Celgebaseerde geneesmiddelenscreening op remmers van autofagie-gerelateerde 4B-cysteïnepeptidase

Er zijn steeds meer aanwijzingen dat een hoge autofagische flux verband houdt met tumorprogressie en resistentie tegen kankertherapie. Het testen van individuele autofagie-eiwitten is een voorwaarde voor therapeutische strategieën die zich op deze route richten. Het is aangetoond dat remming van de autofagieprotease ATG4B de algehele overleving verhoogt, wat suggereert dat ATG4B een potentieel doelwit voor kankertherapie zou kunnen zijn. Ons laboratorium heeft een selectieve test op basis van luciferase ontwikkeld voor het monitoren van ATG4B-activiteit in cellen. Voor deze test wordt het substraat van ATG4B, LC3B, aan de C-terminus gelabeld met een secretabel luciferase van het mariene roeipootkreeftje Gaussia princeps (GLUC). Deze reporter is gekoppeld aan het actine-cytoskelet, waardoor het in het cytoplasma van cellen blijft wanneer het wordt gelost. ATG4B-gemedieerde splitsing resulteert in de afgifte van GLUC door niet-conventionele secretie, die vervolgens kan worden gecontroleerd door supernatanten uit celkweek te oogsten als een correlaat van cellulaire ATG4B-activiteit. Dit artikel presenteert de aanpassing van deze op luciferase gebaseerde test aan geautomatiseerde high-throughput screening. We beschrijven de workflow en optimalisatie voor een voorbeeldige high-throughput analyse van cellulaire ATG4B-activiteit.