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  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

A plataforma de imagem "The Lifespan Machine" automatiza a observação ao longo da vida de grandes populações. Mostramos os passos necessários para realizar ensaios de expectativa de vida, resistência ao estresse, patogênese e envelhecimento comportamental. A qualidade e abrangência dos dados permitem estudar intervenções no envelhecimento, apesar da presença de variações biológicas e ambientais.

Abstract

Animais geneticamente idênticos mantidos em um ambiente constante apresentam uma ampla distribuição de tempo de vida, refletindo um grande aspecto estocástico não genético ao envelhecimento conservado em todos os organismos estudados. Esse componente estocástico significa que, para entender o envelhecimento e identificar intervenções bem-sucedidas que prolonguem a expectativa de vida ou melhorem a saúde, os pesquisadores devem monitorar grandes populações de animais experimentais simultaneamente. A pontuação manual tradicional de óbitos limita o rendimento e a escala necessários para testes de hipóteses em larga escala, levando ao desenvolvimento de métodos automatizados para ensaios de vida útil de alto rendimento. A Lifespan Machine (LSM) é uma plataforma de imagem de alto rendimento que combina scanners de mesa modificados com processamento de imagem personalizado e software de validação de dados para o rastreamento de nematoides ao longo da vida. A plataforma constitui um grande avanço técnico ao gerar dados de vida útil altamente resolvidos temporalmente a partir de grandes populações de animais em uma escala sem precedentes e com uma precisão estatística e precisão igual aos ensaios manuais realizados por pesquisadores experientes. Recentemente, o MSL tem sido desenvolvido para quantificar as alterações comportamentais e morfológicas observadas durante o envelhecimento e relacioná-las com o tempo de vida. Aqui, descrevemos como planejar, executar e analisar um experimento de vida útil automatizado usando o LSM. Destacamos ainda as etapas críticas necessárias para o sucesso da coleta de dados comportamentais e curvas de sobrevida de alta qualidade.

Introduction

O envelhecimento é um processo complexo, multifacetado, caracterizado pelo declínio da função fisiológica de um organismo, que leva ao aumento do risco de doença e morte ao longo do tempo1. O tempo de vida, medido como o tempo desde o nascimento ou o início da idade adulta até a morte, fornece um resultado inequívoco do envelhecimento2 e uma proxy indireta, mas rigorosamente quantitativa, para medir a taxa relativa de envelhecimento entre as populações3. Os estudos de envelhecimento geralmente dependem de medidas precisas da expectativa de vida, semelhantes aos ensaios clínicos, para comparar os d....

Protocol

1. Requisitos de software e hardware

  1. Scanners de mesa: Em princípio, o LSM pode ser implementado usando uma variedade de dispositivos de imagem. Instruções detalhadas para modificações e focalização do scanner estão disponíveis em outra publicação13. O hardware LSM é mostrado na Figura Suplementar 1.
  2. Ferramentas de análise de dados: O software LSM tem três componentes de interação: um pacote de software de controle de scanner ba.......

Representative Results

A reprodutibilidade experimental em ensaios de vida útil é desafiadora e requer condições experimentais rigorosamente controladas e grandes populações para atingir resolução estatística suficiente 4,36. O LSM é exclusivamente adequado para o levantamento de grandes populações de animais em um ambiente constante com alta resolução temporal. Para demonstrar a capacidade do LSM, destacar as etapas cruciais da análise e ajudar os pesquisadores a priori.......

Discussion

Aqui, fornecemos um protocolo detalhado e acessível para realizar um experimento usando a versão mais recente da Lifespan Machine. Mostramos que o passo crítico para a obtenção de curvas de sobrevida bem resolvidas é a exclusão manual de objetos não-worm durante a aquisição pós-imagem. A anotação manual do tempo de óbito tem um pequeno efeito sobre a forma global das curvas de sobrevida, demonstrando que a estimativa do tempo de óbito totalmente automatizada é eficiente mesmo sem anotação manual (

Disclosures

Os autores declaram não ter interesses concorrentes.

Acknowledgements

Agradecemos a Julian Ceron e Jeremy Vicencio (IDIBELL Barcelona) pela produção do alelo rpb-2(cer135). Este projeto foi financiado pelo Conselho Europeu de Investigação (ERC) no âmbito do programa de investigação e inovação Horizonte 2020 da União Europeia (Acordo de Subvenção n.º 852201), pelo Ministério da Economia, Indústria e Competitividade (MEIC) espanhol pela parceria EMBL, pelo Centro de Excelência Severo Ochoa (CEX2020-001049-S, MCIN/AEI /10.13039/501100011033), pelo Programa CERCA / Generalitat de Catalunya, pelo prémio MEIC Excelencia BFU2017-88615-P, e um prêmio da Glenn Foundation for Medical Research.

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
1-Naphtaleneacetic  acid (Auxin)SigmaN0640Solubilize Auxin in 1M potassium hydroxide and add into molten agar
5-fluoro-2-deoxyuridine (FUDR)SigmaF050327.5 μg/mL of FUDR was used to eliminate progeny from populations on UV-inactivated bacteria
Glass cleanerKristal-MQB-KRISTAL-M125ml
Hydrophobic anti-fog glass treatmentRain-X Scheibenreiniger C. 059140
Rubber mattLocal crafstmanCut on a high-strength EPDM rubber sheet stock
Scanner glassLocal hardware supplier9" x 11.5" inch glass sheet
Scanner platesLife Sciences35100650 mm x 9 mm, polystyrene petri dish
USB Reference ThermometerUSB BrandoULIFE055500 For calibrating temperature of scanners

References

  1. Harman, D. The aging process: Major risk factor for disease and death. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88 (12), 5360-5363 (1991).
  2. Vaupel, J. W. Biodemography of human ageing. Natur....

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