% SDS טרי. כאשר הפתרון נשאר ברור במשך 24 שעות, decellularization הושלם.
   הערה: התדירות הנדרשת לשינויי תמיסה משתנה בהתאם לגודל השריר ולנפח התמיסה הראשוני. שרירים גדולים יותר כמו TA זקוקים ל-SDS חדש תוך מספר שעות, ושרירים קטנים יותר כמו EDL יכולים לעבור בן לילה בפתרון המקורי.
6. הסר את תמיסת SDS הסופית מהשרירים decellularized עם פיפטה (נזהר לא לשאוף את השריר) ולהחליף אותו עם נפח שווה של PBS.
7. בדקו ויזואלית את השרירים הלא סלולריים תחת מיקרוסקופ מנתח והשתמשו במלקחיים ובמספריים כדי להסיר כל שערה או פסולת שנדבקה לשריר.
   הערה: כמו כן, שים לב לבהירות של שריר decellularized בשלב זה. אם השריר הדה-צלולרי אינו שקוף לחלוטין ותמיסת SDS אינה עולה בעכירות במשך 24 שעות, אזי הדה-צלולריזציה לא הייתה יעילה. זה יוצר חפץ בהערכות איכותיות וכמותיות, ולכן דה-צלולריזציה תמיד צריכה להיות אופטימלית על דגימות תרגול לפני שממשיכים עם שרירים ניסיוניים.
8. הסר בזהירות את PBS, החלף אותו בנפח שווה של 3.7% פורמלדהיד או 4% תמיסת פרפורמלדהיד, והחזיר את הצלחת לשייקר הנדנדה למשך 24 שעות.
   הערה: ודא שתמיסת הפורמלדהיד מכסה במלואה את השריר נטול התא, אחרת הכתמים לא יהיו אחידים.

2. הדמיה של IMAT עם שמן אדום O

1. הכינו פתרון של ORO.
   1. להמיס 0.5 גרם של אבקת ORO (ראה טבלה של חומרים) ב 100 מ"ל של isopropanol כדי ליצור פתרון מלאי.
      הערה: הוסף חום עדין לתמיסה כדי להמיס אותה במלואה. ניתן לאחסן מלאי זה בטמפרטורת החדר למשך חודש אחד.
   2. שלב את תמיסת המניות של ORO ומים נטולי יונים, ביחס של 60:40 כדי לקבל את פתרון העבודה הדרוש לכל השרירים באמצעות נפח של לפחות 0.1 מ"ל / מ"ג משקל שריר. נפחים אופייניים הם 6 מ"ל, 3 מ"ל ו -1.5 מ"ל עבור לוחות 6, 12 ו -24 בארות, בהתאמה.
      הערה: בדוק את תמיסת המלאי לפני הערבוב. אם תמיסת המלאי מכילה חלקיקים משמעותיים, הכינו מלאי טרי.
   3. כסו את פתרון העבודה למשך 10 דקות כדי לאפשר לחלקיקים לשקוע.
   4. סנן את פתרון העבודה דרך רשת של 40 מיקרומטר, ואחריה מסנן מזרק של 0.22 מיקרומטר.
      הערה: מסנן המזרק בגודל 0.22 מיקרומטר נסתם במהירות ויש להחליפו אם פתרון העבודה אינו עובר בקלות.
2. הסר את תמיסת הפורמלדהיד או הפרפורמלדהיד ושטוף את השרירים הדה-צלולריים בשלושה שינויי תמיסה בנפח שווה של PBS.
3. יש להחליף את PBS בתמיסת איזופרופנול בנפח שווה של 60% ולדגור על שייקר נדנדה למשך 5 דקות.
4. החליפו את תמיסת האיזופרופנול 60% בתמיסת עבודה ORO ודגרו על שייקר הנדנדה למשך 10 דקות.
   הערה: ודא כי פתרון העבודה ORO מכסה באופן מלא את השריר decellularized, אחרת כתמים יהיה אחיד.
5. החלף את פתרון העבודה ORO בנפח שווה של 1% SDS. בדוק חזותית את פתרון SDS מעת לעת. כאשר התמיסה הופכת ורודה באופן ניכר, להסיר את התמיסה עם פיפטה (נזהר לא לשאוף את השריר) ולהחליף אותו עם טרי 1% SDS.
6. כאשר התמיסה נשארת ברורה למשך 24 שעות, החלף את SDS 1% ב- PBS ובדוק את השריר המוכתם תחת מיקרוסקופ ניתוח/סטריאו בהגדלה פי 4. הסר כל פסולת ברורה או חלקיקים דבוקים לחלק החיצוני של השריר. אם זה נרחב, ניתן לגלגל את השריר נטול התאים בעדינות על רקמת ניקוי כדי למשוך את הפסולת/חלקיקים.
7. אם הצביעה משביעת רצון (כדורים אדומים בוהקים צפים במטריצה שקופה), רכשו תמונות של הצביעה כרצונכם באמצעות מצלמה המחוברת למיקרוסקופ הסטריאו (ראו טבלת חומרים).
   הערה: אם למיקרוסקופ המנתח אין מצלמה מחוברת, ניתן להשתמש במצלמת טלפון כדי לצלם תמונות דרך העינית.

3. הדמיה של טיפות שומנים IMAT עם BODIPY

הערה: הדמיה קונפוקלית היא היעילה ביותר עם שרירים דקים כמו EDL או הסרעפת (~ 2 מ"מ עובי). לחלופין, ניתן להשתמש ברצועות בעובי דומה של שרירים כמו TA.

1. הכן תמיסה 1:200 של BODIPY פלואורסצנטי 493/503 (ראה טבלת חומרים) ב- PBS כדי לקבל נפח פתרון עבודה של לפחות 0.1 מ"ל / מ"ג משקל שריר. נפחים אופייניים הם 6 מ"ל, 3 מ"ל ו -1.5 מ"ל עבור לוחות 6, 12 ו -24 בארות, בהתאמה.
2. הסר את הפורמלדהיד, הפרפורמלדהיד או 1% SDS ושטוף את השרירים הדה-צלולריים בשלושה שינויי תמיסה בנפח שווה של PBS.
3. החליפו את PBS בתמיסת העבודה BODIPY ודגרו על שייקר הנדנדה למשך 20 דקות.
4. לשטוף את השרירים decellularized עם שלושה שינויים פתרון של נפח שווה של PBS.
5. הניחו את השריר בכלי בעל תחתית שקופה התואם למיקרוסקופ קונפוקלי זמין. באופן אידיאלי, לצלחת תהיה תחתית שקועה כדי להניח כיסוי על השריר מבלי לעוות אותו (ראה טבלת חומרים).
6. השג ערימות תמונות במיקרוסקופ קונפוקלי סטנדרטי (ראה טבלת חומרים) באמצעות לייזר 488. גודלי ערימה אופייניים עבור EDL הם 0.5-1 מ"מ עם עובי פרוסה של 10 מיקרומטר, המפיקים 50-100 תמונות לערימה.
   הערה: כדי לכמת את נפח השומנים הכולל, את המספר הכולל של טיפות שומנים IMAT ואת אינדקס השכן הקרוב ביותר של אשכולות, תמונה דרך כל נפח השריר, תוך הקפדה להשאיר חפיפה מסוימת לרישום תמונה. כדי לכמת את נפח טיפת השומנים הממוצע, ערימה אחת עשויה להספיק.
7. אם תרצה, הכתימו את השרירים ב- ORO, לפי סעיף 2, לקבלת תמונת שריר שלם משלימה של התפלגות IMAT.
   הערה: מכיוון ש- BODIPY הוא פלואורסצנטי, הוא לא ייראה תחת מיקרוסקופ האור כאשר תמונות של ORO נרכשות.

4. הערכת נפח השומנים הכולל על ידי מיצוי שומנים

1. לאחר רכישת התמונה, העבירו את השרירים ל-200 מיקרוליטר איזופרופנול בבארות בודדות של צלחת בעלת 96 בארות, או התאימו את הבאר/נפח אם השריר גדול מכדי להתאים.
2. הסעירו את התמיסה על ידי הקשה על הצלחת, פיטום התמיסה מעלה ומטה, ו / או ריסוק מכני של השריר עם קצה פיפטה עד שלא ניתן לראות כדורים אדומים/פלואורסצנטיים בשריר הלא סלולרי תחת מיקרוסקופ.
   הערה: טפל בכל השרירים באותו שילוב של הקשה, פיפטינג וריסוק לקבלת האמינות הטובה ביותר. כמו כן, דאגו להגביל את הזמן המושקע בהקשה, פיפטינג וריסוק, מכיוון שהאיזופרופנול יתאדה במהירות.
3. מערבבים את התמיסה בכל באר על ידי pipetting למעלה ולמטה, ולאחר מכן להעביר 75 μL לשתי בארות נקיות של הצלחת.
4. כסו את הצלחת וקראו את הספיגה של הבארות הכפולות של 75 μL באמצעות ספקטרופוטומטר או קורא לוחות. אם המבנה היה מוכתם עם ORO, לקרוא את הפתרון ב 500 ננומטר; אם הוא היה מוכתם עם BODIPY 493/503, לקרוא את הצלחת ב 493 ננומטר.
   הערה: אם המבנה היה מוכתם הן עם BODIPY והן עם ORO, מומלץ לקרוא את הלוח ב 500 ננומטר, כמו 500 ננומטר קריאות לתת תוצאות דומות בין מבנים מוכתמים ORO בלבד ו ORO בתוספת BODIPY.
5. חלקו את קריאת הספיגה במשקל הרשום של השריר אם רוצים לתקן את הבדלי הגודל בין הדגימות.

5. כימות מדדי טיפות שומנים IMAT מתמונות קונפוקליות

הערה: סעיף זה דורש גישה לגרסה 1.47 של ImageJ (ראה טבלת חומרים) ואילך ולמיומנויות בסיסיות של ImageJ⁴⁰.

1. פתח ערימות קונפוקליות ב- ImageJ.
   הערה: מיקרוסקופים קונפוקליים שונים עשויים לשמור תמונות קונפוקליות בפורמטים שונים. ImageJ עשוי לדרוש תוסף או גרסה נוספים, כגון פיג'י, כדי לפתוח את ערימות⁴¹. האלגוריתמים בהם נעשה שימוש הם חלק מחבילת התוכנה ImageJ.
2. הפעל אלגוריתם סף ב- ImageJ כדי לזהות פיקסלים חיוביים של BODIPY. פעולה זו ממירה את התמונה הנוכחית לתמונה בינארית.
   1. פתח את ממשק המשתמש של הסף על-ידי בחירה באפשרות Image > Adjust > Threshold. בממשק המשתמש, בחר Intermodes כסוג הסף וודא שנבחר רקע כהה . אין צורך לבחור אפשרויות אחרות. לאחר מכן לחץ על החל.
   2. נפתחת תיבת דו-שיח להמרת האוסף לבינארי. ודא שנבחרו האפשרויות הבאות: שיטה: Intermodes; רקע: כהה. חשב את הסף לכל תמונה ורקע שחור (של מסיכות בינאריות). פעולה זו יוצרת ערימה בינארית, כאשר לבן מציין פיקסלים חיוביים של BODIPY ושחור מציין פיקסלים שליליים של BODIPY.
      הערה: ייתכן שאלגוריתם סף Intermodes אינו הבחירה הטובה ביותר עבור כל המשתמשים. בדיקה סובייקטיבית של אפשרויות הסף המובנות של ImageJ מסייעת לבחור את האלגוריתם האופטימלי להפרדת פיקסלים חיוביים ושליליים של BODIPY.
3. הפעל את אלגוריתם פרשת המים ב- ImageJ כדי להפריד טיפות שומנים נוגעות. בחר תהליך > קו פרשת המים > בינארי. נפתחת תיבת דו-שיח השואלת אם יש לעבד את כל התמונות באוסף. בחר כן. פעולה זו מוסיפה קווים שחורים דקים המחלקים אזורים גדולים יותר של לבן מלא.
4. זהה החזר השקעה באמצעות האלגוריתם Analyze Particles ב-ImageJ.
   1. בחר נתח > נתח חלקיקים. נפתחת תיבת דו-שיח לקביעת הגדרות הבחירה.
      הערה: בחירת טווח המידות היא קריטית להשגת האומדן הטוב ביותר של ROI טיפת שומנים. הגבול התחתון מבטל אזורים שסביר להניח שהם קטנים מכדי להיות טיפות שומנים שמקורן ב- IMAT (ממצא רקע), והחסם העליון מבטל אזורים שסביר להניח שהם גדולים מדי מכדי להיות טיפות שומנים בודדות שמקורן ב- IMAT (נגיעה בטיפות שומנים שלא הופרדו על ידי אלגוריתם פרשת המים).
   2. לקביעת ערכים אלה, פתחו את התמונה המקורית ושרטטו את טיפת השומנים הקטנה והגדולה ביותר המוצגת בעזרת הכלי אליפסה. לאחר מכן, הוסף צורות אלה למנהל החזר ההשקעה על-ידי הקלדת "t". בחר נתח ולאחר מכן הגדר מדידות. נפתחת תיבת דו-שיח לבחירת ההגדרות.
      1. סמן את אזור בלבד ולחץ על אישור. לאחר מכן, בחר מדידה מאבוס החזר ההשקעה. השתמש בשני מדידות השטח מחלון תוצאות זה כטווח הגדלים בניתוח חלקיקים.
   3. ודא שהאפשרות הוסף למנהל מסומנת. אין צורך באפשרויות אחרות.
5. שכב את החזר ההשקעה על הערימה הקונפוקלית על-ידי סימון הצג הכל במנהל החזר ההשקעה. השתמשו בפס המחוון כדי לבדוק כל פרוסת ערימה בנפרד ולהוסיף אזורים חסרים ידנית בעזרת הכלי אליפסה (הממוקם בסרגל הכלים ImageJ).
6. הפק את מדידות החזר ההשקעה. בחרו ' נתח' > 'קבע מדידות ' ובחרו 'אזור', ' סנטרואיד', 'התאם אליפסה ' ו'מיקום מחסנית'. לחץ על אישור. לאחר מכן, בחר מדידה מאבוס החזר ההשקעה. ניתן לבחור את הנתונים בטבלת התוצאות ולהעתיק אותם ל- Matlab או Excel לצורך ניתוח נוסף.
7. מקד את החזר ההשקעה בכל ערימה להחזר השקעה יחיד באמצעות קוד Refine.m Matlab³⁷ או אלגוריתם דומה.
   הערה: שלב זה נדרש מכיוון ששלבים 5.2-5.4 מזהים את אותה טיפת שומנים בפרוסות סמוכות כהחזר השקעה נפרד. עם זאת, ניתן לחלופין לזהות ROI באופן ידני בלבד, או לבטל ROI כפול באופן ידני ב- ImageJ כדי למנוע את הצורך ב- Matlab.
8. קבל את הנתונים הסטטיסטיים המסכמים בהחזר ההשקעה באמצעות Matlab או Excel.
   1. הערך את המספר הכולל של טיפות שומנים כמספר הכולל של החזר השקעה.
   2. הערך את נפח טיפת השומנים כנפח האליפסה המותאמת לכל החזר השקעה דו-ממדי, בהנחה שעומק הצורה הוא הממוצע של הצירים הראשיים והקטנים של האליפסה.
   3. הערך את נפח השומנים הכולל, שהוא סכום נפחי טיפות השומנים המשוערים הבודדים.

Discussion

כתב יד זה מתאר שיטות לדמיין ולכמת באופן איכותי הסננה של שומן בשרירי השלד במודלים של בעלי חיים קטנים, שניתן ליישם כדי להבין עוד יותר את הפתוגנזה של התפתחות רקמת שומן תוך שרירית (IMAT) והתרחבות פתולוגית. השימוש בדה-צלולריזציה של כל השרירים וצביעה מסיסים בשומנים מאפשר מתודולוגיה חסכונית, ניתנת לשחזור ופשוטה להערכה מקיפה של נוכחות IMAT בשרירים שלמים.

הבסיס לפרוטוקול זה הוא שדה-צלולריזציה של שריר עם SDS מסירה את המרכיבים התאיים של מיופייבר, כולל טיפות השומנים הקטנות של IMCL, אך חוסכת את טיפות השומנים הגדולות באדיפוציטים תוך-תאיים. SDS נמצא בשימוש נרחב⁴² בהנדסת רקמות כדי לבצע דה-צלולריזציה של מטריצות. רקמות כגון שומן ושרירי השלד דורשות בדרך כלל דיסוציאציה מכנית נוספת ו / או מיצוי אלכוהול כדי להסיר את שאריות שומני האדיפוציט^42,43. הראינו בעבר כי הסיבה לכך היא כי בעוד decellularization עם SDS מבטל IMCL, זה חוסך את טיפת שומנים גדולה אדיפוציט³⁷. הדמיה של שריר שלם מוכתם בטטרוקסיד אוסמיום לפני ואחרי decellulariztion עם μCT אימתה כי התבנית המרחבית של IMAT לא הופרעה על ידי דה-צלולריזציה. יתר על כן, כימות טריגליצרידים תוך שרירי בשריר נטול תאים עם IMAT זניח היה ~ 5% מערכי השרירים השלמים, מה שאימת את הסרת IMCL. לכן, מתודולוגיה זו שומרת על טיפות שומנים IMAT בפיזור האנטומי המקורי שלהן באמצעות מטריצת שרירים שקופה למחצה.

דה-צלולריזציה נכונה היא השלב הקריטי ביותר בפרוטוקול זה. אם הדה-צלולריזציה אינה שלמה, יהיה קשה לדמיין טיפות שומנים ב-IMAT ו-IMCL שיורי יגרום לצביעת רקע גבוהה עם ORO או BODIPY (איור 2). טעויות נפוצות של משתמשים לא מנוסים הן כיסוי SDS לקוי לכל שריר (בתוך כל באר), כך שכל שריר אינו מכוסה לחלוטין בתמיסת SDS, לא משתמש בנדנדה כדי לעורר את התמיסה במהלך דה-צלולריזציה, ולא מבצע שינויי תמיסה בתדירות מספקת. בכתב יד זה, המלצנו על כמות SDS הדרושה ליחידת מסת שריר, אך המשתמש עדיין יצטרך לוודא שהשרירים מכוסים לחלוטין בתמיסות, שכן לכל שריר יש גיאומטריה ייחודית. כמו כן, מומלץ למשתמשים להחליף את הפתרונות באופן חופשי (עד פעמיים ביום) כדי להבטיח שהדה-סלולרזציה תושלם. צביעה באיכות טובה של טיפות שומנים IMAT הושגה לאחר עד 4 ימים של טיפול SDS. לקבלת תוצאות צביעת ORO באיכות גבוהה, קיבוע הולם והכנת פתרון ORO חשובים גם הם. בדומה לטיפול SDS שתואר לעיל, יש צורך בכיסוי הולם של תמיסת פורמלדהיד 3.7% לכל דגימת שריר. אם השריר מוסר מהקיבוע מוקדם מדי, טיפות שומנים יכתימו רק חלש עם ORO. סה"כ 1-2 שעות אמור להספיק, אך מומלץ לבצע קיבוע בן לילה כדי להבטיח שהקיבוע חודר למרכז השריר ומקבע באופן מלא את כל טיפות השומנים. אתגר נוסף עם צביעת ORO הוא שכאשר ריכוז האלכוהול מופחת ל -60%, חלקיק מתחיל להיווצר. חלקיק זה יכול להתיישב על פני השטח ולהיתקע על גבול השריר. הדרך הטובה ביותר להימנע מכך היא ליצור פתרון עבודה רענן לכל צביעה ולהשתמש הן במסננים של 40 מיקרומטר רשת והן במסננים של 0.22 מיקרומטר. לאחר מכן, שמירה על תסיסה עם הנדנדה והגבלת זמן הכתמים ל -10 דקות יעזרו למנוע מכל חלקיק שנוצר לשקוע. אם הבעיה נמשכת, יצירת פתרון חדש של מניית ORO עשויה לעזור. אם חפץ כלשהו נשאר דבוק למשטח השריר נטול התא, ניתן להשתמש במיקרוסקופ סטריאו, מלקחיים ומספריים כירורגיים כדי להסיר את החפץ הזה. כישלון בחיסול ממצאים ישפיע על איכות התמונה של השרירים והערכת יתר של תוכן IMAT במהלך חלק מיצוי השומנים כהכנה לקריאת OD.

בסך הכל, טכניקה זו היא פשוטה ומציעה מספר יתרונות על פני שיטות תקן זהב להדמיה וכימות של חדירת שומן שרירי השלד. טכניקות לא פולשניות, כגון CT, MRI ו- US, שנמצאות בשימוש נרחב בבני אדם ולעיתים במודלים של בעלי חיים, הן בעלות רזולוציה מרחבית מוגבלת ואינן מסוגלות להבחין בין טיפות שומנים לסיבי שריר. לפיכך, פיקסל או ווקסל בעוצמת אות ביניים מוקצה כ"שריר" או "שומן", בעוד שבפועל סביר להניח שמדובר בשילוב של מיופייבר ואדיפוציטים. בדרך כלל, חדירת שומן בשריר בעלי חיים מוערכת על ידי היסטולוגיה, לרוב על ידי ORO בהקפאת שרירים. עם זאת, זה מבוצע בדרך כלל רק בקטע מייצג אחד וקשה לכמת אותו בגלל פיזור שומנים על פני הסעיף. לעומת זאת, צביעת ORO של שריר שלם נטול תאים מספקת הערכה מקיפה של IMAT עם עלויות ומאמץ דומים למורפולוגיה שלמה. יתר על כן, בנוסף לשיפור ההדמיה, צביעת ORO של דה-צלולריזציה מאפשרת כימות של חדירת שומן על ידי מיצוי שומנים. לצלילה עמוקה יותר לתוך התכונות של חדירת שומן, כתם פלואורסצנטי, BODIPY, ניתן להשתמש בשילוב עם מיקרוסקופ קונפוקלי. זה מאפשר שחזור של טיפות שומנים IMAT בודדות כדי למפות את הנוף התלת-ממדי, דבר שאינו אפשרי עם היסטולוגיה אלא אם כן מנותחים חלקים לאורך השריר. בעוד מיקרוסקופ קונפוקלי אינו ציוד מעבדה סטנדרטי, סביר יותר שהוא יהיה נגיש בסביבה אוניברסיטאית או תעשייתית מאשר MRI או CT של בעלי חיים קטנים. יתר על כן, חלק גדול מתהליך זה יכול להיות אוטומטי, הפחתת עלות הזמן בהשוואה להיסטולוגיה רציפה. אופטימיזציה של ההגדרות במיקרוסקופ קונפוקלי היא שיקול נוסף לצביעת BODIPY. אלה ייחודיים לכל מיקרוסקופ. הערך הקריטי הוא עוצמת הלייזר, שחייבת להיות גבוהה מספיק כדי לזהות את טיפות השומנים על פני השטח המרוחקים של השריר וגם לא להרוות את האות מטיפות השומנים בצד הקרוב. בגלל זה, מוצע כי באמצעות צביעת BODIPY עם מיקרוסקופ קונפוקלי הוא המתאים ביותר על שרירים דקים יותר, כולל EDL או הסרעפת.

מספר מגבלות של גישה זו מצדיקות דיון. ראשית, בעוד שצפוי שלטכניקה זו ישימות רחבה מעבר למודלים של פציעה (קרדיוטוקסין וגליצרול) בעכברים המוצגים כאן, יישומים חדשים (למשל, מודל MDX) עשויים לדרוש אופטימיזציה, שכן גודל והרכב השריר (למשל, פיברוזיס) עשויים להשפיע על דה-צלולריזציה, הדורשת ריכוז SDS מוגבר או זמני דגירה. מודלים אחרים של מחלות עם שינוי במסת השריר ידרשו גם ניתוח של מדדים מוחלטים ומנורמלים (למסת שריר) של הסננה שומנית כדי לקבוע את הכמות האבסולוטית של שומנים או אחוז שומנים ביחס לנפח השריר כדי לספק מדד תוצאה משמעותי יותר. יתר על כן, טכניקה זו צפויה להיות ישימה באופן נרחב עבור מודלים גדולים יותר של בעלי חיים וביופסיות אנושיות, אבל זה עשוי לדרוש אופטימיזציה עבור כל יישום חדש. שנית, באסטרטגיה זו, השריר כולו חייב להיות מוקדש לבדיקה זו ולא ניתן להשתמש בו כדי להעריך תכונה פתולוגית אחרת. מחקרים שמטרתם להעריך שינויים אורכיים ב- IMAT מוגשים טוב יותר עם טכניקות הדמיה לא פולשניות ומחקרים שמטרתם העיקרית דורשת את השריר למטרות אחרות (היסטולוגיה, תגובת שרשרת פולימראז כמותית, כתם מערבי) מקבלים שירות טוב יותר על ידי הערכה היסטולוגית, שכן ניתן להקצות את שאר השריר הקפוא לבדיקות אחרות. עם זאת, בדיקה זו מתאימה היטב לזיווג עם בדיקות in vivo, כגון ריצת הליכון, או בדיקת כיווץ ex vivo , שכן אמצעים אלה יכולים להתבצע לפני decellularization⁴⁴. שלישית, למרות שהשימוש בכתם BODIPY עם מיקרוסקופ קונפוקלי מספק הדמיה וכימות ברזולוציה גבוהה של טיפות שומנים, הוא אינו יכול לזהות באופן חד משמעי טיפות שומנים כאדיפוציטים בודדים, כאשר קרום התא מוסר וחלבוני אדיפוציט אנדוגניים אובדים. אדיפוציטים מולטילוקולריים, המייצגים אדיפוציטים לא בשלים או פנוטיפ "חום/בז'", עשויים להיות מזוהים כטיפות שומנים מרובות. לבסוף, הפרוטוקול לא עובד טוב על שריר קפוא בעבר. מגבלות אלה הן כנראה העמוקות ביותר עבור ביופסיות אנושיות, שכן בעוד הביופסיה כולה יכולה להיות decellularized, ההתפלגות המרחבית של IMAT בביופסיה לא צפוי להיות מייצג יותר של השריר כולו מאשר פרוסה היסטולוגית. עם זאת, מכיוון שטכניקה זו אינה רגישה יחסית לתנאי טיפול בביופסיה לא קפואה (למשל, שעות על קרח ב- PBS), ניתן לחלק את הביופסיה מאוחר יותר לבדיקות שונות, כולל חלק לדצלולריזציה, אשר יספק רזולוציה טובה יותר של טיפות שומנים בודדות.

לסיכום, פותחה שיטה חדשנית לניתוח איכותי וכמותי של חדירת שומן בשרירי השלד על ידי צביעה והדמיה של השומנים השמורים של מבנים דה-תאיים. מתודולוגיה זו מציעה שיפורים לעומת גישות סטנדרטיות זהב, בכך שהיא מאפשרת הדמיה מקיפה של חדירת שומן תלת מימדית בתוך שריר וכימות מהיר וזול עם צביעת ORO. למדידות מפורטות יותר, כתם BODIPY מסיס שומנים שני מספק כימות מפורט יותר של מספר טיפות השומנים, נפחם ותבנית הפיזור, כפי שצולם במיקרוסקופ קונפוקלי. יחד, אמצעים אלה מספקים לחוקרים דרך למדוד במדויק את חדירת השומן בשרירי השלד ברמת טיפות השומנים הבודדות ללא דגימה או הדמיה לא פולשנית יקרה.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 µm Syringe Filter	Fisher Scientific	SLGP033RS
1 mL LuerLock Syringes	Fisher Scientific	14823434
12 mm Coverslips	Fisher Scientific	12545F
12 well plates	Fisher Scientific	08-772-29
24 well plates	Fisher Scientific	08-772-1H
2-Propanol (Isopropanol)	Sigma Aldrich	I9516	0.5 mg/mL stock solution can be stored at room temperature for 1 month.  Working solution must be made fresh.
37% Formaldehyde Solution	Sigma Aldrich	8187081000
40 µm Mesh Filter	Fisher Scientific	87711
6 well plates	Fisher Scientific	08-772-1B
96 well plates	Fisher Scientific	08-772-2C
BODIPY 493/503	Fisher Scientific	D-3922
C57BL/6J Mice	Jackson Laboratory	000664
Confocal Imaging Dish	VWR	734-2905
Confocal Microscope	Leica	TCS SPEII
Dissecting/stereo Microscope	Zeiss	4107009123001000
Dissection scissors	Fine Science Tools	14060-09
Dumont #5 forceps	Fine Science Tools	11254-20
Ethanol	Fisher Scientific	033361.K2
ImageJ	NIH
Matlab	Mathworks
Oil Red O Powder	Sigma Aldrich	O0625
Plate reader	Bio-tek	Synergy II
Rocker/Shaker	Reliable Scientific	55D
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)	Sigma Aldrich	L3771	1% Solution can be stored at room temperature for 1 month
Transfer pipettes	Fisher Scientific	137119D
Vannas spring scissors	Fine Science Tools	15000-00