בדיקת תרופות מבוססות תאים למעכבי אוטופגיה הקשורים לפפטידאז ציסטאין 4B

Summary

כאן, אנו מתארים פרוטוקול מפורט לשימוש בבדיקת כתב מבוססת לוציפראז בפורמט סינון חצי אוטומטי, בתפוקה גבוהה.

Abstract

עדויות הולכות וגדלות הראו כי שטף אוטופגי גבוה קשור להתקדמות הגידול ולעמידות לטיפול בסרטן. בדיקת חלבוני אוטופגיה בודדים היא תנאי מוקדם לאסטרטגיות טיפוליות המכוונות למסלול זה. עיכוב של פרוטאז אוטופגיה ATG4B הוכח כמגביר את ההישרדות הכוללת, דבר המצביע על כך ש- ATG4B יכול להיות מטרה פוטנציאלית לטיפול בסרטן. המעבדה שלנו פיתחה בדיקה סלקטיבית מבוססת לוציפראז לניטור פעילות ATG4B בתאים. עבור בדיקה זו, המצע של ATG4B, LC3B, מתויג במסוף C עם לוציפראז סודי מהקופפוד הימי Gaussia princeps (GLUC). כתב זה מקושר לשלד הציטופלזמה של האקטין ובכך שומר אותו בציטופלסמה של תאים כאשר הוא משוחרר. מחשוף בתיווך ATG4B גורם לשחרור GLUC על ידי הפרשה לא קונבנציונלית, אשר לאחר מכן ניתן לנטר על ידי קצירת supernatants מתרבית תאים כמתאם של פעילות ATG4B תאית. מאמר זה מציג את ההתאמה של בדיקה מבוססת לוציפראז זו לסינון אוטומטי בתפוקה גבוהה. אנו מתארים את זרימת העבודה והאופטימיזציה לניתוח מופתי של תפוקה גבוהה של פעילות ATG4B סלולרית.

Introduction

אוטופגיה היא תהליך מטבולי שמור המאפשר לתאים לשמור על הומאוסטזיס תוך-תאי ולהגיב ללחץ על ידי פירוק תוכן תאי מיושן, פגום או מיותר באמצעות ליזוזומים ^1,2,3. בתנאים פתופיזיולוגיים מסוימים, תהליך זה פועל כתגובה תאית חיונית למחסור בחומרים מזינים ובחמצן, וכתוצאה מכך חומרים מזינים ושומנים ממוחזרים, המאפשרים לתאים להסתגל לצרכים המטבוליים שלהם ^2,3,4. אוטופגיה זוהתה גם כתגובת עקה תאית הקשורה למספר מחלות, כגון הפרעות נוירודגנרטיביות, זיהום פתוגן וסוגים שונים של סרטן.....

Protocol

הערה: תהליך הבדיקה מתואר באיור 1. עיין בטבלת החומרים לקבלת פרטים הקשורים לכל החומרים, הריאגנטים והציוד המשמשים בפרוטוקול זה.

1. ייצור רטרווירוס

הערה: הפלסמיד המקודד את ActinLC3dNGLUC הוא pMOWS-ActinLC3dNGLUC²⁰. השתמש במספר נמוך של .......

Discussion

פרוטוקול זה מתאר בדיקת גן דיווח מבוססת תאים לזיהוי מעכבי ATG4B. זיהוי פגיעות ראשוניות מבוסס על פעילות לוציפראז בטיפול בתאים המבטאים את מסגרת הקריאה הפתוחה באורך מלא של LC3B בין β-אקטין ל-dNGLUC. כמה יתרונות של בדיקה זו הם שזה רגיש, כמותי מאוד, ולא פולשני, כפי שהוא יכול לזהות dNGLUC מבלי לשקר את התאים. מ.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
50 µL Disposable Tips - Non-filtered, Pure, Nested 8 Stack (Passive Stack)	Tecan	30038609	Disposable 96-tip rack
BioTek MultiFlo	BioTek		bulk dispenser
Coelenterazine	Santa Cruz Biotechnology	sc-205904	substrate
Columbus Image analysis software	Perkin Elmer	Version 2.9.1	image analysis software
DPBS (1x)	Gibco	14190-144
Echo Qualified 384-Well Polypropylene Microplate, Clear, Non-sterile	Beckman Coulter	001-14555	384PP plate
EnVision II	Perkin Elmer		luminescence plate reader
Express pick Library (96-well)-L3600-Z369949-100µL	Selleckchem	L3600	Selleckchem
FMK9A	MedChemExpress	HY-100522
Greiner FLUOTRAC 200 384 well plates	Greiner Bio-One	781076	solid-black 384-well plates
Harmony Imaging software	Perkin Elmer	Version 5.1	imaging software
Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate - 10 mg/mL Solution in Water	ThermoFisher	H3570	Hoechst 33342
Labcyte Echo 550 series with Echo Cherry Pick software	Labcyte/Beckman Coulter		nanoscale acoustic liquid dispenser
Milli-Q water			deionized water
Opera Phenix High-Content Screening System	Perkin Elmer		automated microscope
Paraformaldehyde solution 4% in PBS	Santa Cruz Biotechnology	sc-281692
PhenoPlate 384-well, black, optically clear flat-bottom, tissue-culture treated, lids	Perkin Elmer	6057300	CellCarrier-384 Ultra PN
pMOWS-ActinLC3dNGLUC			Obtained from Dr. Robin Ketteler (Department of Human Medicine, Medical School Berlin)
Polybrene Infection / Transfection Reagent	Merck	TR-1003-G	polybrene
Puromycin dihydrochloride, 98%, Thermo Scientific Chemicals	ThermoFisher	J61278.ME	Puromycin
Tecan Freedom EVO 200 robot	Tecan		liquid handling robotic platform
X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent Roche	Merck	6366244001	DNA transfection reagent