تم دعم هذا العمل من خلال التمويل الأساسي لمجلس البحوث الطبية في المملكة المتحدة لمنحة وحدة جامعة MRC-UCL المرجع MC_U12266B ، ومنحة منصة MRC للخرف في المملكة المتحدة MR / M02492X / 1 ، وسرطان البنكرياس في المملكة المتحدة (مرجع المنحة 2018RIF_15) ، ومخطط دعم التسريع العلاجي UCL ، بدعم من MRC الثقة في المفهوم 2020 UCL MC / PC / 19054. تم الحصول على ترميز البلازميد ActinLC3dNGLUC (pMOWS-ActinLC3dNGLUC) من الدكتور روبن كيتلر (قسم الطب البشري ، كلية الطب في برلين).

ملاحظة: عملية الفحص موضحة في الشكل 1. راجع جدول المواد للحصول على التفاصيل المتعلقة بجميع المواد والكواشف والمعدات المستخدمة في هذا البروتوكول.
1. إنتاج الفيروسات القهقرية
ملاحظة: ترميز البلازميد ActinLC3dNGLUC هو pMOWS-ActinLC3dNGLUC<sup class="...

تحليل فحص عالي الإنتاجية لمثبطات الالتهام الذاتي للسيستين ببتيداز 4B

<ol>
	<li>Kocaturk, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+as+a+molecular+target+for+cancer+treatment.">Autophagy as a molecular target for cancer treatment.</a> European Journal of Pharmaceutical Sciences. 134, 116-137 (2019).</li><li>Fu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+ATG4+in+cancer+therapy.">Targeting ATG4 in cancer therapy.</a> Cancers. 11 (5), 649 (2019).</li><li>Towers, C. G., Thorburn, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+targeting+of+autophagy.">Therapeutic targeting of autophagy.</a> EBioMedicine. 14, 15-23 (2016).</li><li>Agrotis, A., Ketteler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+ATG4B+as+drug+target+for+treatment+of+solid+tumours-the+knowns+and+the+unknowns.">On ATG4B as drug target for treatment of solid tumours-the knowns and the unknowns.</a> Cells. 9 (1), 53 (2019).</li><li>Levy, J. M. M., Towers, C. G., Thorburn, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+autophagy+in+cancer.">Targeting autophagy in cancer.</a> Nature Reviews Cancer. 17 (9), 528-542 (2017).</li><li>Kimmelman, A. C., White, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+and+tumor+metabolism.">Autophagy and tumor metabolism.</a> Cell Metabolism. 25 (5), 1037-1043 (2017).</li><li>Tran, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Context-dependent+role+of+ATG4B+as+target+for+autophagy+inhibition+in+prostate+cancer+therapy.">Context-dependent role of ATG4B as target for autophagy inhibition in prostate cancer therapy.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 441 (4), 726-731 (2013).</li><li>Pengo, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+kinases+and+phosphatases+that+regulate+ATG4B+activity+by+siRNA+and+small+molecule+screening+in+cells.">Identification of kinases and phosphatases that regulate ATG4B activity by siRNA and small molecule screening in cells.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 6, 148 (2018).</li><li>Kauffman, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delipidation+of+mammalian+Atg8-family+proteins+by+each+of+the+four+ATG4+proteases.">Delipidation of mammalian Atg8-family proteins by each of the four ATG4 proteases.</a> Autophagy. 14 (6), 992-1010 (2018).</li><li>Tanida, I., Sou, Y. -. S., Minematsu-Ikeguchi, N., Ueno, T., Kominami, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atg8L/Apg8L+is+the+fourth+mammalian+modifier+of+mammalian+Atg8+conjugation+mediated+by+human+Atg4B,+Atg7+and+Atg3.">Atg8L/Apg8L is the fourth mammalian modifier of mammalian Atg8 conjugation mediated by human Atg4B, Atg7 and Atg3.</a> The FEBS Journal. 273 (11), 2553-2562 (2006).</li><li>Agrotis, A., Pengo, N., Burden, J. J., Ketteler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redundancy+of+human+ATG4+protease+isoforms+in+autophagy+and+LC3/GABARAP+processing+revealed+in+cells.">Redundancy of human ATG4 protease isoforms in autophagy and LC3/GABARAP processing revealed in cells.</a> Autophagy. 15 (6), 976-997 (2019).</li><li>Nguyen, T. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atg8+family+LC3/GABARAP+proteins+are+crucial+for+autophagosome-lysosome+fusion+but+not+autophagosome+formation+during+PINK1/Parkin+mitophagy+and+starvation.">Atg8 family LC3/GABARAP proteins are crucial for autophagosome-lysosome fusion but not autophagosome formation during PINK1/Parkin mitophagy and starvation.</a> The Journal of Cell Biology. 215 (6), 857-874 (2016).</li><li>Ketteler, R., Tooze, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATG4:+More+than+a+protease.">ATG4: More than a protease.</a> Trends in Cell Biology. 31 (7), 515-516 (2021).</li><li>Zhang, L., Li, J., Ouyang, L., Liu, B., Cheng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unraveling+the+roles+of+Atg4+proteases+from+autophagy+modulation+to+targeted+cancer+therapy.">Unraveling the roles of Atg4 proteases from autophagy modulation to targeted cancer therapy.</a> Cancer Letters. 373 (1), 19-26 (2016).</li><li>Fern&#225;ndez, &. #. 1. 9. 3. ;. F., L&#243;pez-Ot&#237;n, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+functional+and+pathologic+relevance+of+autophagy+proteases.">The functional and pathologic relevance of autophagy proteases.</a> The Journal of Clinical Investigation. 125 (1), 33-41 (2015).</li><li>Maruyama, T., Noda, N. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy-regulating+protease+Atg4:+structure,+function,+regulation+and+inhibition.">Autophagy-regulating protease Atg4: structure, function, regulation and inhibition.</a> The Journal of Antibiotics. 71 (1), 72-78 (2017).</li><li>Ketteler, R., Seed, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitation+of+autophagy+by+luciferase+release+assay.">Quantitation of autophagy by luciferase release assay.</a> Autophagy. 4 (6), 801-806 (2008).</li><li>Ketteler, R., Sun, Z., Kovacs, K. F., He, W. -. W., Seed, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pathway+sensor+for+genome-wide+screens+of+intracellular+proteolytic+cleavage.">A pathway sensor for genome-wide screens of intracellular proteolytic cleavage.</a> Genome Biology. 9 (4), 64 (2008).</li><li>Luft, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+Gaussia+luciferase+in+bicistronic+and+non-conventional+secretion+reporter+constructs.">Application of Gaussia luciferase in bicistronic and non-conventional secretion reporter constructs.</a> BMC Biochemistry. 15, 14 (2014).</li><li>Ketteler, R., Glaser, S., Sandra, O., Martens, U. M., Klingm&#252;ller, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+transgene+expression+in+primitive+hematopoietic+progenitor+cells+and+embryonic+stem+cells+efficiently+transduced+by+optimized+retroviral+hybrid+vectors.">Enhanced transgene expression in primitive hematopoietic progenitor cells and embryonic stem cells efficiently transduced by optimized retroviral hybrid vectors.</a> Gene Therapy. 9 (8), 477-487 (2002).</li></ol>

يصف هذا البروتوكول مقايسة جين المراسل القائمة على الخلية لتحديد مثبطات ATG4B. يعتمد تحديد النتائج الأولية على نشاط لوسيفيراز عند معالجة الخلايا التي تعبر عن إطار القراءة المفتوح الكامل الطول ل LC3B بين β-actin و dNGLUC. بعض مزايا هذا الفحص هي أنه حساس وكمي للغاية وغير جراحي ، حيث يمكنه اكتشاف dNGLUC دو?...

الالتهام الذاتي هو عملية أيضية محفوظة تسمح للخلايا بالحفاظ على التوازن داخل الخلايا والاستجابة للإجهاد عن طريق تدهور المحتويات الخلوية القديمة أو المعيبة أو غير الضرورية عبر الجسيمات الحالة1،2،3. في ظل بعض الظروف الفيزيولوجية المرضية ، تعمل هذه العملية كاستجابة خلوية حاسمة للحرمان من المغذيات والأكسجين ، مما يؤدي إلى إعادة تدوير العناصر الغذائية والدهون ، مما يسمح للخلايا بالتكيف مع احتياجاتها الأيضية2،3،4. كما تم تحديد الالتهام الذاتي على أنه استجابة إجهاد خلوي تتعلق بالعديد من الأمراض ، مثل الاضطرابات التنكسية العصبية ، وعدوى مسببات الأمراض ، وأنواع مختلفة من السرطان. وظيفة الالتهام الذاتي في السرطان معقدة وتعتمد على نوع الورم ومرحلته وحالته. يمكن أن يثبط تكوين الورم من خلال تدهور الالتهام الذاتي للخلايا التالفة ، ولكن يمكنه أيضا تعزيز بقاء الأورام المتقدمة عن طريق تحسين بقاء الخلايا أثناء الظروف العصيبة ، مثل نقص الأكسجة والحرمان من المغذيات والضرر السام للخلايا2،4،5،6.
أظهرت العديد من الدراسات أن تثبيط الالتهام الذاتي يوفر فائدة كاستراتيجية مضادة للسرطان. وبالتالي ، فإن تثبيط الخطوات الحرجة ، مثل تكوين البلعمة الذاتية أو اندماجها مع الليزوزوم ، يمكن أن يكون وسيلة فعالة للسيطرة على السرطان2،4،5،6. أظهرت الأدلة المتزايدة أن ATG4B متورط في بعض الحالات المرضية ، وقد اكتسب الانتباه كهدف محتمل مضاد للسرطان2،3،4. على سبيل المثال ، لوحظ أن خلايا سرطان القولون والمستقيم وخلايا سرطان الثدي الإيجابية لمستقبلات عامل نمو البشرة البشري 2 (HER2) لديها مستويات تعبير ATG4B أعلى بكثير من الخلايا الطبيعية المجاورة 2,4. في خلايا سرطان البروستاتا ، أدى تثبيط ATG4B إلى قابلية خاصة بخط الخلية للعلاج الكيميائي والعلاج الإشعاعي7. في الآونة الأخيرة ، ظهرت أدلة قوية على أن سرطان البنكرياس الغدي القنوي (PDAC) عرضة بشكل خاص لتثبيط ATG4B. على سبيل المثال ، في نموذج فأر معدل وراثيا ، تبين أن الفقدان المتقطع لوظيفة ATG4B يقلل من نمو ورم PDAC ويزيد من البقاء على قيد الحياة 3,4. بشكل عام ، يتم التعبير عن ATG4B بشكل مفرط في بعض أنواع السرطان ، ويرتبط بتطور الورم ، ويرتبط بمقاومة علاج السرطان2،4،8.
تحتوي بروتياز السيستين ATG4 في الثدييات على أربعة أفراد من العائلة ، ATG4A-ATG4D. تظهر هذه البروتينات بعض الانتقائية المستهدفة تجاه عائلة البروتيناتLC3 / GABARAP (ATG8) 9،10،11 وقد يكون لها وظائف إضافية غير مرتبطة بنشاط البروتياز12،13. علاوة على ذلك ، يعمل ATG4 في تنظيم نوع جديد من التعديل بعد الترجمة ، ATG8-ylation للبروتينات11,12. في حين أن ATG4B وركيزته الرئيسية LC3B هي الأكثر دراسة على نطاق واسع ، تظهر صورة تشير إلى دور معقد لكل فرد من أفراد الفصيلة الفرعية في تنظيم عمليات الالتهام الذاتي وغير الالتهام الذاتي. يتم تأكيد ذلك أيضا من خلال شبكة معقدة من التعديلات اللاحقة للترجمة التي تنظم نشاط ATG4B عن طريق الفسفرة ، والأستلة ، والجليكوزيل ، والنيتروسيل9،10،11،12،13.
تم نشر العديد من مثبطات ATG4B المعروفة2،4،14،15. في حين أن هذه مناسبة كأدوات بحثية ، إلا أن ملفها الدوائي أو انتقائيتها أو قوتها قد منعتها من التطوير كمرشحين قبل سريريين 4,16. بشكل عام ، هناك حاجة ملحة لتحديد مركبات أكثر فعالية وانتقائية. في كثير من الأحيان ، تكون المركبات مثبطات كيميائية حيوية جيدة لوظيفة البروتين ، ومع ذلك فإن فعاليتها في المقايسات القائمة على الخلايا ضعيفة. هناك العديد من المقايسات لمراقبة نشاط ATG4B ، بما في ذلك الطرق الكيميائية الحيوية والمقايسات الخلوية4. لقد طورنا سابقا مقايسة بسيطة قائمة على التلألؤ وعالية الإنتاجية لمراقبة نشاط ATG4B في الخلايا 8,17. يستخدم هذا الفحص بروتين لوسيفيراز من Gaussia princeps (GLUC) مستقر ونشط في الوسط خارج الخلية ويمكن إطلاقه بشكل مستحث من الخلايا استجابة لنشاط التحلل البروتيني ATG4B18,19.
في بناء هذا المراسل ، يرتبط dNGLUC بالهيكل الخلوي للأكتين للخلايا. يمكن إدخال رابط خاص بالبروتياز بين مرساة β-actin و dNGLUC ، مما يجعل الإفراز يعتمد على انقسام الرابط. استخدمنا إطار القراءة المفتوح الكامل الطول ل LC3B بين β-actin و dNGLUC ، حتى نتمكن من مراقبة انقسام LC3B17،18،19. على الرغم من أن آلية إفراز dNGLUC غير مفهومة بشكل جيد ، إلا أنها محددة لمراقبة نشاط ATG4B ، ولا تعتمد على الالتهام الذاتي الكلي كما يحدث في خلايا خروج المغلوب ATG5 ، ويتم بوساطة آليات غير تقليدية لا تتطلب ببتيد إشارة كلاسيكي4،18،19. لقد استخدمنا هذا المراسل بنجاح لفحص الجزيئات الصغيرة ومكتبات siRNA ، وحددنا منظمات جديدة لنشاط ATG4B ، مثل كينازات بروتين Akt8. تصف هذه الورقة بروتوكولا مفصلا لاستخدام مراسل luciferase هذا بتنسيق فحص شبه آلي عالي الإنتاجية.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>50 &#181;L Disposable Tips - Non-filtered, Pure, Nested 8 Stack (Passive Stack)</td>
			<td>Tecan</td>
			<td>30038609</td>
			<td>Disposable 96-tip rack</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioTek MultiFlo</td>
			<td>BioTek</td>
			<td></td>
			<td>bulk dispenser</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coelenterazine</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-205904</td>
			<td>substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Columbus Image analysis software</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>Version 2.9.1</td>
			<td>image analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS (1x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Echo Qualified 384-Well Polypropylene Microplate, Clear, Non-sterile</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>001-14555</td>
			<td>384PP plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EnVision II</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td></td>
			<td>luminescence plate reader</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Express pick Library (96-well)-L3600-Z369949-100&#181;L</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>L3600</td>
			<td>Selleckchem</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FMK9A</td>
			<td>MedChemExpress</td>
			<td>HY-100522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Greiner FLUOTRAC 200 384 well plates</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>781076</td>
			<td>solid-black 384-well plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Harmony Imaging software</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>Version 5.1</td>
			<td>imaging software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate - 10 mg/mL Solution in Water</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>H3570</td>
			<td>Hoechst 33342</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labcyte Echo 550 series with Echo Cherry Pick software</td>
			<td>Labcyte/Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td>nanoscale acoustic liquid dispenser</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milli-Q water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>deionized water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opera Phenix High-Content Screening System</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td></td>
			<td>automated microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde solution 4% in PBS</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-281692</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PhenoPlate 384-well, black, optically clear flat-bottom, tissue-culture treated, lids</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>6057300</td>
			<td>CellCarrier-384 Ultra PN</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMOWS-ActinLC3dNGLUC</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Obtained from Dr. Robin Ketteler (Department of Human Medicine, Medical School Berlin)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybrene Infection / Transfection Reagent</td>
			<td>Merck</td>
			<td>TR-1003-G</td>
			<td>polybrene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puromycin dihydrochloride, 98%, Thermo Scientific Chemicals</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>J61278.ME</td>
			<td>Puromycin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tecan Freedom EVO 200 robot</td>
			<td>Tecan</td>
			<td></td>
			<td>liquid handling robotic platform</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent Roche</td>
			<td>Merck</td>
			<td>6366244001</td>
			<td>DNA transfection reagent</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cell-based drug screening for inhibitors of autophagy related 4b cysteine peptidase

أظهرت أدلة متزايدة أن التدفق الذاتي العالي مرتبط بتطور الورم ومقاومة علاج السرطان. يعد فحص بروتينات الالتهام الذاتي الفردية شرطا أساسيا للاستراتيجيات العلاجية التي تستهدف هذا المسار. ثبت أن تثبيط الأنزيم البروتيني ATG4B يزيد من البقاء على قيد الحياة بشكل عام ، مما يشير إلى أن ATG4B يمكن أن يكون هدفا دوائيا محتملا لعلاج السرطان. طور مختبرنا مقايسة انتقائية قائمة على اللوسيفيراز لمراقبة نشاط ATG4B في الخلايا. بالنسبة لهذا الفحص ، يتم وضع علامة على ركيزة ATG4B ، LC3B ، في المحطة C مع لوسيفيراز مفرز من مجدافيات الأرجل البحرية Gaussia princeps (GLUC). يرتبط هذا المراسل بالهيكل الخلوي للأكتين ، وبالتالي يبقيه في سيتوبلازم الخلايا عند فتحه. يؤدي الانقسام بوساطة ATG4B إلى إطلاق GLUC عن طريق إفراز غير تقليدي ، والذي يمكن مراقبته بعد ذلك عن طريق حصاد المواد الطافية من زراعة الخلايا كارتباط لنشاط ATG4B الخلوي. تقدم هذه الورقة تكييف هذا الفحص القائم على لوسيفيراز مع الفحص الآلي عالي الإنتاجية. نحن نصف سير العمل والتحسين للتحليل المثالي عالي الإنتاجية لنشاط ATG4B الخلوي.

Autophagy is a conserved metabolic process that allows cells to keep intracellular homeostasis and respond to stress by degrading aged, defective, or unnecessary cellular contents via the lysosomes1,2,3. Under some pathophysiologic conditions, this process acts as a crucial cellular response to nutrient and oxygen deprivation, resulting in recycled nutrients and lipids, allowing the cells to adapt to their metabolic needs2,3,4. Autophagy has also been identified as a cellular stress response related to several diseases, such as neurodegenerative disorders, pathogen infection, and various types of cancer. The function of autophagy in cancer is complex and dependent on the type, stage, and status of the tumor. It can suppress tumorigenesis through autophagic degradation of damaged cells, but can also promote the survival of advanced tumors by improving cell survival during stressful conditions, such as hypoxia, nutrient deprivation, and cytotoxic damage2,4,5,6.
Several studies have shown that autophagy inhibition provides a benefit as an anticancer strategy. Thus, the inhibition of critical steps, such as autophagosome formation or its fusion with the lysosome, could be an effective method for cancer control2,4,5,6. Growing evidence has shown that ATG4B is involved in certain pathological conditions, and it has gained attention as a potential anticancer target2,3,4. For instance, it was observed that colorectal cancer cells and human epidermal growth factor receptor 2 (HER2)-positive breast cancer cells had significantly higher ATG4B expression levels than adjacent normal cells2,4. In prostate cancer cells, inhibition of ATG4B resulted in a cell line-specific susceptibility to chemotherapy and radiotherapy7. Recently, strong evidence has emerged that pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) is particularly vulnerable to ATG4B inhibition. For instance, in a genetically engineered mouse model, it was shown that intermittent loss of ATG4B function reduces PDAC tumor growth and increases survival3,4. Overall, ATG4B is highly overexpressed in some cancer types, is related to the progression of tumor, and is linked to cancer therapy resistance2,4,8.
The ATG4 cysteine proteases in mammals have four family members, ATG4A-ATG4D. These proteins exhibit some target selectivity toward the LC3/GABARAP (ATG8) family of proteins9,10,11 and may have additional functions not linked to their protease activity12,13. Furthermore, ATG4 functions in regulating a novel type of post-translational modification, the ATG8-ylation of proteins11,12. While ATG4B and its main substrate LC3B are the most widely studied, a picture is emerging that suggests a complex role for each subfamily member in the regulation of autophagic and non-autophagic processes. This is further corroborated by a complex network of post-translational modifications that regulate ATG4B activity via phosphorylation, acetylation, glycosylation, and nitrosylation9,10,11,12,13.
Several known ATG4B inhibitors have been published2,4,14,15. While these are suitable as research tools, their pharmacodynamic profile, selectivity, or potency have yet precluded them from development as preclinical candidates4,16. Overall, there is an urgent need to identify more potent and selective compounds. Often, the compounds are good biochemical inhibitors of protein function, yet their efficacy in cell-based assays is poor. There are multiple assays to monitor ATG4B activity, including biochemical methods and cell-based assays4. We have previously developed a simple, luminescence-based, high-throughput assay for monitoring ATG4B activity in cells8,17. This assay utilizes a luciferase protein from Gaussia princeps (GLUC) that is stable and active in the extracellular milieu and can be inducibly released from cells in response to ATG4B proteolytic activity18,19.
In this reporter construct, dNGLUC is linked to the actin cytoskeleton of cells. A protease-specific linker can be introduced between the &#946;-actin anchor and dNGLUC, turning the secretion dependent on cleavage of the linker. We used the full-length open reading frame of LC3B between &#946;-actin and dNGLUC, to be able to monitor LC3B cleavage17,18,19. Although the secretion mechanism of dNGLUC is poorly understood, it is specific for monitoring ATG4B activity, does not depend on overall autophagy as it occurs in ATG5 knockout cells, and is mediated by non-conventional mechanisms that do not require a classical signal peptide4,18,19. We have successfully used this reporter to screen small molecules and siRNA libraries, and have identified novel regulators of ATG4B activity, such as the Akt protein kinases8. This paper describes a detailed protocol for the use of this luciferase reporter in a semi-automated, high-throughput screening format.

تسليط الضوء على المؤلف: اختبار انتقائي قائم على اللوسيفيراز لمراقبة نشاط ATG4B 27 في الخلايا 

فحص الأدوية القائمة على الخلايا لمثبطات الالتهام الذاتي ذات الصلة 4B السيستين الببتيداز

The main aim of research in my lab is to understand the regulation of autophagy and in particular of the ATG4 cysteine protean and use this knowledge to develop small molecule inhibitors that target this pathway in particular for diseases such as pancreatic cancer. We use high content, high throughput screening technologies to identify drug targets as well as drug candidates and we focus on the ATG4 cysteine protease family because we think it's a very good drug target for various forms of cancer. We have been studying the ATG4 family members for quite some time now.We made significant discoveries into dysfunction of this protein family and cells. We've also identified novel post-translational mechanisms of regulation of the ATG4 family members and currently we are developing small molecule inhibitors and also activators of the ATG4 families for diseases such as cancer and neuro degeneration. There are not many assays to monitor ATG4 protease activity in cells.So we were one of the first to develop a luciferase based assay to monitor this activity. And our assay is quite unusual because it uses secreted, let's say phrase, therefore we don't need to license the cells and we can adapt this protocol easily to high throughput screening methods and lab automation. We have focused on the ATG4 B protein protease for quite some time now.We have generated knockout cell lines of the ATG4 family members. We have identified novel post-translational regulation mechanisms of ATG4, and ultimately we have also identified several novel small molecule compounds that could inhibit and even activate the ATG4 B protease. In the future, we'd like to continue our work on the ATG4 family members.We think that's quite a lot that is currently unknown and still remains to be uncovered. For example, how these proteins regulate autophagy in neurons is currently completely not understood. We'd also like to focus our work on validation of these small molecule compounds that we've identified and potentially to use activators in neurodegenerative diseases.

في منشور سابق8 ، استخدمنا هذا الاختبار بنجاح لفحص مكتبات الجزيئات الصغيرة و siRNA وحددنا منظمات جديدة ل ATG4B. هنا ، نصف البروتوكول والنتائج التمثيلية لمراسل luciferase هذا بتنسيق فحص شبه آلي عالي الإنتاجية. يوضح الشكل 8 مثالا على تحليل البيانات الخام لكل من نوى الخلية و...

Watch this Scientific Journal Video about A Selective Luciferase-Based Assay for Monitoring ATG4B 27 Activity in Cells at JoVE.com

هنا ، نصف بروتوكولا مفصلا لاستخدام مقايسة المراسل المستندة إلى luciferase في تنسيق فحص شبه آلي عالي الإنتاجية.

Growing evidence has shown that high autophagic flux is related to tumor progression and cancer therapy resistance. Assaying individual autophagy proteins ...

الهدف الرئيسي من البحث في مختبري هو فهم تنظيم الالتهام الذاتي وعلى وجه الخصوص بروتين السيستين ATG4 واستخدام هذه المعرفة لتطوير مثبطات الجزيئات الصغيرة التي تستهدف هذا المسار بشكل خاص لأمراض مثل سرطان البنكرياس. نحن نستخدم تقنيات فحص عالية المحتوى وعالية الإنتاجية لتحديد أهداف الأدوية وكذلك الأدوية المرشحة ونركز على عائلة البروتياز السيستين ATG4 لأننا نعتقد أنه هدف دوائي جيد جدا لأشكال مختلفة من السرطان. لقد كنا ندرس أفراد عائلة ATG4 لبعض الوقت الآن.لقد حققنا اكتشافات مهمة في خلل وظيفي في عائلة البروتين والخلايا هذه. لقد حددنا أيضا آليات جديدة بعد الترجمة لتنظيم أفراد عائلة ATG4 ونقوم حاليا بتطوير مثبطات الجزيئات الصغيرة وأيضا منشطات عائلات ATG4 لأمراض مثل السرطان والتنكس العصبي. لا يوجد الكثير من المقايسات لمراقبة نشاط الأنزيم البروتيني ATG4 في الخلايا.لذلك كنا من أوائل من طوروا مقايسة قائمة على لوسيفيراز لمراقبة هذا النشاط. ومقايستنا غير عادية تماما لأنها تستخدم عبارة مفرزة ، دعنا نقول ، لذلك لا نحتاج إلى ترخيص الخلايا ويمكننا تكييف هذا البروتوكول بسهولة مع طرق الفحص عالية الإنتاجية وأتمتة المختبرات. لقد ركزنا على بروتياز البروتين ATG4 B لبعض الوقت الآن.لقد أنشأنا خطوط خلايا خروج المغلوب لأفراد عائلة ATG4. لقد حددنا آليات تنظيم جديدة بعد الترجمة ل ATG4 ، وفي النهاية حددنا أيضا العديد من مركبات الجزيئات الصغيرة الجديدة التي يمكن أن تمنع وحتى تنشط بروتياز ATG4 B. في المستقبل ، نود مواصلة عملنا على أفراد عائلة ATG4.نعتقد أن هذا كثير جدا غير معروف حاليا ولا يزال يتعين الكشف عنه. على سبيل المثال ، كيف تنظم هذه البروتينات الالتهام الذاتي في الخلايا العصبية غير مفهومة تماما حاليا. نود أيضا أن نركز عملنا على التحقق من صحة هذه المركبات الجزيئية الصغيرة التي حددناها وربما استخدام المنشطات في الأمراض التنكسية العصبية.

فحص الأدوية القائمة على الخلايا لمثبطات الالتهام الذاتي ذات الصلة 4B السيستين الببتيداز

Abstract